不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖抗氧化活性研究

劉玉鳳,賈淑穎,劉飛飛,郝再彬,李 霞

(廣西高校食品安全與檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西桂林 541004)

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不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖抗氧化活性研究

劉玉鳳,賈淑穎,劉飛飛,郝再彬,李 霞*

(廣西高校食品安全與檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,廣西桂林 541004)

采用氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法進(jìn)行多糖的硫酸化修飾,獲得不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖,通過測定硫酸化腸滸苔多糖對DPPH自由基,羥基自由基,超氧陰離子的清除能力和還原能力,考察了腸滸苔多糖取代度與抗氧化活性的關(guān)系。結(jié)果表明,取代度的大小受到硫酸化溫度、硫酸化時間、DMF用量、氨基磺酸用量等的影響,其中氨基磺酸用量的影響最顯著。隨著取代度增大,腸滸苔多糖的抗氧化性先增強(qiáng)后減小,取代度在0.8～1.2范圍內(nèi),腸滸苔多糖的抗氧化性較強(qiáng),表明適度進(jìn)行硫酸化修飾是提高腸滸苔多糖抗氧化活性的有效方式。

腸滸苔多糖,取代度,抗氧化活性

滸苔多糖是天然無毒的生物大分子物質(zhì)之一,具有抗腫瘤、抗氧化、免疫活性調(diào)節(jié)、降血壓血脂等生物活性[1-4]。滸苔多糖的生物活性受其結(jié)構(gòu)、分子量等的影響,通過對滸苔多糖結(jié)構(gòu)修飾可以改變多糖的空間結(jié)構(gòu)、分子量及取代基種類、數(shù)目和位置從而改變其生物活性[5]。結(jié)構(gòu)修飾的方法有很多,包括化學(xué)法、物理法和生物法,其中硫酸化是一個頗為常用且有效的修飾手段[6]。多糖硫酸化常用的方法有濃硫酸法、氯磺酸-吡啶法、三氧化硫-吡啶法、氯磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法(DMF)、氨基磺酸-吡啶法、氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法等[7-12]。這些方法的原理可以簡單的概括為:溶解或分散于一定溶劑體系中的多糖與相應(yīng)的硫酸酯化試劑在一定的條件下反應(yīng),使得單糖殘基上的某些羥基接上硫酸基團(tuán)[12]。研究表明,硫酸化修飾后可以改變多糖的抗氧化[13-15]、免疫[16]、抗病毒[17-19]、抗腫瘤[20-21]等生物活性,但只有適度的硫酸化才能得到生物活性較強(qiáng)的硫酸化多糖[22-23]。氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法與其他方法相比,具有原料廉價,反應(yīng)條件溫和,操作簡單的特點(diǎn)[12],所以本實(shí)驗(yàn)采用此方法修飾腸滸苔多糖結(jié)構(gòu),并比較了腸滸苔多糖硫酸化后取代度大小對其抗氧化活性的影響,探究其變化規(guī)律,為腸滸苔多糖的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)材料腸滸苔(Enteromorphaintestinalis)采于中國浙江杭州灣。

氨基磺酸、硫酸鉀 天津博迪化工股份有限公司;無水乙醇、氯化鐵、三氯乙酸、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 西隴化工股份有限公司;2-脫氧-D-核糖 上海藍(lán)季生物;DPPH 東京化成工業(yè)株式會社;K3Fe(CN)6廣東興華化學(xué)廠有限公司;鄰苯三酚 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;硫代巴比妥酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;明膠 Sigma公司,分析試劑均為分析純。

EL303型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A 上海亞榮生化儀器廠;UV760CRT型紫外可見分光光度計 上海傲譜分析儀器有限公司;DL-5-B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;XH-300A祥鵠電腦微波超聲波組合合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司;FD-1B-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;RET basic(安全控制型)加熱磁力攪拌器 德國IKA公司;傅里葉紅外光譜分析儀Nicolet iS 10,美國Thermo Fisher公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 腸滸苔多糖提取 取腸滸苔樣品,按液料比1∶30加入去離子水,在功率500 W,浸提時間15 min,浸提溫度90 ℃的提取條件下微波提取2次。提取液離心,得到上清液。將上清液濃縮,加無水乙醇醇沉,然后離心,取沉淀,冷凍干燥,得腸滸苔粗多糖(Enteromorphaintestinalispolysaccharides,EIP)[24]。

