一種骨髓單個核細胞新型示蹤方法
——細胞膜染料DiD標記法

王 芬 謝成穎 曲 瑩 魏 丹 索元震吳夢瑤 袁 燕 魏勛斌 陳 彤△

(1復旦大學附屬華山醫(yī)院血液科 上海 200040; 2上海交通大學生物醫(yī)學工程學院Med-X研究院 上海 200030)

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一種骨髓單個核細胞新型示蹤方法
——細胞膜染料DiD標記法

王 芬1謝成穎2曲 瑩1魏 丹2索元震2吳夢瑤1袁 燕1魏勛斌2陳 彤1△

(1復旦大學附屬華山醫(yī)院血液科 上海 200040;2上海交通大學生物醫(yī)學工程學院Med-X研究院 上海 200030)

目的 檢測細胞膜染料DiD對骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BM-MNC)的染色效率和造血功能的影響,并用DiD示蹤BM-MNC活體直觀觀察DiD標記的BM-MNC在小鼠顱骨骨髓內的順利歸巢。 方法 體外流式細胞術分析方法和激光共聚焦掃描顯微鏡成像方法檢測BM-MNC的DiD染色效率;CCK-8細胞活性-增殖實驗和造血集落形成實驗,檢測DiD染料對BM-MNC的造血功能的影響;單/雙光子共聚焦顯微鏡下活體直觀觀察DiD標記的BM-MNC在小鼠顱骨骨髓內的歸巢。結果 BM-MNC的DiD染色效率高達90%以上,且DiD對BM-MNC的細胞活性-增殖和造血能力均無明顯的毒性影響(P>0.05);單/雙光子共聚焦顯微鏡下,在活體小鼠顱骨骨髓內可直觀觀察到DiD標記的BM-MNC的順利歸巢。結論 細胞膜染料DiD對BM-MNC的染色效率高、均一,無明顯細胞毒性,熒光不易被淬滅,且受機體自身組織的背景干擾少,用于活體示蹤時DiD標記的BM-MNC可順利歸巢到骨髓。

細胞膜染料; 骨髓單個核細胞; 造血干細胞移植

骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cell ,BM-MNC)作為造血干細胞(hematopoietic stem cell ,HSC)的主要來源之一,具有多種臨床治療潛能,且短時間易獲取、不需要體外培養(yǎng),目前已成功應用于臨床上的造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation ,HSCT)[1-4]。BM-MNC的活體示蹤研究,對臨床調控HSCT后的HSC歸巢及拓寬骨髓HSC在其他再生治療領域的應用具有重要意義。 在以往的BM-MNC示蹤研究中[5-8],BM-MNC的示蹤方法主要有放射性核素標記探針如111Indium和technetium-99 (99Tc)、報告基因標記如PAI-1、細胞膜染料標記如CFSE和PKH等。然而,這些體內示蹤方法都存在一定的缺點和局限性。放射性核素的半衰期短,不宜用于長時間觀察,且具有細胞毒性[9];報告基因標記需要長期穩(wěn)定轉染[10]。目前所用到的CFSE和PKH所發(fā)出的熒光波段和機體組織的自身熒光波段有所重疊(均在510 nm左右),使得移植細胞的熒光易受自身熒光的背景干擾[11]。

DiD為一種新型的親脂性細胞膜染料(屬于一個親脂性示蹤染料家族,該家族還包括 DiO,DiI,DiR 等),其化學名稱為1,1′-雙十八烷基-3,3,3′,3′-四甲基吲哚菁,分子式為C61H99ClN2O4,相對分子質量為959.91,基本無細胞毒性,可用來染細胞膜和其他脂溶性生物結構。當與細胞膜結合后其熒光強度迅速增強,染料迅速均勻分布在整個細胞膜上。該族染料均有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命,高熒光強度至少維持在30天,甚至長達2年以上[12-13]。DiD可被He-Ne 激光器發(fā)出的633 nm 波長激發(fā)光激發(fā),發(fā)射光峰值在 665 nm,與機體組織自發(fā)熒光譜窗基本不重疊。DiD的染色效率高、均一,不易猝滅,無明顯細胞毒性,且受自身熒光背景干擾小。目前DiD已成功應用于多種細胞的體內示蹤研究,如Treg細胞、間充質干細胞、腫瘤細胞、造血干祖細胞等[12,14-16]。

本研究目的在于檢測細胞膜染料DiD對BM-MNC的染色效率和造血功能的影響,并用DiD示蹤BM-MNC,活體直觀觀察DiD標記的BM-MNC在小鼠顱骨骨髓內的順利歸巢。

