鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶特性的研究

李梅娟,劉 丹,賈 真,陳小藝,方 婷,陳錦權(quán)

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

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鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶特性的研究

李梅娟,劉 丹,賈 真,陳小藝,方 婷,陳錦權(quán)*

(福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,福建福州 350002)

本文研究了鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶(內(nèi)源酶)的性質(zhì)。分別探討了pH、溫度、金屬離子和特異性蛋白酶抑制劑對(duì)內(nèi)源酶活性的影響。結(jié)果表明內(nèi)源酶蛋白質(zhì)含量為125.10 mg/mL。鈉離子在濃度(0～1.36 mol/L)范圍明顯促進(jìn)內(nèi)源酶活性,鈣離子有穩(wěn)定酶活作用,對(duì)酶活無顯著影響,而高濃度的鈉離子,銅離子和鋅離子會(huì)抑制酶活。內(nèi)源酶在最適pH4左右和pH7左右,有較高的酶活和很好的熱穩(wěn)定性,且能被胃蛋白酶抑制劑(Pepstain)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)、胰蛋白酶抑制劑(SBTI)和胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK)抑制。本研究可為縮短傳統(tǒng)制作鮑魚醬油發(fā)酵時(shí)間提供理論依據(jù)。

鮑魚內(nèi)臟,內(nèi)源性蛋白酶,酶活性,相對(duì)分子量

鮑魚(Abalone),屬于軟體動(dòng)物,鮑螺科鮑屬,由于其較高的商業(yè)價(jià)值,在全世界范圍內(nèi)有大量養(yǎng)殖[1-2]。中國(guó)傳統(tǒng)的珍貴海味有“鮑、參、翅、肚”,然而鮑位于榜首,其肉質(zhì)柔嫩細(xì)滑、鮮而不膩、滋味濃郁,深受全世界人們的喜愛。鮑魚不單是一種名貴的食材,還有著豐富的藥用價(jià)值[3]。鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶主要指內(nèi)臟消化系統(tǒng)中的酶,大部分為蛋白酶(催化蛋白質(zhì)水解的酶類的總稱,包括胰蛋白酶、胃蛋白酶、組織蛋白酶等)?，F(xiàn)階段蛋白酶酶學(xué)性質(zhì)的研究?jī)?nèi)容主要是:酶的活力與溫度、pH、酶濃度、底物濃度、酶激活劑和激活方法、酶抑制劑的關(guān)系;蛋白酶的相對(duì)分子大小[4]等。研究發(fā)現(xiàn),影響內(nèi)源酶活性的因素主要有pH、溫度、金屬離子,其中常見的金屬離子激活劑有Na+、Zn2+、Ca2+、Cu2+。目前,常用特異性抑制劑確定蛋白酶的種類,最為常見的抑制劑有胰蛋白酶抑制劑(TLCK、SBTI等),胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK等),胃蛋白酶抑制劑(Pepstain等),金屬蛋白酶抑制劑(EDTA等)[5]。國(guó)內(nèi)對(duì)鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源蛋白酶特性的研究目前甚少,主要集中在研究鮑魚內(nèi)臟消化系統(tǒng)中酶的種類[6-8]。