1.2.2 硫酸化腸滸苔多糖的制備 腸滸苔多糖硫酸化參照劉昱均[12]等的報道采用氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法并稍作調(diào)整。量取50 mL N,N-二甲基甲酰胺于三頸瓶中,加入100 mg腸滸苔多糖樣品,于KQ-500型超聲波清洗器在功率100 W,室溫的條件下超聲震蕩至多糖溶解。用恒溫磁力攪拌器攪拌升溫到80 ℃后,加入2.5 g氨基磺酸,升溫至100 ℃,在100 ℃條件下攪拌反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后,向瓶內(nèi)加入冰水終止反應(yīng),調(diào)pH7,對流水透析3 d,蒸餾水透析1 d,凍干得硫酸化后腸滸苔多糖(Enteromorphaintestinalispolysaccharides A,EIPA)。

1.2.3 紅外光譜分析 分別稱取2 mg 對EIP和EIPA加入150 mg干燥的KBr于瑪瑙研缽中,在白熾燈下干燥研磨均勻,壓片成均勻透明、無明顯顆粒,于傅里葉紅外光譜分析儀Nicolet iS 10(光譜分辨率優(yōu)于0.4 cm-1)進(jìn)行紅外光譜分析,測定范圍為4000～400 cm-1。

1.2.4 EIP硫酸化單因素實(shí)驗(yàn) 以取代度(DS)為考察指標(biāo),選取硫酸化溫度(A)、硫酸化時間(B)、DMF用量(C)、氨基磺酸用量(D)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

硫酸化溫度(A):設(shè)定EIP 100 mg,氨基磺酸0.5 g,DMF 50 mL,硫酸化溫度為60、70、80、90、100 ℃,反應(yīng)1 h。

硫酸化時間(B):設(shè)定EIP 100 mg,氨基磺酸0.5 g,DMF 50 mL,硫酸化溫度為100 ℃,硫酸化時間為1、2、3、4、5 h。

DMF用量(C):設(shè)定EIP 100 mg,氨基磺酸0.5 g,硫酸化溫度為100 ℃,DMF用量為20、30、40、50、60 mL,反應(yīng)1 h。

氨基磺酸用量(D):設(shè)定EIP 100 mg,DMF 50 mL,硫酸化溫度為100 ℃,氨基磺酸用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g,反應(yīng)1 h。

1.2.5 腸滸苔多糖硫酸根含量測定 腸滸苔多糖中硫酸根的含量采用BaCl2-明膠比濁法[25]測定。

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 制備0.1 mg/mL K2SO4標(biāo)準(zhǔn)液;分別取0.0,0.2,0.4,0.6,1.2,1.6 mL(每管做3個平行)。加去離子水補(bǔ)到1.6 mL,加三氯乙酸(8%水溶液)1.4 mL,BaCl2明膠溶液1.4 mL,混合,靜置15 min。360 nm波長測吸光度,三組平行管取平均值,以硫酸鉀質(zhì)量為橫坐標(biāo),吸光度平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2 樣品中硫酸根含量的測定 實(shí)驗(yàn)組:稱取樣品3 mg,放入帶蓋可密封的小瓶,加3 mL 1 mol/L HCl,100 ℃水解6 h,內(nèi)容物50 ℃蒸干(用蒸發(fā)皿,無水乙醇促揮發(fā)),用2 mL去離子水溶解。取水解液0.4 mL加蒸餾水補(bǔ)到1.6 mL,加三氯乙酸(8%水溶液)1.4 mL,BaCl2明膠溶液1.4 mL,混合(同時做3組平行組),靜置15 min。360 nm波長條件下測定吸光度值A(chǔ)1。