材 料 和 方 法

實驗動物 本實驗所使用的8～10周齡 BALB/c雄性 SPF級小鼠,體質量為 (23±2) g,由上海市斯萊克實驗動物有限公司提供,飼養(yǎng)于復旦大學藥學院張江動物房 SPF 級環(huán)境。

主要試劑和儀器 細胞膜染料DiD(貨號 D307;規(guī)格25 mg;品牌Invitrogen Molecular Probes);小鼠骨髓單個核細胞分離液(貨號TBD2013LM;規(guī)格2×100 mL/kit;品牌天津灝洋TBD);紅細胞裂解液(貨號9-140331-4;規(guī)格500 mL;品牌GENMED);類胎牛血清FBS(貨號SV30184.02;規(guī)格500 mL;品牌HyClone);小鼠集落形成試劑盒MethoCultTMGFM 3434(貨號EXP.MM/YYYY;規(guī)格100 mL;品牌Stem Cell);CCK8(貨號CK04;規(guī)格500孔;品牌DOJINDO)。體外流式細胞儀(型號FACSAriaTMIII;品牌BD);激光共聚焦顯微鏡(型號LEICA TCS SP5;品牌LEICA);雙光子共聚焦顯微鏡(型號A1RMP;品牌尼康)。

實驗方法

密度梯度離心法提取BM-MNC 8～12周齡 BALB/c 雄性SPF級小鼠過量麻醉處死,置于75%酒精中浸泡5 min后,無菌條件下剝離股骨和脛骨,用F 液沖洗出全部骨髓液,200目篩網過濾后,500×g,離心20 min,棄上清。沉淀重復用F液洗滌1次后用全血及組織稀釋液懸起(細胞濃度為2×108～1×109/mL)。將懸液小心疊加在C 液液面上(重懸骨髓液與C液比例為1∶1),400×g,離心20 min,最小加速度。然后收集第二層乳白色細胞,將其放入含4～5 mL細胞洗滌液的離心管中,充分混勻后,500×g,離心20 min。離心后的沉淀經PBS反復洗滌2 次即為所需的BM-MNC。

DiD標記BM-MNC 將BM-MNC重懸于PBS內[細胞濃度約在(2～3)×106/mL]。避光環(huán)境中,向每mL細胞懸液中加入 5 μL 濃度為1 mmol/L的DiD 儲存子液,輕輕吹打,使染料和細胞懸液充分混勻,置于 37 ℃電熱恒溫水浴箱內搖晃染色 40 min。加入PBS沖洗懸液,400×g,離心5 min,棄上清,沉淀再經PBS反復洗滌2次即為DiD標記的BM-MNC。

DiD對BM-MNC造血功能的毒性檢測 主要采用骨髓單個核細胞的CCK-8細胞活性-增殖實驗和造血集落形成實驗,來檢測DiD染料對BM-MNC造血功能的毒性影響。

CCK-8細胞活性-增殖實驗 DiD標記的BM-MNC和未標記的BM-MNC分別作為實驗組和陰性對照組,兩組均用10% FBS/IMDM重懸至1×106/mL細胞濃度,分別接種在同一96孔板上,每組接種3孔,每孔接種100 μL細胞懸液,并以100 μL無細胞的10% FBS/IMDM作為空白對照。接種后,將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2 h,待細胞狀態(tài)穩(wěn)定后,向每組每孔內加入CCK-8試劑10 μL,混勻后再置于上述培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后拿出孔板,置于酶聯(lián)免疫檢測儀中,于450 nm波長處測定孔板上各孔的光吸收值。

造血集落形成實驗 DiD標記的BM-MNC和未標記的BM-MNC分別作為實驗組和陰性對照組,兩組均用10% FBS/IMDM重懸至2.5×105/mL細胞濃度,然后與集落形成培養(yǎng)基充分混勻,分別接種在中培養(yǎng)皿內,每組接種3皿,每皿接種300 μL,密度為2.5×105/mL細胞。接種后,將培養(yǎng)皿靜置于4 ℃冰箱中5 min,排除液體內的氣泡,再將培養(yǎng)皿轉移到37 ℃培養(yǎng)箱,12天后計算兩組的各種集落及總集落的形成情況。重復3次試驗后,統(tǒng)計結果。小鼠BM-MNC培養(yǎng)后形成的造血集落主要有3種:BFU-E(爆式紅系集落形成單位)、CFU-GM(粒單核系集落形成單位)、CFU-GEMM(粒單核系-巨核細胞-紅系集落形成單位)。本實驗計數(shù)各種集落的標準為:BFU-E約在孵育后10～14天計數(shù),其特點是集落邊緣雜細胞少,形態(tài)不規(guī)則,集落呈紅色或者黑褐色,里面由多個獨立的、不規(guī)則的小集落組成;CFU-GM約在孵育后10～14天計數(shù),其特點是邊緣細胞多,呈輻射狀,細胞集落總形態(tài)呈圓形或者橢圓形,非常規(guī)則,集落可呈灰色或者深灰色(高密度),其中CFU-G細胞偏小、發(fā)亮、更規(guī)則,CFU-M細胞偏大、呈灰色團;CFU-GEMM約在孵育后10～14天計數(shù),其特點是細胞集落多于500個細胞,在CFU-GM的基礎上,可發(fā)現(xiàn)不規(guī)則的紅系E分布在CFU-GEMM集落的周圍。

