上海市售水產(chǎn)品中副溶血性弧菌耐藥性分析

盧 奕,陳瑋祎,劉海泉，2，3，*,謝 晶，2，3,趙 勇，2，3，*,孫曉紅，2，3

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

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上海市售水產(chǎn)品中副溶血性弧菌耐藥性分析

盧 奕1,陳瑋祎1,劉海泉1，2，3，*,謝 晶1，2，3,趙 勇1，2，3，*,孫曉紅1，2，3

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海 201306; 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306)

為了解上海市售水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的耐藥情況,通過藥敏紙片擴散法(K-B法)對上海市某水產(chǎn)品市場連續(xù)兩年監(jiān)測分離獲得的45株副溶血性弧菌進行了25種常用抗生素的藥敏實驗。結(jié)果顯示,所有實驗菌株都對青霉素G和甲硝唑耐藥,有高達90%以上的菌株對帕拉西林、新霉素和卡那霉素耐藥,而對利福平、萬古霉素、四環(huán)素、強力霉素、頭孢拉定和土霉素全部敏感;同時發(fā)現(xiàn)不同來源的菌株,其耐藥譜存在一定程度的差異,菌株多重耐藥性與菌株致病因子類型間也存在一定的相關(guān)性。因此,應進一步加強水產(chǎn)品中細菌耐藥性的監(jiān)測,并采取更有效措施控制細菌耐藥性。

水產(chǎn)品,副溶血性弧菌,耐藥性

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)屬于弧菌科弧菌屬,是一種革蘭氏陰性菌,嗜鹽[1]。副溶血性弧菌不僅是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌,同時也是引起沿海地區(qū)食物中毒的主要食源性致病菌[2]。生食或未充分烹飪被副溶血性弧菌污染的食品(主要為水產(chǎn)品)是導致食物中毒的主要原因[3]。據(jù)國家衛(wèi)生和計劃生育委員會統(tǒng)計,2015年微生物性食物中毒事件的中毒人數(shù)最多,副溶血性弧菌為主要致病因子之一[4]。通過對上海市市售食品中食源性致病菌污染狀況的調(diào)查,結(jié)果表明74.84%的食品安全事件由微生物導致,其中副溶血性弧菌導致的食物中毒事件占到微生物因素的33.33%[5],可見副溶血性弧菌在我國仍是主要的食源性致病菌。

溶血毒素是副溶血性弧菌的主要致病因子;溶血毒素主要有耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)、耐熱直接溶血素相關(guān)溶血毒素(TDH-related hemolysin,TRH)及不耐熱溶血素(hermolabilehemolysin,TLH);其中TDH和TRH是與副溶血性弧菌致病性密切相關(guān)的毒力因子[6]?？股厥怯晌⑸锘蚋叩葎又参镌谏钸^程中所產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的一類次級代謝產(chǎn)物,能干擾其他生活細胞發(fā)育功能的化學物質(zhì)[7]。目前,主要使用抗生素來預防和控制副溶血性弧菌引發(fā)的病害,但抗生素的不正確使用使副溶血性弧菌更容易獲得耐藥性,并且其耐藥性可通過食物鏈轉(zhuǎn)移給人類[8]。

因此,為監(jiān)測水產(chǎn)品中副溶血性弧菌的耐藥性狀況,本研究從上海市某水產(chǎn)品市場連續(xù)兩年采集并分離得到45株副溶血性弧菌,選取了6大類25種藥敏片,分別從菌株分離來源、致病因子類型等角度分析其耐藥情況,為控制副溶血性弧菌耐藥性、指導抗生素的合理使用提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),從而更好地控制副溶血性弧菌對人類和水產(chǎn)動物的危害。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽鹽蔗糖瓊脂(TCBS瓊脂) 購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司;Mueller Hinton肉湯、藥敏片 購于英國OXOID公司。