對照組:對照組操作同上,每個樣品做一管,用1.4 mL的明膠溶液代替BaCl2明膠溶液。360 nm波長測定吸光度值A(chǔ)2。

所求吸光度A0=A1-A2,A1-A2目的是消除水解液中所含自外吸收物質(zhì)的影響。由A0根據(jù)硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線可計算出硫酸鉀的質(zhì)量。

1.2.6 EIPA硫酸化取代度的計算 取代度計算公式:DS=(1.62×S)/(32-1.02×S)[12]。其中,S-樣品中硫的質(zhì)量分?jǐn)?shù),(%)。

1.2.7 腸滸苔多糖的抗氧化活性測定 通過測定硫酸化腸滸苔多糖對DPPH自由基,羥基自由基,超氧陰離子的清除能力和還原能力來判斷腸滸苔多糖的抗氧化活性[26-27]。本實(shí)驗(yàn)旨在比較不同取代度硫酸化腸滸苔多糖的抗氧化活性,選取取代度為0.43、0.56、0.61、0.72、0.81、0.90、0.95、1.00、1.14、1.42、1.53、1.66的硫酸化腸滸苔多糖進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)。將抗壞血酸(VC)粉末、硫酸化前腸滸苔多糖凍干樣品EPI和硫酸化后不同取代度的腸滸苔多糖凍干樣品EPIA分別用去離子水配制成0、0.016、0.08、0.4、2、10 mg/mL等6種不同濃度。

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力測定 量取配制好的待測樣品2.0 mL,加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液(無水乙醇做為溶劑),在室溫下混勻后避光反應(yīng)0.5 h,在波長517 nm處測定其吸光值A(chǔ)i;同時測定無水乙醇(2.0 mL)和DPPH(2.0 mL)混合液的吸光值A(chǔ)c,無水乙醇(2.0 mL)和待測樣品(2.0 mL)混合液的吸光值A(chǔ)j。則DPPH自由基清除率計算公式:K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

1.2.7.2 還原性能力測定 量取配制好的待測樣品0.5 mL于試管,依次加入0.5 mL的1% K3Fe(CN)6溶液與0.5 mL PBS溶液(0.2 mol/L,pH6.7),于50 ℃水浴反應(yīng)20 min后立即冷卻,依次加入0.5 mL 10% TCA溶液,0.5 mL 0.1% FeCl3溶液和2.0 mL去離子水,充分搖勻,靜置10 min,在波長700 nm下?lián)u勻測定其吸光度值A(chǔ),以抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.7.3 羥基自由基清除能力測定 取0.2 mL的FeSO4-EDTA混合液(10 mmol/L)于帶塞試管中,加入0.2 mL的α-脫氧核糖溶液(20 mmol/L),然后再加入0.2 mL配制好的待測樣品,并用磷酸緩沖液(pH7.4)定容至1.8 mL,然后加入0.2 mL的H2O2(10 mmol/L),40 ℃恒溫水浴1 h,加入1 mL 2.8%的三氯乙酸終止反應(yīng),再加入1 mL 1%硫代巴比妥酸,混勻之后于沸水浴中加熱10 min,冷卻后于532 nm處測光吸收值A(chǔ)s。以去離子水為陰性對照,測定吸光值A(chǔ)0,抗壞血酸為陽性對照,測定吸光值A(chǔ)c。則樣品的自由基清除能力(Scavenging Activity,SA)可表示為:SA(%)=[1-(As-A0)/(Ac-A0)]×100

