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    母乳中乳酸菌的研究進(jìn)展

    2016-12-19 08:34:46董學(xué)艷姜鐵民劉繼超陳歷俊
    食品工業(yè)科技 2016年19期
    關(guān)鍵詞:定殖母乳乳酸菌

    董學(xué)艷,姜鐵民,劉繼超,陳歷俊,*

    (1.北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

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    母乳中乳酸菌的研究進(jìn)展

    董學(xué)艷1,2,姜鐵民1,劉繼超1,陳歷俊1,*

    (1.北京三元食品股份有限公司國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心,北京 100163; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

    母乳涵蓋了嬰兒成長(zhǎng)所需的全部營(yíng)養(yǎng),為保證嬰兒健康、快速生長(zhǎng),母乳喂養(yǎng)是最好的方式。傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已證明母乳是乳酸菌的天然來(lái)源,乳酸菌從母體腸道傳遞給乳腺的過(guò)程中免疫系統(tǒng)起到至關(guān)重要的作用。目前從健康母體的母乳中經(jīng)常能夠分離得到的乳酸菌有鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和片球菌屬(Pediococcus)等。很多研究都已證明母乳中的乳酸菌具有特殊的功能如抑制病原微生物生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)腸道健康、抗HIV及治療乳腺炎等。本文就母乳中乳酸菌的來(lái)源、母嬰間乳酸菌的傳遞方式、母乳源乳酸菌的種類和功能特性等進(jìn)行綜述,以期為母乳源乳酸菌的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

    母乳,乳酸菌,嬰兒腸道,益生菌,功能特性

    母乳被公認(rèn)為是嬰兒最健康、理想的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源,母乳喂養(yǎng)可提高嬰兒對(duì)腹瀉、哮喘、過(guò)敏性疾病和呼吸道感染等疾病的抵抗力,發(fā)病率較低[1-2]。這一功效可能是母乳中多種成分綜合作用的結(jié)果。例如免疫球蛋白、細(xì)胞因子、抗體、低聚糖以及各種抗菌物質(zhì)[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)母乳中存在豐富的微生物菌群[5-6],且可以通過(guò)哺乳傳遞給嬰兒。某些微生物能夠選擇性刺激嬰兒體內(nèi)起積極作用的腸道菌群的生長(zhǎng),某些微生物還有抑制病原微生物在嬰兒腸道內(nèi)生長(zhǎng)定植的作用,如乳桿菌、雙歧桿菌等乳酸菌,進(jìn)而可以提高嬰兒的代謝和免疫能力[7]。2011年Hunt等人[8]采用DNA二代測(cè)序技術(shù)首次全面地研究了母乳微生物群落的多樣性,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)和鏈球菌(Streptococcus)是母乳中含量最豐富的菌屬。母乳中同樣富含乳酸菌,從2003年兒科雜志報(bào)道了母乳中的可能乳酸菌成分[9],到現(xiàn)在已有很多地區(qū)母乳中乳酸菌(主要是乳桿菌和雙歧桿菌)被發(fā)現(xiàn)并申請(qǐng)了專利[10-11]。

    母乳乳酸菌群落是人類與微生物協(xié)同進(jìn)化、相互適應(yīng)的產(chǎn)物,與乳母、嬰兒構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),而該生態(tài)系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性對(duì)嬰兒腸道菌群定殖、免疫調(diào)節(jié)活性和抗感染等方面有重要的促進(jìn)作用進(jìn)而影響其一生的健康。源自人體、嬰兒的安全攝入歷史以及粘膜基底對(duì)其有良好的適應(yīng)性等特點(diǎn)使母乳成為開發(fā)新型益生菌的重要菌庫(kù),有廣闊的開發(fā)和應(yīng)用前景。因此本文對(duì)研究者所關(guān)注的母乳中乳酸菌的來(lái)源、母嬰間乳酸菌的傳遞方式、母乳源乳酸菌的種類和功能特性等進(jìn)行綜述。