VS-100L-U超凈工作臺 江蘇蘇凈集團;MLS-3750型壓力蒸汽滅菌器、MIR-154型高精度低溫培養(yǎng)箱 日本三洋Sanyo公司;6325型聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、5424型離心機、微量移液器 德國Eppendorf公司;PL2002型電子天平瑞士Mettler Toledo公司;Sub-Cell?GT型電泳儀、Gel DocTMXR型凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

從上海市某水產(chǎn)品市場連續(xù)兩年分離得到45株副溶血性弧菌,以及從食用了被該菌污染的食品或者食用了含有該菌的食品后出現(xiàn)中毒癥狀的病人分離到的2株副溶血性弧菌,作為對照,詳見表1?？咕孛舾袑嶒炠|(zhì)控標準菌株大腸埃希氏菌ATCC25922。

表1 副溶血性弧菌菌株基本信息

Table 1 Informations ofVibrioparahaemolyticusstrains

菌株編號菌株分離來源致病基因tlhtdhtrh1斑節(jié)對蝦+--2日本沼蝦++-3基尾蝦+--4日本沼蝦+--5日本沼蝦+--6日本沼蝦+--7羅氏沼蝦+--8斑節(jié)對蝦+--9羅氏沼蝦+--10斑節(jié)對蝦+--11日本沼蝦+--12羅氏沼蝦+--13斑節(jié)對蝦+--14羅氏沼蝦+--15斑節(jié)對蝦+--16羅氏沼蝦+--17日本沼蝦+--18日本沼蝦++-19斑節(jié)對蝦+--20日本沼蝦+--21斑節(jié)對蝦+-+22羅氏沼蝦+--23白米蝦+--24羅氏沼蝦+-+25羅氏沼蝦+-+26羅氏沼蝦+-+27羅氏沼蝦+-+28羅氏沼蝦+-+29羅氏沼蝦+-+30羅氏沼蝦+-+31南美白對蝦+--32羅氏沼蝦+--33羅氏沼蝦+-+34羅氏沼蝦+-+35南美白對蝦+--36南美白對蝦+--37南美白對蝦+--38南美白對蝦+--39南美白對蝦++-40南美白對蝦++-41南美白對蝦++-42南美白對蝦++-43南美白對蝦++-44南美白對蝦++-45南美白對蝦++-46?病人+++47?病人+++

注:+含有該基因,-不含有該基因;*菌株46和47,作為對照菌株。1.2 實驗方法

1.2.1 樣品中副溶血性弧菌的鑒定 根據(jù)GB/T 4789.7-2013《食品衛(wèi)生微生物學檢驗:副溶血性弧菌檢驗》方法[9],分離獲得疑似副溶血性弧菌;對疑似菌株的16S rDNA測序后,通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),最終確定是否為副溶血性弧菌。

表2 副溶血性弧菌的耐藥性分析及耐藥菌株比例

Table 2 Analysis ofVibrioparahaemolyticusantibiotic resistance

抗生素菌株數(shù)RIS耐藥率(%)青霉素類AML(阿莫西林)142312979AMP(氨芐西林)39718298P(青霉素G)470010000PRL(帕拉西林)46109787SAM(舒巴坦/氨芐西林)2144426頭孢菌素類KF(頭孢噻吩)21827426CE(頭孢拉定)0047000氨基糖苷類S(鏈霉素)32816638N(新霉素)45119574K(卡那霉素)43409149大環(huán)內(nèi)酯類E(紅霉素)0245000SP(螺旋霉素)01730000奎諾酮類CIP(環(huán)丙沙星)211884468NOR(諾氟沙星)211794468NA(萘啶酸)21431426ENR(恩諾沙星)3836638SXT(甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異惡唑)162473404其它類VA(萬古霉素)0047000MTZ(甲硝唑)470010000TE(四環(huán)素)0047000DO(強力霉素)0047000C(氯霉素)1046212RD(利福平)0047000PB(多粘菌素B)40708511OT(土霉素)0047000