1.2.7.4 超氧陰離子清除能力測定 精確量取4.5 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L,pH8.2)于試管,在25 ℃溫水中預(yù)熱20 min,之后依次加入同樣預(yù)熱條件下預(yù)熱的鄰苯三酚溶液(25 mmol/L)0.3 mL和配制好的待測樣品0.2 mL,并迅速混勻倒入比色皿,波長319 nm處測定吸光度At,每30 s測一次,測定8次。以去離子水作為空白對照,同樣操作條件下測定并計算出鄰苯三酚自氧化速率V0。以At為縱坐標(biāo),時間為橫坐標(biāo)作圖,計算斜率Vt。超氧陰離子自由基清除率計算公式:Y(%)=(1-Vt/V0)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 EIP和EIPA紅外光譜分析

將EIP和EIPA進(jìn)行紅外表征,測定紅外光譜波長范圍為400～4000 cm-1,結(jié)果見圖1。

圖1 滸苔多糖紅外光譜Fig.1 IR spectrum of E. intestinalis polysaccharides

2.2 硫酸化單因素實(shí)驗(yàn)

采用BaCl2-明膠比濁法測定腸滸苔多糖中硫酸根含量,以硫酸根含量為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.2287x+0.0043,R2=0.9993。

采用氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法按照單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計硫酸化EIP,通過設(shè)計單因素實(shí)驗(yàn)改變硫酸化條件以獲得不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖。由硫酸根標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出EIPA的硫酸根含量以及取代度,以影響因素為橫坐標(biāo),取代度(DS)為縱坐標(biāo),結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知,溫度在80 ℃時EIPA的取代度最高,達(dá)1.66。這說明硫酸化的最適溫度為80 ℃,溫度過低不利于腸滸苔多糖硫酸化,溫度過高可能會破壞糖鏈自身的結(jié)構(gòu)[29]。圖中顯示硫酸化時間越長取代度越高,DMF用量越多取代度越低,可能是由于DMF用量少腸滸苔多糖分散密集,酸度適宜,使得取代度較高[30]。氨基磺酸的用量在2.0 g時的取代度最高,說明氨基磺酸用量太少,可能達(dá)不到反應(yīng)所需的酸性環(huán)境,但酸性過酸是會引起腸滸苔多糖的降解[12]。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,硫酸化100 mg腸滸苔多糖在溫度80 ℃左右,加入20～40 mL DMF,2.0 g左右氨基磺酸,磁力攪拌反應(yīng)4～5 h所得硫酸化腸滸苔多糖取代度比較高。

2.3 腸滸苔多糖的抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖對DPPH自由基的清除率結(jié)果見表1。

圖2 不同因素對取代度的影響Fig.2 Effects of different factors on the DS

表1 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖對DPPH自由基的清除率(%)

Table 1 Scavenging rate of different DS of sulfated polysaccharides fromE.intestinalison DPPH free radicals(%)

取代度質(zhì)量濃度(mg/mL)000160080421016601661±0102222±0253731±0565654±0616437±05815301399±0101195±0223266±0455046±0056137±05014201338±0512013±0923097±0935212±0536171±02111401314±0361971±0043160±0515827±0106587±02610001317±0501422±0282718±0425997±0396880±01109501141±0221930±0513674±0486359±0387288±01309001159±0381141±0692476±0865884±0176763±03808101120±0151365±0072527±0555824±0126559±0280720908±0641204±0102333±0685627±0426467±04606101019±0701705±0873486±0315134±0036144±0300560887±0621861±0442261±0564023±0374937±0640430738±0121120±0152300±0484052±0115648±044VC04173±0314483±0665499±0937984±0328987±045EIP0755±0162047±0343041±0574555±0294937±017

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,EIPA對DPPH自由基的清除隨著濃度的增大而增大,但在濃度大于2.0 mg/mL后其清除DPPH自由基的能力變化趨于平緩,相比于抗壞血酸VC,EIPA的清除能力略低。但硫酸化后,EIPA對DPPH自由基的清除效果比EIP明顯提高,并且隨著取代度的增加,EIPA對DPPH自由基的清除能力呈增大趨勢,質(zhì)量濃度為2、10 mg/mL取代度為0.95時,對DPPH自由基的清除效果最好,當(dāng)取代度大于0.95時,EIPA對DPPH自由基的清除能力有所下降。