活體觀察DiD標記的BM-MNC在顱骨骨髓內的歸巢 移植后24 h ,深度麻醉小鼠,尾靜脈注射100 μL 濃度為10 mg/mL的 FITC-Dextran來標記顱骨骨髓內的血管。對顱骨骨髓觀察區(qū)進行備皮,頭皮縱行切口,去除覆蓋在骨質表面的骨膜,暴露顱骨,并滴少量無菌PBS于骨表面(以防骨表面水分蒸發(fā)變干而降低成像效果)。將小鼠放在單/雙光子共聚焦顯微鏡下觀察,主要觀察中央靜脈和冠狀靜脈交叉形成的十字形血管周邊的顱骨骨髓區(qū)。掃描結束后,對小鼠傷口進行消毒、縫合處理,隨后將小鼠單獨放在一個飼養(yǎng)籠子里面,待其蘇醒。整個實驗過程注意維持小鼠體溫的穩(wěn)定。

統(tǒng)計方法 采用Stata 10.0軟件進行統(tǒng)計分析。若總體分布服從正態(tài)分布且方差齊性,則行單因素方差分析(One way ANOVA)和t檢驗;若總體分布不服從正態(tài)分布或方差不齊,則行秩和檢驗(包括Kruskal-Wallis H)。α=0.05為檢驗水平,P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

BM-MNC的DiD染色效率 本實驗主要采用體外流式細胞術分析方法和激光共聚焦掃描顯微鏡成像方法檢測 BM-MNC的DiD染色效率。圖 1和圖2分別為體外流式細胞術分析圖和激光共聚焦掃描顯微鏡成像圖。這兩種方法的結果均顯示,BM-MNC的DiD染色效率可達90%上,可滿足體內示蹤移植細胞的實驗要求[11]。

DiD對BM-MNC造血功能的毒性檢測 本實驗主要采用BM-MNC的CCK-8細胞活性-增殖實驗和造血集落形成實驗,來檢測DiD染料對BM-MNC造血功能的毒性影響,實驗結果采用t檢驗進行統(tǒng)計分析。圖3為DiD染料對BM-MNC活性-增殖能力的影響圖,結果顯示,DiD+標記組(DiD+組)的BM-MNC的平均活性-增殖能力雖略低于未標記組(對照組),但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.107 4)。圖4為DiD染料對BM-MNC造血集落形成能力的影響圖,結果顯示,DiD+標記組(DiD+組)和未標記組(對照組)的BM-MNC在紅系BFU-E (P=0.814 5)、粒單核系CFU-GM (P=0.398 2)、粒-單核-巨核-紅系集落CFU-GEMM (P=0.854 2),以及總集落形成 (P=0.449 5)方面,均無明顯差別。

活體觀察DiD標記的BM-MNC在顱骨骨髓內的歸巢 為了進一步觀察DiD標記的BM-MNC在生物體內是否順利歸巢到骨髓,我們采用了單/雙光子共聚焦顯微鏡,活體直觀觀察DiD標記的BM-MNC在小鼠顱骨骨髓內的歸巢。小鼠顱骨骨髓主近[19](圖5)。觀察6～10只小鼠后,結果顯示,每只小鼠顱骨骨髓區(qū)內均有BM-MNC的分布(圖6)。

討 論

BM-MNC來源于骨髓,主要由造血干細胞和間充質干細胞組成,負責造血及協(xié)助造血;骨髓也是BM-MNC移植后的主要歸巢部位,BM-MNC歸巢到骨髓后的主要功能即重建造血[17-18]。

BM-MNC作為HSC的主要來源之一,目前已成功應用于臨床上的造血干細胞移植,BM-MNC的活體示蹤研究,對臨床調控HSCT后的HSC歸巢及拓寬骨髓HSC在其他再生治療領域的應用具有重要意義。與傳統(tǒng)的示蹤BM-MNC的方法相比,DiD作為一種新型的親脂性細胞膜染料,染色效率高、均一,有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)壽命,其光譜窗與機體組織自身熒光譜窗基本不重疊,移植細胞的熒光受機體自身組織的背景干擾少,且無明顯細胞毒性,目前已用于多種細胞的體內示蹤研究[12,14-16]。