注:表中R為耐藥,I為中介,S為敏感;耐藥率(%)=耐藥菌株數(shù)(R)/菌株總數(shù)×100。

1.2.2 菌液的制備 取于-80 ℃、25%甘油保存的菌種,接種于3% NaCl的TSB 肉湯,在37 ℃下復蘇后,劃線接種于3% NaCl的TSA平板,挑取單菌落接種于TSB肉湯中,在37 ℃下培養(yǎng)至對數(shù)期,連續(xù)活化2次。最后將副溶血性弧菌劃線接種與TCBS平板上,挑取單菌落于10 mL TBS試管中,37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)16 h,得到OD為1.1～1.4的菌液,作為種子液,備用[10]。

1.2.3 藥敏實驗 采用WHO推薦的K-B氏紙片法[11],并參考本實驗室方法[12]:將種子液濁度調(diào)至為1.5×108CFU/mL(OD值約為0.33～0.34),用棉拭子蘸取一定量的菌液均勻涂到約4 mm厚的MHA平板,待干后,將藥敏紙片貼于平板上,重復操作五次。放置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,測量抑菌圈直徑。藥敏實驗的質(zhì)控方法和結(jié)果判定依據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗的執(zhí)行標準,以標準敏感菌株大腸桿菌ATCC 25922為質(zhì)控菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌耐藥性概況

依據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗的執(zhí)行標準進行判定,本研究質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922的藥敏實驗結(jié)果符合美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)微生物敏感實驗執(zhí)行標準提供的參考數(shù)值范圍。根據(jù)藥敏片的種類,副溶血性弧菌耐藥性整體概況如表2所示。所有實驗菌株均耐青霉素G和甲硝唑,有高達90%以上的菌株對帕拉西林、新霉素和卡那霉素耐藥,而對利福平、萬古霉素、四環(huán)素、強力霉素、頭孢拉定和土霉素全部敏感。

2.2 菌株耐藥性與菌株分離來源的關(guān)聯(lián)分析

結(jié)果表明不同分離來源的副溶血性弧菌對17種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性(見圖1)。其中從羅氏沼蝦中分離得到的16株副溶血性弧菌對15種抗生素產(chǎn)生了耐藥性;來源于南美白對蝦的12株對15種抗生素耐藥;來源于斑節(jié)對蝦的7株對14種抗生素耐藥;來源于日本沼蝦的8株對13種抗生素耐藥;來源于白米蝦的1株11種抗生素耐藥;來源于基尾蝦的1株對8種抗生素耐藥;來源于病人的2株對9種抗生素耐藥;分離自羅氏沼蝦副溶血性弧菌的耐藥譜最復雜,分離來源于基尾蝦的菌株耐藥譜相對簡單。且所有來源的菌株對青霉素G、甲硝唑、帕拉西林、新霉素、卡那霉素和氨芐西林這六種抗生素均存在不同程度的耐藥。

分離來源于南美白對蝦的副溶血性弧菌分別有83.3%和100.0%的菌株對頭孢噻吩和氯霉素產(chǎn)生了耐藥,而其它分離來源的菌株對這兩種抗生素普遍敏感;但對于多粘菌素B,分離來源于南美白對蝦的副溶血性弧菌卻表現(xiàn)為完全敏感,而其他分離來源的菌株卻表現(xiàn)出一定程度的耐藥。

圖1 菌株來源與耐藥性關(guān)聯(lián)分析Fig.1 Analysis on the relationship between strains isolation and antibiotic resistance

2.3 多重耐藥性分析

根據(jù)副溶血性弧菌溶血毒素致病基因不同將菌株分為四種類型:tdh+/trh-/tlh+,tdh-/trh+/tlh+,tdh+/trh+/tlh+和tdh-/trh-/tlh+[13]。由圖2可以看出tdh-/trh+/tlh+和tdh-/trh-/tlh+類型的菌株耐藥譜最復雜。菌株多重耐藥性與致病基因類型可能存在一定的關(guān)聯(lián),其中tdh-/trh+/tlh+有促使副溶血性弧菌對更多抗生素產(chǎn)生耐藥性的可能。