    1 母乳中乳酸菌的來(lái)源

    母乳一直被認(rèn)為是無(wú)菌液體,但是在巴氏消毒后,母乳隨即喪失了抑菌活性,加上臍血和胎糞中乳酸菌群的發(fā)現(xiàn)等[12],促使了研究者對(duì)母乳中乳酸菌及其來(lái)源展開研究。關(guān)于母乳中是否存在乳酸菌,Martín等[9]通過(guò)常用和特殊的組織培養(yǎng)基,研究了8位乳母母乳樣本中微生物菌群的特性,結(jié)果所有母乳樣本中均分離得到乳酸菌。為了排除母乳中菌群在樣本采集過(guò)程中存在交叉感染,同時(shí)也采集了乳房皮膚的樣本。母乳和乳房皮膚中分離出來(lái)菌群的非常相似,這就排除了母乳受到環(huán)境微生物的交叉感染,同時(shí)證明母乳中乳酸菌的存在。

    2007年P(guān)érez等[13]報(bào)道,乳酸菌可通過(guò)內(nèi)源性路線由母體的腸道傳遞至乳腺,而腸道中的病原微生物并不會(huì)通過(guò)這種機(jī)制獲得生長(zhǎng)和繁殖的機(jī)會(huì),且這是一個(gè)自然生理過(guò)程,該過(guò)程在孕期和哺乳期會(huì)加速進(jìn)行。然而,菌群是如何從母體的腸道傳遞給乳腺,這一機(jī)理目前尚不完全明確。最近不同的研究團(tuán)隊(duì)均報(bào)道在這一機(jī)理過(guò)程中免疫系統(tǒng)起到了關(guān)鍵作用,樹突細(xì)胞(DCs)和巨噬細(xì)胞使得微生物可以在孕婦生殖系統(tǒng)、唾液系統(tǒng)和乳腺中傳遞[14-15]。研究表明樹突細(xì)胞是一組免疫細(xì)胞,可以打開上皮細(xì)胞的緊密連接,把樹突伸向上皮細(xì)胞外,抓取特殊的細(xì)菌(例如乳桿菌),并且攜帶這些菌株進(jìn)入乳腺(圖1)。此外,樹突細(xì)胞能維持少量的共生細(xì)菌在腸系膜淋巴結(jié)存活數(shù)天,受抗原刺激的細(xì)胞能從腸粘膜移動(dòng)到粘膜表面定殖,例如到呼吸道、唾液腺和乳腺等定殖[10],這些都為乳酸菌伴隨淋巴系統(tǒng)的循環(huán)到達(dá)人體其他部位提供了條件。

    圖1 菌體從母體腸道轉(zhuǎn)移至乳腺和母乳的機(jī)制[15]Fig.1 Mechanism of transiocation of commensal bacteria from mother gut to mammary gland and milk[15]

    2 乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)至新生兒的途徑

    二十世紀(jì)初,人們普遍認(rèn)為胎兒在子宮內(nèi)是無(wú)菌的。新生兒腸道菌群的定殖是始于嬰兒出生時(shí)經(jīng)過(guò)產(chǎn)道的這一過(guò)程。在這個(gè)出生過(guò)程,陰道和排泄物的菌群通過(guò)交叉感染,由母體轉(zhuǎn)移給了新生兒[15]。然而,剖腹產(chǎn)新生兒的菌群檢測(cè)結(jié)果顯示,他們糞便的微生物菌群與陰道出生新生兒的菌群非常相似[7]。這一結(jié)果顯然否定了胎兒在子宮內(nèi)是無(wú)菌以及新生兒腸道菌群的定殖始于嬰兒出生時(shí)經(jīng)過(guò)產(chǎn)道的假設(shè)。