自溶[9]是指當(dāng)機(jī)體受到物理因素(如熱、輻射)、化學(xué)因素(如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有毒物質(zhì))和生物因素(如病原體)等環(huán)境因素的刺激后,誘發(fā)自身酶系將自身的組織結(jié)構(gòu)破壞、降解從而引起自身死亡的現(xiàn)象。在進(jìn)行自溶水解工藝條件優(yōu)化時(shí),要根據(jù)原料內(nèi)源酶的特點(diǎn),合理地利用促進(jìn)內(nèi)源酶活力的因素[10]。因此,研究并合理利用內(nèi)源酶的特性,選擇鮑魚內(nèi)臟最佳的自溶水解條件,不僅能夠縮短傳統(tǒng)醬油發(fā)酵過程中自溶時(shí)間,而且可以減少發(fā)酵成本。同時(shí),該研究充分利用了鮑魚內(nèi)臟的資源,提高了其產(chǎn)品附加值,對(duì)擴(kuò)大我國(guó)居民相對(duì)缺乏的動(dòng)物蛋白來源具有重大意義。因此,筆者探究了pH、溫度和不同濃度的Na+,Cu2+,Ca2+,Zn2+對(duì)內(nèi)源酶活性的影響,使用 PMSF,Pepstain,SBTI,TPCK 和 EDTA 來探究?jī)?nèi)源酶的特性,為加速鮑魚內(nèi)臟自溶水解和縮短傳統(tǒng)鮑魚醬油發(fā)酵時(shí)間提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮑魚內(nèi)臟 由福建省漳州市詔安海聯(lián)食品食品有限公司提供;三羥甲基氨基甲烷(Tris),牛血清白蛋白(BSA)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,裂解液(Urea,Thiaurea,DTT,CHAPS,carrier amphoLytes),考馬斯亮藍(lán) G-250,血紅蛋白,偶氮酪蛋白(Na-苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽酸鹽BApNA),絲氨酸蛋白酶抑制劑(PMSF)、胰蛋白酶抑制劑(SBTI)、胰凝乳蛋白酶抑制劑(TPCK),丙烯酰胺,十二烷基硫酸鈉(SDS),高氯酸銨(AP),四甲基乙二胺(TEMED) 均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶抑制劑 Sigma公司；其他試劑均為分析純及以上級(jí)別。

高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(TGL-16M) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;組織搗碎勻漿機(jī)、磁力攪拌器 上海精密儀器設(shè)備有限公司;Sartorius BS110S Max 110 g電子天平 北京賽多利斯天平有限公司;精密酸度計(jì) 上海精密儀器設(shè)備有限公司;分光光度計(jì) 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;電泳儀 深圳賽泰克生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)源酶液的制備及蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 經(jīng)冷凍的鮑魚內(nèi)臟,以1∶1(w/w)加入pH為8.0的50 mmol/L Tris-HCL 緩沖液;高速勻漿后,低溫浸提過夜;10500 r/min 離心10 min 后取上清液,并于-30 ℃保存;所有操作未經(jīng)特殊說明,均在4 ℃下進(jìn)行。采用Bradford法[10]測(cè)定鮑魚內(nèi)臟內(nèi)源酶液(以下簡(jiǎn)稱:內(nèi)源酶液)中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.2 酶活力測(cè)定方法 酶活力(enzyme activity)也稱為酶活性,是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下,酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示,酶催化反應(yīng)速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。蛋白酶活性是指在一定pH(pH3.6或pH7.0)和40 ℃溫度條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為一個(gè)蛋白酶活力單位。采用福林酚法測(cè)定各組酶活[10]。

1.2.2.1 pH對(duì)內(nèi)源酶活力的影響 先將 2% 酪蛋白溶液與內(nèi)源酶液分別于40 ℃下保溫3 min,確保內(nèi)源酶液有高酶活;在1～11號(hào)試管中分別加入緩沖液1 mL(pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12),再依次加入保溫好的2%酪蛋白溶液與內(nèi)源酶液各1 mL;震蕩搖勻,置于40 ℃ 水浴中處理1 h后,快速加入2 mL三氯乙酸(0.4 mol/L),終止內(nèi)源酶水解反應(yīng)。并將各酶解液置于4000 r/min條件下,離心10 min,各取1 mL上清液,分別加入5 mL碳酸鈉(0.4 mol/L)和1 mL福林-酚試劑,搖勻;靜置20 min后,于360 nm下分別測(cè)定其吸光度。重復(fù)操作三次。

1.2.2.2 溫度對(duì)內(nèi)源酶活力的影響 測(cè)定方法同1.2.2.1 pH對(duì)內(nèi)源酶活力的影響,其中不同之處為:加入內(nèi)源酶液的緩沖液 pH分別為4、7.5、8,在每個(gè)pH下,水浴處理分別為4、30、40、50、60、65、70 ℃,以研究最適pH下內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果用百分?jǐn)?shù)表示,以各相應(yīng)pH下50 ℃的酶活力為100%。相對(duì)酶活的公式(1)如下:

式(1)

1.2.2.3 金屬離子對(duì)內(nèi)源酶活力的影響 在正常的緩沖體系中加入一定量的金屬離子,使Na+終濃度為0.000、0.680、1.360、2.040 mol/L,Cu2+的終濃度為0.000、0.006、0.008、0.012 mol/L,Ca2+的終濃度為0.000、0.020、0.040、0.060 mol/L 和Zn2+的終濃度為0.000、0.005、0.010、0.01 mol/L[11];將以上四種金屬離子配成不同濃度的鹽酸鹽溶液,在40 ℃時(shí)將鹽酸鹽溶液加入到內(nèi)源酶液中,以未添加金屬離子的內(nèi)源酶液為對(duì)照組,采用福林酚法測(cè)定各組酶活[10],并以相對(duì)酶活力來考察各金屬離子對(duì)內(nèi)源酶活性的影響,其中相對(duì)酶活力的計(jì)算公式(2)如下:

式(2)

1.2.3 胃蛋白酶活性的測(cè)定 取5 μL內(nèi)源酶液加入到含有0.5%血紅蛋白的0.1 mol/L Gly-HCl(pH2.0)緩沖液中,置于25 ℃水浴中孵育30 min后,加入濃度為12% 的三氯醋酸溶液 0.5 mL,震蕩搖勻后,3000 r/min 離心15 min,取1 mL上清液,于280 nm下測(cè)定其吸光度值。重復(fù)測(cè)定三次,取平均值。通過公式(3)計(jì)算內(nèi)源酶液中胃蛋白酶活力[12]:

活力(units/mg)=(Abs280/min)×反應(yīng)混合體積(mL)/0.051×反應(yīng)時(shí)間(min)×蛋白質(zhì)含量(mg)

式(3)

1.2.4 胰蛋白酶活性的測(cè)定 取25 μL內(nèi)源酶液加入到1.25 mL 新鮮配制的1 mmol/L BApNA(在含有20 mmol/L的CaCl2的50 mmol/L Tris-HCL緩沖液(pH7.5)中溶解),置于37 ℃水浴中孵育10 min后,加入30%醋酸1 mL終止反應(yīng),置于3000 r/min條件下離心15 min,取上清液并于410 nm條件下測(cè)定其吸光值。重復(fù)操作三次,取平均值,并根據(jù)公式(1～4)計(jì)算內(nèi)源酶液中胰蛋白酶的活力[12]。

活力(units/mg)=(Abs410/min)×1000×反應(yīng)混合體積(mL)/8800×蛋白質(zhì)含量(mg)

式(4)

1.2.5 胰凝乳蛋白酶活性的測(cè)定 取10 μL內(nèi)源酶液加入到750 μL新鮮配制的0.1 mmol/L SAPNA(以含有20 mmol/L CaCl2,pH為7.5的Tris-HCL為緩沖液)中[12];在30 ℃,410 nm下記錄3 min內(nèi)的吸光值,計(jì)算公式同1.2.4。

1.2.6 抑制劑對(duì)內(nèi)源酶活性的影響 參考Serviere-Zaragoza[13]選用蛋白酶特異性抑制劑確定內(nèi)源酶液中所含酶的種類。本實(shí)驗(yàn)所選用的抑制劑有:0.5 mmol/L PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、0.001 mmol/L Pepstain(胃蛋白酶抑制劑)、0.1 g/L SBTI(胰蛋白酶抑制劑)、5 mmol/L TPCK(胰凝乳蛋白酶抑制劑)及10 mmol/L EDTA(金屬蛋白酶抑制劑)。具體操作步驟如下:內(nèi)源酶液分別與各特異性抑制劑以1∶1(v∶v)混合,以 2% 的酪蛋白溶液為底物,分別將10 mL混合液加入到選擇性緩沖液(pH為2～12)中進(jìn)行,并均置于26 ℃條件下水浴1 h,而后均加入12%的三氯醋酸終止各反應(yīng),隨后將各反應(yīng)液在4000 r/min條件下,離心10 min,各取1 mL上清液,分別加入5 mL碳酸鈉(0.4 mol/L)和1 mL福林-酚試劑,搖勻;靜置20 min后,于360 nm下分別測(cè)定其吸光度。并通過式(1)～式(5)計(jì)算各抑制劑對(duì)酶活性的抑制效果:

抑制率(%)=不含抑制劑的酶活-含抑制劑的酶活/不含抑制劑的酶活×100

式(5)

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)源酶中蛋白質(zhì)的含量

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,并可得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)曲線:y=29.3x-0.0053,相關(guān)系數(shù)為0.9947,式中y:吸光值(OD值);x:蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)含量(mg/mL)。采用Bradford法,將實(shí)驗(yàn)實(shí)際測(cè)定的稀釋后內(nèi)源酶液的吸光值,并將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行換算,可得內(nèi)源酶液中蛋白質(zhì)的含量為:125.10 mg/mL。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

2.2 pH對(duì)內(nèi)源酶活性的影響

不同pH條件下對(duì)內(nèi)源酶活性的影響,如圖2所示。內(nèi)源酶顯示了兩個(gè)活性高峰,分別在pH4左右和pH7左右。E. Serviere-Zaragoza[13]等人在墨西哥藍(lán)色鮑魚的肝胰腺中發(fā)現(xiàn),在pH為2～5的范圍內(nèi)蛋白酶活力很強(qiáng);而且pH7.5時(shí),雌性鮑魚腸中的胰凝乳蛋白酶活力增加到238%。同時(shí),以1%偶氮酪蛋白和2%酸性血紅蛋白為底物測(cè)定pH對(duì)墨西哥綠色鮑魚蛋白酶活力的影響,結(jié)果表明在酸性pH范圍(pH為2～4)有蛋白酶活力高峰。這與本實(shí)驗(yàn)的pH4左右以及pH7左右出現(xiàn)蛋白酶活力高峰是相似的。

圖2 pH對(duì)內(nèi)源酶活性的影響Fig.2 Effect of pH on the endogenous protease activity

2.3 溫度對(duì)內(nèi)源酶活性的影響

圖3表明:當(dāng)pH為4時(shí),溫度在4～50 ℃范圍內(nèi),相對(duì)酶活力隨著溫度的增大而增大,50 ℃的蛋白酶活力最高(100%);在50～60 ℃蛋白酶活力仍較強(qiáng),而當(dāng)溫度超過60 ℃后,相對(duì)酶活力急速下降,在70 ℃時(shí)相對(duì)酶活力降至1.5%。由此可知,在pH為4時(shí)內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性較好。當(dāng)pH為7.5時(shí),溫度在4～40 ℃范圍內(nèi),相對(duì)酶活力隨著溫度的增大而增大,當(dāng)溫度為40 ℃時(shí),相對(duì)酶活力達(dá)到最大(118.6%);在40～50 ℃蛋白酶活力仍較強(qiáng),然而當(dāng)溫度超過50 ℃,其相對(duì)酶活力急速下降,在70 ℃時(shí)相對(duì)酶活力降至3.4%。因此,在pH為7.5時(shí)內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性較好。當(dāng)pH為8時(shí),溫度在4～60 ℃范圍內(nèi),相對(duì)酶活力隨著溫度的增大而增大;最大相對(duì)酶活力為121.0%(60 ℃),當(dāng)溫度超過65 ℃后,其相對(duì)酶活力急速下降,70 ℃時(shí)相對(duì)酶活力降至最低(37.6%)。綜上所述,在pH為8時(shí),內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性很好;而pH為4和7.5時(shí)內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性較好。

圖3 溫度對(duì)內(nèi)源酶活性的影響Fig.3 Effects of temperature on the endogenous protease activity