2.3.2 還原能力測定結(jié)果 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖的還原能力結(jié)果見表2。

表2 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖的還原能力

Table 2 The reducing power of different DS of sulfated polysaccharides fromE.intestinalis

取代度質(zhì)量濃度(mg/mL)0001600804210166000086±0001200698±0003201288±0007402744±0001008301±00055153000066±0000700565±0001100997±0002002556±0009103517±00056142000213±0006500613±0002701372±0003203858±0001008486±00144114000279±0003800621±0002101116±0007103951±0005409747±00066100000169±0005201330±0003803858±0003406670±0010113821±00097095000147±0000701175±0008802859±0005606345±0009915147±00123090000122±0003401203±0002002843±0005906479±0007711088±00049081000102±0002901028±0004402170±0002303691±0005209335±00103072000160±0001801176±0006702264±0009904096±0014107031±00028061000164±0001000891±0004301219±0001903413±0005606524±00078056000109±0001000382±0002301014±0000902039±0007805454±00034043000107±0001000335±0000900927±0003902126±0005403390±00050VC002968±0006106889±0005624828±0004426403±0006027103±00089EIP000055±0001500416±0000601225±0003402033±0005503592±00052

表3 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖對羥基自由基的清除率(%)

Table 3 Scavenging rate of different DS of sulfated polysaccharides fromE.intestinalison hydroxyl free radicals(%)

取代度質(zhì)量濃度(mg/mL)00016008042101660889±0641294±0113095±0714100±0784299±0101530551±038749±0331055±0073478±0133785±0231420636±014709±54818±0272891±0253167±0121140751±010758±043820±0043280±0893488±0561000864±0321190±0312155±0514278±0254785±0580950864±0101210±0312757±0144967±0585495±0790900676±021990±0241155±0103978±0504685±0330810676±012790±0401155±0183148±0234922±0620720614±007690±077955±0163378±0493385±0430610789±0461146±0382580±0434158±0674458±0920560363±005900±641355±0462778±0783050±0450430676±052290±571346±0522078±0112685±067VC05178±0786278±0567735±0549279±0879530±091EIP0301±003812±0311873±0383035±0103877±044

表4 不同取代度的硫酸化腸滸苔多糖對超氧陰離子的清除率(%)

Table 4 Scavenging rate of different DS of sulfated polysaccharides fromE.intestinalison superoxide anion(%)

取代度質(zhì)量濃度(mg/mL)000160080421016601518±0232046±0342473±0442930±0473372±01815301990±0602047±0132193±0492663±0233260±05414201089±0471176±0151421±0672279±0182663±01311402030±0252379±0062496±0112936±0223658±04810002106±0112187±0482663±0142931±0193754±02409503037±0103267±0583522±0274013±0734536±04209002172±0562184±0032285±0322656±0223670±02908102006±0112116±0502192±0352301±0333754±01207201833±0092006±0462598±0082826±0243479±01006101028±0141076±0541248±0241761±0542616±04305601218±0031821±0462053±0052252±0262652±01404302188±0052256±0552294±0412507±0342574±067VC01808±0561965±0423153±0888821±0789947±050EIP0966±0051149±0361149±0072415±0292480±032

EIPA的還原能力與其吸光度值呈正相關(guān),吸光度值越大其還原能力就越強(qiáng)。因此通過比較吸光度值的大小,可以反映出多糖的抗氧化活性大小。EIPA有一定的還原能力,而且在濃度范圍內(nèi),還原能力隨著其濃度的增大而增大。但與VC相比,EIPA的還原能力較低,但硫酸化后,EIPA的還原能力比EIP明顯增強(qiáng),并且隨著取代度的增加,EIPA的還原能力增大,但當(dāng)取代度大于某個值時(如質(zhì)量濃度為10 mg/mL組,取代度大于0.95時),EIPA的還原能力也有所降低。