    乳酸菌轉(zhuǎn)運(yùn)至新生兒的途徑一直很模糊,相關(guān)研究人員認(rèn)為可能通過(guò)多種傳遞機(jī)制。一些觀點(diǎn)認(rèn)為,主要在孕期和分娩過(guò)程中進(jìn)行傳遞。第一階段,嬰兒胃腸道器官結(jié)構(gòu)初步成型至分娩前的圍孕期間,孕婦通過(guò)胎盤中的特殊管道將自身的腸道菌群傳遞至嬰兒體內(nèi)[3]。Jiménez等[12]在胎糞和臍帶血中發(fā)現(xiàn)乳酸菌的存在,可以說(shuō)明乳酸菌是由孕期母親傳遞給新生兒的。母體通過(guò)體內(nèi)菌群轉(zhuǎn)移給胎兒,從而啟動(dòng)了乳酸菌在胎兒腸道的定殖,使得胎兒出生后能夠適應(yīng)脫離母體的環(huán)境。第二階段,孕婦分娩過(guò)程中,在陰道內(nèi)羊水環(huán)境下,通過(guò)嬰兒口腔將菌群傳遞至嬰兒體內(nèi)。更多的觀點(diǎn)認(rèn)為,嬰兒是在產(chǎn)婦的分娩過(guò)程中,陰道分泌物、糞便等物質(zhì)交叉污染使得嬰兒得到首批菌群,但數(shù)量較少,出生后,嬰兒通過(guò)哺乳的過(guò)程獲得更大幅度的菌群傳遞[3,16]。Martín等[7,17]采集了母體的陰道、口腔抹片樣本以及新生兒胎糞的樣本。通過(guò)對(duì)不同來(lái)源樣本的乳酸菌檢測(cè),結(jié)果顯示母乳中的乳酸菌群與口腔抹片和新生兒胎糞中的完全相同,但是與陰道抹片中的菌群不同。結(jié)果證明存在于母乳的乳酸菌可通過(guò)哺乳期的喂養(yǎng)定殖到嬰兒的腸道。文獻(xiàn)報(bào)道,孕婦在妊娠期內(nèi)身體會(huì)發(fā)生許多變化,其乳頭會(huì)出現(xiàn)明顯的腫脹,乳暈明顯擴(kuò)大,其內(nèi)部的生物膜系統(tǒng)和腺體導(dǎo)管迅速發(fā)育,脂肪系統(tǒng)活性增強(qiáng)并分泌大量脂質(zhì),這些變化引起乳腺中的淋巴液和血液增加,同時(shí)刺激孕婦的腦垂體后葉釋放一定量的催產(chǎn)物質(zhì),從而促進(jìn)母乳中乳酸菌等微生物的生長(zhǎng)和繁殖[18]。一個(gè)嬰兒每天攝入約800 mL母乳,吞咽大約1×105~1×107來(lái)源于母乳的菌群[16]??梢娔溉閷?duì)于母乳喂養(yǎng)新生兒腸道菌群的建立和增殖起到至關(guān)重要的作用,是嬰兒腸道獲取乳酸菌的持續(xù)來(lái)源。

    因此,無(wú)論是嬰兒出生前于母體孕期獲得的乳酸菌,還是出生后通過(guò)哺乳獲得的乳酸菌均對(duì)新生兒腸道相關(guān)淋巴系統(tǒng)的發(fā)育起著最早期強(qiáng)烈的刺激作用,對(duì)于新生兒免疫系統(tǒng)的成熟至關(guān)重要。菌群的轉(zhuǎn)移是母親對(duì)新生兒的另一種保護(hù),使寶寶能夠抵抗疾病的感染,建立健康的腸內(nèi)菌群,并引導(dǎo)腸內(nèi)菌群和免疫系統(tǒng)的良性發(fā)育。

