杏鮑菇超氧化物歧化酶部分酶學性質研究

陳國忠,程仕偉,祝 玲,劉艷玲,程顯好,劉進杰,*

(1.魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025;2.魯東大學農(nóng)學院,山東煙臺 264025)

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杏鮑菇超氧化物歧化酶部分酶學性質研究

陳國忠1,程仕偉1,祝 玲1,劉艷玲1,程顯好2,劉進杰1,*

(1.魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025;2.魯東大學農(nóng)學院,山東煙臺 264025)

研究了杏鮑菇不同部位超氧化物歧化酶(SOD)活力的差異,以及pH、溫度、金屬離子和有機試劑對SOD酶活性的影響。結果表明:菌蓋和菌褶SOD酶活力顯著高于菌柄,外皮高于心部;杏鮑菇SOD在pH5～8范圍內活性穩(wěn)定,具有良好的耐熱性;Cu2+、Zn2+、Fe2+和Mn2+對SOD酶活力具有不同程度的激活作用,其中Cu2+的激活作用最突出;甲醇、乙醇和正丁醇對SOD活性的影響均為低濃度激活、高濃度抑制,而丙酮則表現(xiàn)出抑制作用?？梢娦吁U菇SOD酶活力受到pH、溫度、金屬離子和有機溶劑等多種因素的影響。

杏鮑菇,超氧化物歧化酶,酶活力,影響因素

超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于生物體中的一類金屬酶,它能有效清除體內的氧自由基,增強機體抗輻射損傷能力,防御氧毒性,抗衰老,在一些腫瘤、炎癥、自身免疫疾病等治療中有良好的療效[1]。SOD存在分子量大、半衰期短、易失活等缺點,在提取、儲存和使用過程中受到pH、溫度、金屬離子和有機溶劑等多種外界因素的影響[2]。楊學山等發(fā)現(xiàn)金屬離子在體外對羊血SOD酶活產(chǎn)生激活或抑制作用[3],海藻糖對羊血SOD活性有明顯的激活和保護作用[4]。謝曉蘭等發(fā)現(xiàn)甲醇、乙醇、正丙醇等有機溶劑的存在均引起酶構象的改變,對豬血SOD酶活力表現(xiàn)出激活或抑制作用[5]。目前相關研究大多集中在動物來源SOD上,是因為長期以來動物血液一直是提取SOD的主要原料[6]。然而由于各種病源及外源污染,國際社會已禁止從動物血液中提取SOD用于人體,于是近年來研究者將目光投向了植物[7-8]和微生物[9-10]。

杏鮑菇、雙孢蘑菇等食用菌SOD的提取分離和部分性質已有文獻報道[11-13]。研究者發(fā)現(xiàn),杏鮑菇SOD熱穩(wěn)定性突出[14],且4 ℃貯藏18 d SOD活性基本保持不變[15],具有良好的開發(fā)應用前景。本文比較了不同部位杏鮑菇SOD酶活力的差異,考察了pH、溫度、金屬離子和有機溶劑對杏鮑菇SOD活性的影響,對于杏鮑菇SOD的生產(chǎn)加工和貯藏使用等具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇 超市；Tris、NBT、鄰苯三酚、甲硫氨酸等試劑 均為分析純；核黃素 惠興生化試劑有限公司。

CP214電子天平 奧豪斯儀器(上海)有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;KQ-500DB數(shù)控超聲波破碎儀 昆山市超聲儀器有限公司;PhilipsHR2004/70攪拌機 飛利浦電子香港有限公司;5810R離心機 上海艾本德生物技術國際貿(mào)易有限公司;4000Lx熒光燈 深圳市諾銳軟管有限公司;XMTD-2MA電熱恒溫水浴鍋 龍口市先科儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇SOD的提取 取新鮮杏鮑菇10.00 g,切成2 mm左右的小塊,放入攪拌機中,加入0.05 mol/L pH7.6磷酸緩沖液30 mL,粉碎至糊狀,全部轉移至250 mL燒杯中,置于超聲波破碎儀中120 W處理5 min,4 ℃ 10000 r/min離心10 min,取上清液,加入0.25體積的氯仿-乙醇(3∶5,v/v)混合液攪拌15 min,5000 r/min離心15 min,上清液加入等體積的冷丙酮,攪拌15 min,5000 r/min離心15 min,沉淀溶于0.05 mol/L pH7.6磷酸緩沖液中,得SOD粗酶液。