2.3.3 羥基自由基清除能力測定結(jié)果 硫酸化后滸苔多糖的羥基自由基清除率結(jié)果如表3所示。

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,EIPA對羥基自由基的清除呈線性增長,但在濃度大于2.0 mg/mL時后其清除羥基自由基的能力增長趨于平緩,硫酸化后多糖EIPA對羥基自由基的清除率適當(dāng)濃度的適當(dāng)取代度下(如質(zhì)量濃度為10 mg/mL,取代度為0.95時)能達(dá)到抗壞血酸VC(清除率90%以上)的50%以上,相比于硫酸化前,其清除羥基自由基的能力有所提高。雖然EIPA對羥基自由基的清除效果比EIP有所提高,但提高幅度沒有對DPPH自由基的清除效果和還原能力大,隨著取代度的增加,EIPA對羥基自由基的清除能力增大,但不是取代度越大越好,取代度在0.95左右時,質(zhì)量濃度為2、10 mg/mL EIPA對羥基自由基的清除效果較好,達(dá)50%左右。

2.3.4 超氧陰離子清除能力測定結(jié)果 不同取代度的硫酸化后滸苔多糖對超氧陰離子的清除率,結(jié)果如表4所示。

分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,EIPA有一定的清除超氧陰離子的能力,并且清除超氧陰離子的能力隨著濃度的增大而增大,但在濃度達(dá)到2.0 mg/mL時其清除超氧陰離子的能力增長趨于平緩,清除率達(dá)40%左右。EIPA對超氧陰離子的清除效果比EIP有所提高,并且隨著取代度的增加,EIPA對超氧陰離子的清除能力增大,但當(dāng)取代度大于0.95時,EIPA對超氧陰離子的清除能力有所下降。取代度在0.8～1.2范圍內(nèi),腸滸苔多糖的抗氧化性較強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

通過氨基磺酸-N,N-二甲基甲酰胺法對腸滸苔多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,能增加其硫酸根的數(shù)量,改變其糖鏈的結(jié)構(gòu)。硫酸化過程受到硫酸化溫度、硫酸化時間、DMF用量、氨基磺酸用量等的影響,從而影響腸滸苔多糖硫酸根增加的量,即取代度大小。其中,溫度過高,氨基酸用量過多都會使取代度降低。這可能是由于高溫會破壞多糖的結(jié)構(gòu)[28],氨基磺酸用量過多使得反應(yīng)環(huán)境過酸,腸滸苔多糖容易降解[12]。DMF用量多少直接影響腸滸苔多糖的分散和整個反應(yīng)環(huán)境的酸堿度;增長時間有利于硫酸化反應(yīng),但這會使得生產(chǎn)成本增加,降低經(jīng)濟(jì)效益。腸滸苔多糖硫酸化在溫度80 ℃左右,DMF用量范圍20～40 mL,氨基磺酸用量2.0 g左右,4～5 h的反應(yīng)條件所得硫酸化腸滸苔多糖取代度比較高。

硫酸化修飾后腸滸苔多糖對于DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子的清除能力和還原能力均能增強(qiáng)。這與Wang[14]等用氯磺酸法硫酸化修飾白沙蒿多糖并研究其抗氧化活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。在本實(shí)驗(yàn)中,尤其是腸滸苔多糖對DPPH自由基的清除效果和還原能力的增幅比較大,質(zhì)量濃度為2 mg/mL DPPH自由基的清除效果由原來的45.55%增加到了63.59%(取代度0.95),質(zhì)量濃度為2 mg/mL的EIPA還原能力吸光值由0.3592增長到1.5147(取代度0.95),增強(qiáng)效果明顯。隨著取代度增大,腸滸苔多糖的抗氧化性先增強(qiáng)后減小,取代度在0.8～1.2范圍內(nèi),腸滸苔多糖的抗氧化活性較強(qiáng)。此取代度范圍對應(yīng)的腸滸苔多糖硫酸化條件為60～70 ℃左右,DMF用量范圍20～40 mL,氨基磺酸用量1.0～1.5 g左右,反應(yīng)4～5 h。這說明取代度并不是越大越好。適度的硫酸化修飾才是提高腸滸苔多糖抗氧化活性的有效方式。至于取代度過大為何會導(dǎo)致其抗氧化活性下降,其原因尚不得知,需要進(jìn)一步分析其結(jié)構(gòu),研究其抗氧化機(jī)理才能最終確定。

[1]Jiao L L,Li X,Li T B,et al. Characterization and anti-tumor activity of alkali-extracted polysaccharide fromEnteromorphaintestinalis[J]. International Immunopharmacology,2009,9(3):324-329.