    3 母乳中乳酸菌的鑒定及種類

    3.1 母乳中乳酸菌的鑒定

    母乳中乳酸菌的傳統(tǒng)分離鑒定方法為平皿培養(yǎng)法,步驟如下:樣品→增菌→分離→劃線純化→革蘭氏染色鏡檢→生理生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。整個(gè)鑒定過(guò)程需要3~5 d才能完成,鑒定時(shí)間長(zhǎng)且程序復(fù)雜,優(yōu)點(diǎn)是可以得到分離的菌株。

    現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克服了傳統(tǒng)方法的限制,可以從基因水平上估計(jì)出種屬豐度、均勻度,研究樣品中的乳酸菌多樣性和穩(wěn)定性,探索其進(jìn)化和變異情況以及功能基因的注釋,從而更為客觀的認(rèn)識(shí)乳酸菌天然的生態(tài)狀況,但是無(wú)法分離得到菌株。目前常見的方法有PCR-DGGE/TGGE,實(shí)時(shí)定量PCR(qRTi-PCR)和二代測(cè)序等。PCR-DGGE/TGGE分析后可以根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析出母乳乳酸菌的種甚至亞種,但不能從數(shù)量上揭示樣品乳酸菌群落結(jié)構(gòu)。Martin R等[19]采用PCR-DGGE技術(shù)成功從母乳樣品中成功檢測(cè)并分離到短雙歧桿菌,青春雙歧桿菌和兩歧雙歧桿菌,并且這些雙歧桿菌在對(duì)應(yīng)嬰兒的糞便中也得到檢測(cè)。qRTi-PCR可以實(shí)現(xiàn)定量,但僅能分析出復(fù)雜樣品中某一類群微生物及數(shù)量,需要與其它方法進(jìn)行配套聯(lián)用。Collado 等[20]用qRTi-PCR分析了50個(gè)母乳樣本中包含乳酸菌在內(nèi)的細(xì)菌群落的多樣性。以Illumina Hiseq/Miseq和羅氏454 GS FLX為代表的二代測(cè)序因其高通量、快速、準(zhǔn)確和靈敏度高等特點(diǎn)已應(yīng)用于母乳中乳酸菌群落結(jié)構(gòu)的分析[8]。

    3.2 母乳中乳酸菌的種類

    隨著基于培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物研究系統(tǒng)的日益完善和非基于培養(yǎng)的新型分子生物學(xué)手段的快速發(fā)展,已從母乳中分離出大量的乳酸菌,詳見表1。母乳中發(fā)現(xiàn)的乳酸菌主要為鏈球菌屬(Streptococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、明串珠菌屬(Leuconostoc)和片球菌屬(Pediococcus)等。母乳中乳酸菌的結(jié)構(gòu)和多樣性可能會(huì)受包括母乳類型(初乳、過(guò)渡乳和成熟乳)、地理位置、產(chǎn)婦的民族、飲食習(xí)慣、健康狀況及體重、分娩方式和胎次在內(nèi)的多種因素的影響,因此不同的研究者報(bào)道的母乳乳酸菌的構(gòu)成有所差別。

    產(chǎn)婦泌乳有一個(gè)循序漸進(jìn)的質(zhì)與量的變化,其中初乳是最早分泌的一種淡黃色的生物流體,雖然其分泌量最少,但其中含有豐富的脂肪淋巴細(xì)胞、乳腺細(xì)胞和來(lái)自導(dǎo)管的細(xì)胞以及高濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和多種免疫球蛋白、活性免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞因子等活性物質(zhì),這些物質(zhì)都使得初乳中的乳酸菌結(jié)構(gòu)和多樣性異于后期的成熟乳和晚乳[16]。Hunt等[8]利用高通量測(cè)序?qū)?6名乳母乳樣研究的結(jié)果表明地理位置及環(huán)境與母乳中乳酸菌結(jié)構(gòu)存在十分重要的關(guān)系。此外,健康狀況不良的乳母在分娩時(shí)和后期哺乳的過(guò)程中,會(huì)將健康欠佳的菌群傳遞給嬰兒,并且孕婦體重超重也會(huì)導(dǎo)致母乳中乳酸菌多樣性發(fā)生變化,研究顯示肥胖產(chǎn)婦的初乳和早期成熟中乳酸菌的多樣性均低于正常體重的產(chǎn)婦[28-30]。關(guān)于分娩方式和胎次對(duì)母乳中乳酸菌結(jié)構(gòu)和多樣性的影響機(jī)制及程度還沒(méi)有明確的解釋,Martín等利用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)5個(gè)正常分娩的健康乳母乳汁中的乳酸菌進(jìn)行了研究,結(jié)果表明,剖腹產(chǎn)和自然分娩的產(chǎn)婦母乳中的乳酸菌多樣性存在一定的差異,但差異不顯著[17]。