1.2.2 杏鮑菇SOD的純化 將杏鮑菇SOD粗酶液上DEAE-FF柱(1.5 cm×50 cm),用0.05 mol/L Tris-HCl洗脫液(pH7.6)洗脫,流速60 mL/h,每管收集5 mL,測定酶活,合并酶活力吸收峰,超濾濃縮,10000 r/min離心10 min,棄去沉淀取上清液上Sephadex G-100柱(1.0 cm×50 cm),用0～100 mmol/L Tris-HCl洗脫液進行梯度洗脫,流速為20 mL/h,每管收集3 mL,合并酶活力吸收峰得SOD純化酶液,置于-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 杏鮑菇SOD酶活影響因素的研究 杏鮑菇不同部位SOD酶活的比較:分別取杏鮑菇的菌蓋、菌褶、菌柄、外皮(表層以下2～3 mm)和心部10.00 g,按1.2.1步驟提取SOD得粗酶液,測定酶活力。

pH對杏鮑菇SOD酶活的影響:分別配制pH3、4、5、6、7、8、9、10、11的Tris-HCl緩沖液,加入等體積SOD純化酶液,于25 ℃水浴保持2 h,測定酶活力。

溫度對SOD活性的影響:取1.0 mL SOD純化酶液于試管中,分別置于20、40、60、80、100 ℃水浴鍋中,每隔10 min取出1管測定SOD酶活力。

金屬離子對SOD活性的影響:在SOD純化酶液中分別加入CuSO4、ZnSO4、FeSO4和MnSO4溶液,使得酶液中金屬離子的終濃度梯度為0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0 mmol/L,充分混勻后靜置1 h,分別測定酶活力。

有機溶劑對杏鮑菇SOD活性的影響:在SOD酶液中分別加入不同比例的甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮,酶液與有機溶劑的比例分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2,最終反應體系中有機溶劑濃度分別為25%、33%、50%、67%,充分混勻后靜置1 h,分別測定酶活力。

1.2.4 SOD酶活力的測定 采用氮藍四唑光還原法[16]測定SOD酶活力。一個酶活力單位定義為將NBT的還原抑制到對照一半(50%)時所用的酶量。取25 mL試管4支,2支為對照管,依次加入0.05 mol/L pH7.8 磷酸緩沖液3 mL、130 mmol/L Met溶液0.6 mL、750 μmol/L NBT溶液0.6 mL、100 μmol/L EDTA-Na2溶液0.6 mL、20 μmol/L 核黃素0.6 mL、酶液0.2 mL(對照以磷酸緩沖液代替)、蒸餾水1.0 mL,混勻后將1支對照管放置暗處,其他各管于4000 Lx熒光燈下反應20 min,要求各管受光情況一致,反應溫度控制在25～35 ℃之間,視酶活性高低適當調整反應時間。反應結束后,以不照光的對照管做空白,分別測定其他各管的吸光度,按下式計算SOD活性:

式中:A0為照光對照管的吸光度;As為樣品管的吸光度;VT為樣液總體積(ml);V1為測定時樣品用量(ml);mf為樣品鮮重(g)。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)以3個平行組數(shù)據(jù)的平均值表示,并計算標準偏差。用Origin8.0作圖,SPSS(19.0)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,采用ANOVA進行Duncan’s差異分析,以p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇不同部位SOD酶活力的比較