圖2 菌株致病基因類型與多重耐藥性的關(guān)聯(lián)分析Fig.2 The strains of the pathogenic types and proportion of multi-drug resistance

2.4 Heat-map菌株耐藥分析情況

本研究使用Heat-map清晰地呈現(xiàn)副溶血性弧菌菌株的耐藥譜(圖3)。其對青霉素G和甲硝唑的耐藥率達到100%,但對帕拉西林、新霉素、卡那霉素和氨芐西林的抗性更強;而本研究中分離得到的副溶血性弧菌菌株對利福平、四環(huán)素、強力霉素、舒巴坦/氨芐西林和氯霉素的敏感度較高。

圖3 47株副溶血性弧菌對25種抗生素的耐藥性熱圖分析Fig.3 The antibiotic resistance heat map of 47 Vibrio parahaemolyticus strains to 25 kinds of antibiotics

菌株4與29間,5與45間,11與15間,17與23間,18與39間耐藥譜高度相似,其中菌株4、5、11、17、18均分離自日本沼蝦,而菌株15分離自斑節(jié)對蝦,23分離自白米蝦,29分離自羅氏沼蝦,39、45分離自南美白對蝦,可見分離來源于日本沼蝦的菌株與其它分離來源的菌株間出現(xiàn)相似性,推測可能是養(yǎng)殖環(huán)境所導致。

分離自日本沼蝦的菌株20與分離自病人的菌株46的耐藥譜也出現(xiàn)一定程度的相似性,均對青霉素類、氨基糖苷類和其它類三大類抗生素表現(xiàn)出較強的耐藥性。早期認為,細菌耐藥性的出現(xiàn),與抗生素作用位點的點突變有關(guān),但隨著抗生素的濫用情況日趨嚴重,點突變的發(fā)生率已無法解釋細菌多重耐藥性的普遍發(fā)生,因此,細菌可移動遺傳元件可以在同種或不同種菌株間水平轉(zhuǎn)移,成為多重耐藥性產(chǎn)生的主要原因[14];而從另一個角度分析,人們?nèi)狈φ_使用抗生素的意識,意大利學者的一項調(diào)查中顯示,26.9%的人不清楚抗生素的濫用會導致細菌耐藥[15]。

3 結(jié)論與討論

目前,抗生素的濫用、亂用加重了細菌耐藥性的問題,特別是由于多重耐藥菌株感染而導致死亡的報道逐年增加[16],引起了世界廣泛的關(guān)注,已成為世界性的難題[17]。食源性致病菌的耐藥性對食品安全以及人類身體健康的影響已經(jīng)引起了人們的重視[18]。本研究從養(yǎng)殖業(yè),醫(yī)療等領(lǐng)域可能使用的抗生素中選取了25種抗生素進行了耐藥性實驗,結(jié)果表明無論從水產(chǎn)品還是病人中分離到的副溶血性弧菌都存在一定程度的耐藥問題,且菌株耐藥譜有顯著差異,因此菌株多重耐藥性的產(chǎn)生具有復雜性和多樣性。

農(nóng)業(yè)部對養(yǎng)殖中抗生素的使用有嚴格的規(guī)定,其中氯霉素、萬古霉素、頭孢噻吩、頭孢拉定和利福平均為禁用抗生素[19],實驗結(jié)果表明(表2),菌株對萬古霉素、頭孢拉定和利福平未產(chǎn)生耐藥性,而氯霉素的耐藥率為2.12%,出現(xiàn)1株耐藥、46株敏感,細菌耐藥性的出現(xiàn)可能是細菌自身的原因[20];頭孢噻吩的耐藥率為4.26%,出現(xiàn)2株耐藥、18株中介、27株敏感,可能是由于違規(guī)排放而導致養(yǎng)殖環(huán)境中出現(xiàn)該抗生素,也可能是由于養(yǎng)殖過程中抗生素違規(guī)使用。2015年9月1日,農(nóng)業(yè)部發(fā)布2292公告,禁用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星等四種抗生素。四者都屬于第三代喹諾酮的氟喹諾酮類基本藥物,在人類醫(yī)療中占有較重地位[21]。本研究連續(xù)兩年監(jiān)測結(jié)果顯示,針對NOR(諾氟沙星),47株副溶血性弧菌的耐藥情況為,21株耐藥、17株中介、9株敏感,耐藥率高達44.68%。