    表1 母乳中分離的主要乳酸菌株

    Table 1 Main lactic acid bacteria detected in breast milk

    屬種參考文獻(xiàn)StreptococcusspSsalivarius[11]Smitis[11,16]Sparasanguis[16,21]Speroris[22]Sspp[23]Spneumoniae[21]Svestibularis[11,24]Sgallolyticus[24]Sagalactiae/peroris[16]Saustralis[24]Slactarius[25]Soralis[16,21]Sanginosus[21]LactobacillusspLgasseri[11,26]Lrhamnosus[16]Lacidophilus[27]Lplantarum[23,26]Lfermentum[10,26]Lsalivarius[26]Lreuteri[26]Lcrispatus[16]Lgastricus/vaginalis[26]Lanimalis[24]Lbrevis/oris[24]Lcasei[26]Lparacasei[21]LactococcusspLaclactis[16]EnterococcusspEfaecium[21]Efaecalis[11,16,21]Emundtii[24]Edurans[21,24]Ehirae[24]BifidobacteriumspBpseudocatenulatum[11]Badolescentis[19]Blongum[11,26]Bbifidum[11,19]Bbreve[21,26]LeuconostocspLeucmesenteroides[16,21]PediococcusspPepentosaceous[24]

    4 母乳乳酸菌的功能特性

    近些年來(lái),一些與病原菌中抗菌素抗性、胃腸道疾病、過(guò)敏以及炎癥性疾病的增加等相關(guān)問(wèn)題的出現(xiàn)促進(jìn)了對(duì)益生菌的研究。很明顯,來(lái)源于母乳的乳酸菌是非常值得關(guān)注的,因?yàn)樗鼈兡軌驖M足人體益生菌的標(biāo)準(zhǔn),比如人類的起源以及對(duì)粘膜和乳品基質(zhì)的適應(yīng)[31]。相比于其它來(lái)源的細(xì)菌,這些細(xì)菌能夠獨(dú)特地適應(yīng)人體消化道,并且從出生時(shí)就一直與我們相互作用。在眾多分離于母乳的乳酸菌中,唾液乳桿菌CECT5713、格氏乳桿菌CECT5714和發(fā)酵乳桿菌CECT5716是研究最多、最具有益生菌和作為生物治療劑潛質(zhì)的[32-33]。此外,還有一些分離于母乳的乳酸菌在體內(nèi)和體外均顯示出具有腸道定植、產(chǎn)生抑菌物質(zhì)、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗過(guò)敏、治療乳腺炎以及抗HIV等作用[16,32-37],具體如表2所示。