分別取杏鮑菇的菌蓋、菌褶、菌柄、外皮(表層以下2～3 mm)和心部,提取SOD檢測酶活力。由圖1可知,杏鮑菇不同部位SOD酶活力不同。菌蓋部分的SOD酶活力最高,菌柄則最低,外皮SOD酶活力高于心部。這可能與杏鮑菇的形態(tài)特征和SOD的生物學功能有關。SOD的主要功能是清除細胞內由于線粒體氧化呼吸作用產(chǎn)生的一些超氧化物。菌蓋和外皮位于杏鮑菇的最外層,與空氣接觸面積最大,含有較多的SOD以清除產(chǎn)生的自由基,而菌柄部分埋在土里,與空氣接觸較少,呼吸作用沒有菌蓋旺盛,相應的含SOD也較少[17]。

圖1 杏鮑菇不同部位SOD酶活力Fig.1 SOD activity from various parts of Pleurotus eryngii注:不同小寫字母代表差異顯著(p<0.05)。

圖2 pH對SOD酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on SOD activity

2.2 pH對杏鮑菇SOD活性的影響

考察了不同pH條件下杏鮑菇SOD活性。由圖2可知,在pH3～8范圍內,SOD酶活力隨pH升高而增大,在pH8時酶活力達到最高,此后隨著pH升高SOD酶活力迅速下降。在pH5～8范圍內酶活力較高,穩(wěn)定性較好,表明杏鮑菇SOD對pH的適應范圍較廣。這與文獻報道其它來源SOD的酸堿穩(wěn)定性相似[18-19]。

2.3 溫度對SOD活性的影響

研究了杏鮑菇SOD酶活力在不同溫度下隨時間的變化規(guī)律。由圖3可以看出,杏鮑菇SOD酶活力在20 ℃條件下可保持較長時間無顯著降低,但隨著溫度升高和時間延長酶活力呈下降趨勢。不過與其它類型SOD[15]相比,杏鮑菇SOD屬于耐溫型,其熱穩(wěn)定性高,在100 ℃條件下處理50 min后SOD酶活力仍能保留48.30%。除了杏鮑菇SOD本身的熱穩(wěn)定性之外,杏鮑菇含有較高含量的海藻糖[20],可能對SOD產(chǎn)生激活和保護作用[4]。由此可見,低溫貯存有利于SOD酶活力的保持[21]。

圖3 溫度對SOD酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on SOD activity

2.4 金屬離子對SOD活性的影響

SOD是一種金屬酶,金屬離子對維持酶的分子結構及催化活性有重要作用[22-24]。根據(jù)金屬輔基的不同,可將SOD分為3 類:Cu·Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD。根據(jù)文獻報道,杏鮑菇SOD主要類型為Mn-SOD[25],兼有Cu·Zn-SOD[11]。本文考察了外源添加Cu2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+對杏鮑菇SOD酶活力的影響,結果見圖4。Mn2+對杏鮑菇SOD有激活作用,但是并非最佳的金屬離子激活劑,Cu2+和Fe2+表現(xiàn)出更加顯著的激活作用,特別是當Cu2+濃度為1 mmol/L時SOD酶活力比對照提高了43.70%,此時繼續(xù)增大Cu2+濃度則變化不大。Zn2+濃度在0.01～1 mmol/L之間對SOD活力具有明顯的激活作用,但是當濃度繼續(xù)增大時激活作用明顯減弱,表明只有適宜的Zn2+濃度才能發(fā)揮最佳的激活作用。由此可見SOD酶活力與其金屬輔基的離子濃度并不成正比例關系,類似的研究已有報道,比如楊學山等[3]發(fā)現(xiàn)Cu2+、Zn2+對羊血Cu·Zn-SOD有抑制作用。原因可能是某些金屬離子能和SOD活性中心的金屬輔基發(fā)生誘導、置換等反應形成新的配位化合物,或者發(fā)生拮抗作用,從而激活或抑制酶活性[3]。