[2]盤賽昆,朱強(qiáng),王淑軍,等. 條滸苔多糖的酶法輔助提取及其抗氧化性[J]. 水產(chǎn)科學(xué),2013,32(4):187-191.

[3]Kim J K,Cho M L,Karnjanapratum S,et al.Invitroandinvivoimmunomodulatory activity of sulfated polysaccharides fromEnteromorphaprolifera[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2011,49(5):1051-1058.

[4]孫士紅. 堿提滸苔多糖降血脂作用研究[J]. 中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(15):118-119.

[5]Wang X M,Zhang Z S,Yao Z Y,et al. Sulfation,anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algaeEnteromorphalinza[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,58:225-230.

[6]劉彩芬,劉欣,趙紅紅. 多糖結(jié)構(gòu)修飾方法的研究進(jìn)展[J]. 飼料廣角,2014(18):26-28.

[7]王新宇,遲祥,石亮,等. 2種方法制備硫酸化小刺猴頭菌多糖[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2013,35(6):704-707.

[8]闞國仕,韓璐,陳紅漫,等. 硫酸酯化胡蘿卜多糖工藝及其抗氧化活性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(5):147-151.

[9]Serebrennikova E S,Iozep A A. Sulfation of alginic acid with chlorosulfonic acid in the formamide-1,2-dichloroethane medium[J]. Russian Journal of General Chemistry,2012,82(2):335-337.

[10]楊陽,陳雪峰,李蕊岑. 蘋果擠壓改性水溶性膳食纖維硫酸酯化的修飾[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(1):61-64.

[11]白冶宇,錢建亞. 氨基磺酸法制備硫酸化大麥多糖[J]. 食品科技,2015,40(3):203-208.

[12]劉昱均. 發(fā)酵靈芝多糖的硫酸酯化及其生物活性的研究[D]. 無錫:江南大學(xué),2013.

[13]Zhang Y L,Lu X Y,Fu Z B,et al. Sulphated modification of a polysaccharide obtained from fresh persimmon(DiospyroskakiL.)fruit and antioxidant activities of the sulphated derivatives[J]. Food Chemistry,2011,127(3):1084-1090.

[14]Wang J L,Guo H Y,Zhang J,et al. Sulfated modification,characterization and structure-antioxidant relationships ofArtemisiasphaerocephalapolysaccharides[J]. Carbohydrate Polymers,2010,81(4):897-905.

[15]王文俠,王龍燕,宋春麗,等. 豆渣多糖硫酸酯化工藝條件優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(1):103-107.

[16]Zhang Y L,Lu X Y,Zhang Y N,et al. Sulfated modification and immunomodulatory activity of water-soluble polysaccharides derived from fresh Chinese persimmon fruit[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2010,46(1):67-71.

[17]Liu C M,Chen H J,Chen K,et al. Sulfated modification can enhance antiviral activities ofAchyranthesbidentatapolysaccharide against porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)invitro[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2013,52:21-24.

[18]Yang T H,Jia M,Zhou S Y,et al. Antivirus and immune enhancement activities of sulfated polysaccharide fromAngelicasinensis[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2012,50(3):768-772.

[19]Zhao X N,Hu Y L,Wang D Y,et al. Optimization of sulfated modification conditions of tremella polysaccharide and effects of modifiers on cellular infectivity of NDV[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2011,49(1):44-49.