本研究目的主要在于檢測細胞膜染料DiD對BM-MNC的染色效率和造血功能的影響,并用DiD示蹤BM-MNC,活體直觀觀察DiD標記的BM-MNC在小鼠顱骨骨髓內的順利歸巢。結果顯示,BM-MNC的DiD染色效率高達90%以上;且DiD對BM-MNC的細胞增殖能力和造血能力均無明顯的毒性影響;單/雙光子共聚焦顯微鏡下,在活體小然而近來有文獻報道,細胞膜染料可能存在染料轉移的現(xiàn)象——即移植后的細胞膜染料標記細胞在機體內死亡后可被機體內的單核巨噬細胞吞噬,繼而膜染料會整合到這些免疫細胞上,導致這些免疫細胞也會顯示熒光[20]。這意味著DiD示蹤BM-MNC的作用還有待進一步驗證和研究。而以往所有示蹤BM-MNC的方法也都存在一定的局限性,如不宜長時間觀察、具有細胞毒性[9],需要長期穩(wěn)定轉染報道基因[10],容易受自身組織的背景干擾[11]等。DiD作為一種新型的親脂性細胞膜染料,克服了以往方法的諸多缺點和局限性,基本無細胞毒性;其具有很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命,高熒光強度至少維持在30天,甚至長達2年以上[12-13];發(fā)射光峰值在 665 nm,與機體組織自發(fā)熒光譜窗基本不重疊,受自身熒光背景干擾少。DiD標記的BM-MNC染色效率高且均一、無明顯細胞毒性、染料不易淬滅觀察時間較長,且自身熒光背景干擾少,可成功歸巢到活體小鼠骨髓,DiD標記的BM-MNC未來有望應用于骨髓單個核細胞與造血干細胞的長時間體內示蹤研究。

A:The comparison of capacity to form BFU-E between control and DiD+group; B:The comparison of capacity to form CFU-GM between control and DiD+group; C:The comparison of capacity to form CFU-GEMM between control and DiD+group; D:The comparison of total colony number between control and DiD+group and the typical picture of two groups taken under the light microscope (4×).

圖 4 DiD對BM-MNC造血集落形成能力的影響圖

Fig 4 The effects of capacity of hematopoietic colony forming on BM-MNC by DiD

鼠顱骨骨髓內可直觀觀察到DiD標記的BM-MNC的順利歸巢。以上結果均表明,DiD標記的BM-MNC可用于活體示蹤研究。

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A new tracing method of bone marrow mononuclear cells by cell membrane dye Di

DWANG Fen1, XIE Cheng-ying2, QU Ying1, WEI Dan2, SUO Yuan-zhen2,WU Meng-yao1, YUAN Yan1, WEI Xun-bing2, CHEN Tong1△

(1DepartmentofHematology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2Med-XResearchInstitute,SchoolofBiomedicalEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200030,China)

Objective To detect the labeling efficiency of DiD on bone marrow mononuclear cells (BM-MNC) and the effects of hematopoiesis on BM-MNC imposed by DiD,and then directly observe the successful homing of transplanted BM-MNC labeled by DiD in a live mouse skull marrow.Methods We detected the labeling efficiency of DiD on BM-MNC byinvitroflow cytometry and confocal laser scanning microscopy.We also detected the effects of DiD hematopoiesis on BM-MNC by CCK8 test and colony forming assay,and directly observed the homing of transplanted BM-MNC labeled by DiD in a live mouse skull marrow under the single/two-photon confocal laser scanning microscope. Results The labeling efficiency of DiD on BM-MNC was up to 90%,and the cell vitality-proliferation and capacity to produce blood cells of BM-MNC were changed very little after being labeled by DiD (P>0.05).The transplanted BM-MNC labeled by DiD could be seen successfully homing to skull marrow in a live mouse under the single/two-photon confocal laser scanning microscope. Conclusions DiD has high and uniform labeling efficiency,non-toxic to cell functions,low rate of fluorescence quenching,low interference from autofluorescence of tissue,and the BM-MNC labeled by DiD could home to bone marrow successfully in a live mouse.

cell membrane dye; bone marrow mononuclear cells; hemapoietic stem cell transplantation

國家自然科學基金(81561138002,91542109);上海市基礎研究重點項目(13JC1406404);上海市優(yōu)秀學術帶頭人計劃(16XD1400600)

R457.7

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2016.06.010

2016-05-06;編輯:張秀峰)

△Corresponding author E-mail:chentong@fudan.edu.cn

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81561138002,91542109),the Key Program of Basic Research of Shanghai (13JC1406404) ,and the Excellent Leading Scholar Program of Shanghai (16XD1400600).