    表2 母乳中乳酸菌的功能

    Table 2 The function of lactic acid bacteria in breast milk

    菌株功能Streptococcus抑制葡萄球菌生長(zhǎng)Enterococcusfaecalis產(chǎn)生細(xì)菌素抑菌Lactobacillusrhamnosus抑制葡萄球菌生長(zhǎng)Lactobacilluscurvatus抑制葡萄球菌生長(zhǎng),抗R5HIV-1Lactobacillussalivarius抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)LactobacillusfermentumCECT5716腸道定殖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、治療感染性乳腺炎、增強(qiáng)流感疫苗效果、減少嬰兒胃腸道和上呼吸道感染LactobacillusgasseriCECT5714腸道定殖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)、抑菌、改善腸道功能、免疫調(diào)節(jié)、抗過(guò)敏、治療感染性乳腺炎LactobacillussalivariusCECT5713腸道定殖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)、抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗HIV、改善成人腸道微生物、治療感染性乳腺炎Lactococcuslactis產(chǎn)生乳酸鏈球菌肽抑菌BifidobacteriumadolescentisDB-2458免疫調(diào)節(jié)BifidobacteriumlongumsubspinfantisGB-1496免疫調(diào)節(jié)PediococcuspentosaceusVM95抗HIV

    5 展望

    隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展,國(guó)外對(duì)母乳中乳酸菌來(lái)源、種類、分布和功能等的研究越來(lái)越多,但目前為止國(guó)內(nèi)對(duì)母乳中乳酸菌的研究罕見報(bào)道,需加強(qiáng)對(duì)中國(guó)母乳乳酸菌結(jié)構(gòu)和多樣性的分析研究,如母乳類型、地理位置、產(chǎn)婦的體重及健康狀況、分娩方式和胎次在內(nèi)的多種因素對(duì)中國(guó)母乳乳酸菌的影響。此外,母乳內(nèi)分離得到的乳酸菌被證明具有特殊的功能特性,如抑菌,抗HIV,治療乳腺炎等,說(shuō)明母乳可以作為篩選具有特殊功能益生菌的菌庫(kù)。因此篩選具有特殊益生特性的菌株并進(jìn)行應(yīng)用也是未來(lái)重點(diǎn)關(guān)注的研究方向。

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    Research progress in lactic acid bacteria in breast milk

    DONG Xue-yan1,2,JIANG Tie-min1,LIU Ji-chao1,CHEN Li-jun1,*

    (1.Beijing Sanyuan Foods Co.,Ltd National Health Engineering Research Center for Maternal and Infant Dairy,Beijing 100163,China; 2.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

    Breastmilkcoversallkindsofnutrientsforinfantgrowth.Inordertoguaranteetheinfantgrowthhealthyandrapidly,breast-feedingisthebestway.Traditionalcultureandmodernmolecularbiologytechniqueshaveshowedthatbreastmilkisthenaturalsourceoflacticacidbacteria.Theimmunesystemplaysacrucialroleintheprocesswhichlacticacidbacteriaaretransferredfromintestinaltomammarygland.SofarthelacticacidbacteriathatcanbeisolatedfromthehealthofmaternalbreastmilkareStreptococcus,Lactobacillus,Lactococcus,Enterococcus,Bifidobacterium,Leuconostoc,Pediococcus,etc.Manystudiesindicatethatsomelacticacidbacteriaspeciesinbreastmilkhavespecialfunctions,suchasinhibitingthegrowthofpathogenicmicroorganisms,regulatingimmunesystemandmammaryglandflora,anti-HIVandcuringmastitisandsoon.Thesource,transmissionbetweenmotherandbaby,speciesandfunctionalcharacteristicsofthebreastmilklacticacidbacteriawerereviewedinthispaper.Andthe

    forthefurtherresearchandutilizationoflacticacidbacteriainbreastmilkwerealsoprovided.

    breastmilk;lacticacidbacteria;infantgut;probiotics;function

    2016-04-25

    董學(xué)艷(1983-),女,博士,研究方向:乳品科學(xué),E-mai:18910005185@163.com。

    *通訊作者:陳歷俊(1967-),男,博士,教授級(jí)高級(jí)工程師,研究方向:新型乳制品和質(zhì)量安全控制技術(shù)研究與開發(fā),E-mai:chenlijun@sanyuan.com.cn。

    北京市重大科技計(jì)劃項(xiàng)目(D141100004814002); 北京市博士后工作經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目。

    TS201.3

    A

    1002-0306(2016)19-0391-05

    10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.068

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