圖4 金屬離子對SOD酶活力的影響Fig.4 Effect of metal ions on SOD activity

2.5 有機溶劑對SOD活性的影響

如圖5所示,甲醇、乙醇和正丁醇均表現(xiàn)為在低濃度時對SOD酶活力有激活作用,隨著濃度增加激活作用逐漸增大,達到最大值后激活作用下降,并最終轉變?yōu)橐种谱饔谩＞科湓?可能是因為在低濃度下這3種醇有利于酶與底物的接觸,促進底物和產(chǎn)物的分配和擴散,從而間接提高酶的催化活性;而隨著有機溶劑濃度增加,醇溶解大量的水,破壞酶表面必需的水化層,醇直接與酶作用,破壞酶蛋白活性構型的氫鍵、疏水作用等而導致酶活性降低[26]。丙酮在低濃度時對SOD酶活力的影響并不顯著,但在其濃度高于25%之后表現(xiàn)出抑制作用。關于丙酮影響SOD酶活力的研究未見報道,推測其作用原理可能是丙酮破壞酶分子表面的水化層導致酶失活。

圖5 有機溶劑對SOD酶活力的影響Fig.5 Effect of organic solvent on SOD activity

3 結論

SOD酶是一類重要的抗氧化金屬酶,其活性分布在杏鮑菇中表現(xiàn)出不均一性,外皮>心部,菌蓋>菌褶>菌柄,盡管如此生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的邊角料仍有較高的利用價值。杏鮑菇SOD在pH5～8之間酶活力較高,pH小于5或大于8活性顯著降低。高溫環(huán)境不利于SOD酶活力的保存,但相比文獻報道中其他動植物來源的SOD,杏鮑菇SOD表現(xiàn)出良好的溫度耐受性,在貯存和加工過程中有利于延長SOD產(chǎn)品的有效期。Cu2+、Fe2+和Zn2+對杏鮑菇SOD的激活作用明顯高于Mn2+,表明添加適量濃度的外源金屬離子能夠提高SOD酶活力,其類型與金屬輔基并不一致,如何選擇合適的金屬離子作為SOD激活劑需要進一步的理論和實驗研究。低濃度甲醇、乙醇和正丁醇對SOD活性有激活作用,表明適宜濃度的有機溶劑比水更適合作為SOD的催化反應體系。

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Study on properties of superoxide dismutase activity fromPleurotuseryngii

CHEN Guo-zhong1,CHENG Shi-wei1,ZHU Ling1,LIU Yan-ling1,CHENG Xian-hao2,LIU Jin-jie1,*

(1.College of Life Science,Ludong University,Yantai 264025,China; 2.College of Agriculture,Ludong University,Yantai 264025,China)

Superoxidedismutase(SOD)activityindifferentpartsofPleurotus eryngiiwascompared.SeveralfactorsaffectingthestabilityofSODincludingpH,temperature,metalionsandorganicreagents,werestudied.TheresultsshowedthatSODenzymeactivitiesinpileusandgillwerehigherthanthatinstipe,theskinhigherthancoresection.ThisenzymedisplayedgoodstabilityatthepHrangefrom5to8andgoodthermalstability.Cu2+,Zn2+,Fe2+andMn2+showeddifferentdegreesofactivationonSODenzymeactivity,inwhichtheactivationofCu2+wasthemostprominent.Methanol,ethanolandn-butylalcoholshowedactivationinlowconcentrationbutinhibitoryeffectinhighconcentration,whileacetoneshowedinhibitoryeffect.ThereforeSODactivityofPleurotus eryngiiwereinfluencedbymanyfactorsincludingpH,temperature,metalionsandorganicsolvents.

Pleurotus eryngii;superoxidedismutase(SOD);enzymeactivity;influencefactors

2016-04-25

陳國忠(1980-)，男，博士，講師，研究方向：生物化學工程，E-mail：guozhongch@126.com。

*通訊作者:劉進杰(1978-)，女，碩士，講師，研究方向：食品工程，E-mail：jinjie78@126.com。

魯東大學科研基金項目(27710301);城新創(chuàng)新基金(CXJ-06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)19-0176-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.026