[20]Wei D F,Wei Y X,Cheng W D,et al. Sulfated modification,characterization and antitumor activities ofRadixhedysaripolysaccharide[J]. International Journal of Biological Macromolecules,2012,51(4):471-476.

[21]Chen S G,Wang J F,Xue C H,et al. Sulfation of a squid ink polysaccharide and its inhibitory effect on tumor cell metastasis[J]. Carbohydrate Polymers,2010,81(3):560-566.

[22]Liu X X,Wan Z J,Shi L,et al. Preparation and antiherpetic activities of chemically modified polysaccharides fromPolygonatumcyrtonemaHua[J]. Carbohydrate Polymers,2011,83(2):737-742.

[23]Cheng J J,Chao C H,Chang P C,et al. Studies on anti-inflammatory activity of sulfated polysaccharides from cultivatedfungi Antrodia cinnamomea[J]. Food Hydrocolloids,2016,53:37-45.

[24]徐銀峰,王斌,蘇傳玲,等. 滸苔多糖的微波輔助提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2011,30(3):211-216.

[25]陳乾,馬天翔,郭宏舉,等. 硫酸鋇-比濁法測定褐藻糖膠中硫酸根的含量[J]. 藥學(xué)實(shí)踐雜志,2012,30(2):118-120.

[26]謝建華. 青錢柳多糖的分子修飾及其生物活性研究[D]. 南昌:南昌大學(xué),2014.

[27]石學(xué)連,張晶晶,王晶,等. 滸苔多糖的分級純化及體外抗氧化活性研究[J]. 中國海洋藥物,2009,28(3):44-49.

[28]張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究技術(shù)(第二版)[M]. 浙江:浙江大學(xué)出版社,1999.

[29]王順春,方積年. 香菇多糖硫酸化衍生物的制備及其結(jié)構(gòu)分析[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報,1999,31(5):594-597.

[30]Mihai D,Mocanu G,Carpov A. Chemical reactions on polysaccharides I. Pullulan sulfation[J]. European Polymer Journal,2001,37(3):541-546.

Antioxidant activity of sulfated polysaccharides with different substituting degrees fromEnteromorphaintestinalis

LIU Yu-feng,JIA Shu-ying,LIU Fei-fei,HAO Zai-bin,LI Xia*

(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection,College of Chemistry and Bioengineering,Guilin University of Technology,Guilin 541004,China)

Enteromorpha intestinalispolysaccharidesweremodifiedbysulfamicacid-N,N-dimethylformamidemethodtopreparedifferentsubstitutiondegree(DS).AndtherelationshipbetweenDSanditsantioxidantactivitywasevaluatedbydeterminingthescavengingabilityofDPPHradical,hydroxylfadical,superoxideanionradicalandreducingpower.TheresultsindicatedthattheDSwasaffectedbysulfatedtemperature,sulfatedtime,dosageofDMFanddosageofsulfamicacid.Thedosageofsulfamicacidwasthemostsignificantfactor.TheantioxidantactivityofE. intestinalispolysaccharideswasincreasedatfirstandthendecreasedwiththeincreasingofDS,andE. intestinalispolysaccharidesshowedgoodantioxidantactivitywhentheDSwasintherangeof0.8～1.2.ItsuggestedthatmoderatesulfatedmodificationwasthemosteffectivemethodtoimprovetheantioxidantactivityofE. intestinalispolysaccharides.

Enteromorpha intestinalispolysaccharides;substitutingdegrees;antioxidantactivity

2015-10-30

劉玉鳳(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性，E-mail：liuyufengdyx@163.com。

*通訊作者:李霞(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：生物大分子的結(jié)構(gòu)和生物活性研究，E-mail：biology754@163.com。

國家自然科學(xué)基金(31200269)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014GXNSFBA118134)；廣西壯藥產(chǎn)業(yè)化工程院科研項(xiàng)目(2014GXZYCYH03)；桂林理工大學(xué)博士科研啟動資金項(xiàng)目資助。

TS201

A

1002-0306(2016)19-0142-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.019