近來,有不少抗生素的輔助試劑相繼研發(fā)問世,也從側(cè)面反映出由于耐藥性的產(chǎn)生而導致抗生素的藥效下降,甚至失效等問題[22]。本研究通過連續(xù)兩年對上海某水產(chǎn)品市場的監(jiān)測結(jié)果表明,上海市售水產(chǎn)品中副溶血性弧菌已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥性,且不同分離來源的菌株耐藥譜存在一定的差異。及時了解掌握細菌的耐藥性情況,對指導農(nóng)業(yè)和醫(yī)學領(lǐng)域合理應用抗生素,提高療效,維持細菌對抗生素的敏感性,減少耐藥菌株的產(chǎn)生具有重大意義。

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Serveillance and analysis on drug-resistance ofVibrioparahaemolyticusisolated from the commercial aquatic products in markets of Shanghai

LU Yi1,CHEN Wei-yi1,LIU Hai-quan1，2，3，*,XIE Jing1，2,3,ZHAO Yong1,2,3,*,SUN Xiao-hong1,2,3

(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China; 2.Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing & Preservation,Shanghai 201306,China; 3.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Product on Storage and Preservation(Shanghai),Ministry of Agriculture Shanghai 201306,China)

TheaimofthisstudywastosurveyandanalyzetheantibacterialresistanceofVibrio parahaemolyticus,whichwereisolatedfromthecommercialaquaticproductsinShanghaimarkets. 45 V. parahaemolyticusstrainswereisolatedintwoyears,andalltheisolateswerecarriedoutfor25kindsofantibioticsusceptibilitypatternusingmodifiedKirby-Bauerdiskdiffusionmethod.TheresultsshowedthatallstrainswereresistancetoPenicillinGandMetronidazole.Morethan90%oftheV. parahaemolyticusisolateswereresistanttoPiperacillin,NeomycinandKanamycin,andallstrainsweresensitivetoRifampicin,Vancomyci,Tetracycline,Doxycycline,CephradineandOxytetracycline.Moreover,antibioticresistancepatternsofthestrainsexistedacertaindifferencesamongisolationorigin.Andtherewasacertainrelationbetweenthemulti-drugresistanceandpathogenictypesofthestrains.Forthisreason,itisimportanttotakemeasurestostrengthenmonitortheantibacterialresistanceofV. parahaemolyticusinthecontaminatedaquaticproducts.

aquaticproducts;Vibrio parahaemolyticus;antibioticresistance

2016-04-25

盧奕(1995- )，女，本科，研究方向：食品安全風險評估，E-mail:cindy.luyi@foxmail.com。

*通訊作者:劉海泉(1980- )，男，博士，講師，研究方向：食品安全，E-mail:hqliu@shou.edu.cn。 趙勇(1975- )，男，博士，教授，研究方向：食品安全與生物技術(shù)，E-mail:yzhao@shou.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目(31271870, 31571917，31671779)；上海市科委計劃項目(14DZ1205100，14320502100)；上海市科技興農(nóng)重點攻關(guān)項目(滬農(nóng)科攻字2014第3-5號、2015第4-8號、2016第1-1號)；上海市教委曙光計劃(15SG48)；上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心(11DZ2280300)。

TS254.2

A

1002-0306(2016)19-0271-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.045