2.4 金屬離子對(duì)內(nèi)源酶活性的影響

不同的金屬離子對(duì)蛋白酶活性有促進(jìn)作用或者抑制作用,且同一種金屬離子在不同的離子濃度下對(duì)蛋白酶活力的作用(促進(jìn)或抑制作用)也不同。從圖4A中可以看出,鈉離子在濃度(0～1.36 mol/L)范圍內(nèi)對(duì)內(nèi)源酶活性有顯著促進(jìn)作用(p<0.05),即內(nèi)源酶活性隨著鈉離子濃度的增加而增加,且當(dāng)鈉離子濃度為1.36 mol/L時(shí),酶活力最高,為135.1%;而2.04 mol/L鈉離子對(duì)內(nèi)源酶活力有抑制作用。出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因可能是由于高濃度的鈉離子形成的高滲透壓作用及離子間的靜電作用破壞了混合內(nèi)源酶中某些酶的結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致部分蛋白酶失活,進(jìn)而使整體內(nèi)源酶活性降低。圖4B表明鈣離子對(duì)內(nèi)源酶活力具有促進(jìn)作用但效果不顯著(p>0.05),當(dāng)鈣離子濃度為0.06 mol/L時(shí),有最大的相對(duì)蛋白酶活力108.8%,其原因可能是適當(dāng)濃度的鈣離子能增加胰蛋白酶等蛋白酶螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,使得蛋白質(zhì)不易被水解[6]。由圖4C可知,Cu2+和Zn2+對(duì)蛋白酶活力均有顯著抑制作用(p<0.05), 并且隨著其濃度的增加,抑制作用增強(qiáng),其中Cu2+最大濃度(0.012 mol/L)對(duì)應(yīng)的相對(duì)蛋白酶活力為83.5%。Zn2+最大濃度(0.015 mol/l)對(duì)應(yīng)的相對(duì)蛋白酶活力為68.5%,這是由于鋅離子對(duì)混合內(nèi)源酶中的羧肽酶有抑制作用[13,15]。

表2 抑制劑在不同pH下對(duì)內(nèi)源酶活性的影響(%)

Table 2 Effect of inhibitors on the activity of endogenous proteases(%)

抑制劑內(nèi)源酶在不同pH下的抑制率pH2pH3pH4pH5pH6pH7pH8pH9pH10pH11pH12PMSF208025303154566587290582651434318Pepstain768827831669581488401322252217SBTI2127323435688786793656614345262TPCK1826328404755846856635263421EDTA00024215320612153240

圖4 屬離子對(duì)內(nèi)源酶活性的影響對(duì)內(nèi)源酶活性的影響(n=3)Fig.4 Metal ions on the endogenous protease activity(n=3)

綜上所述可知,1.36 mol/L的鈉離子對(duì)內(nèi)源酶活力的促進(jìn)作用較強(qiáng)且低于或高于該濃度酶活性均降低;鈣離子對(duì)內(nèi)源酶活性具有穩(wěn)定作用,即不同濃度的鈣離子對(duì)酶活性影響不顯著;而銅離子和鋅離子對(duì)內(nèi)源酶活力有顯著抑制作用。

2.5 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活性的比較

表1為內(nèi)源酶中類胃蛋白酶、類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶活力大小,結(jié)果表明混合蛋白酶中有類胃蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶的酶。內(nèi)源酶中各蛋白酶活力從大到小順序?yàn)?胃蛋白酶>胰蛋白酶>胰凝乳蛋白酶,其中胃蛋白酶酶活力最大,從而驗(yàn)證和解釋了內(nèi)源酶酶活力最適pH環(huán)境為酸性(pH為3～4),且胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的酶活也相對(duì)較高,因而在pH為7～8的中堿性環(huán)境中混合內(nèi)源蛋白酶也具有相對(duì)較高的活力。這與E. Serviere-Zaragoza[13]對(duì)鮑魚蛋白酶的研究是相似的。

表1 內(nèi)源酶中特異性蛋白酶的酶活力

Table 1 ProteoLytic activity of specific proteases fromol/Lendogenous protease

底物蛋白酶活力(units/mg)血紅蛋白內(nèi)源酶中類胃蛋白酶722±001BApNA內(nèi)源酶中類胰蛋白酶590±003SAPNA內(nèi)源酶中類胰凝乳蛋白酶527±002

2.6 抑制劑對(duì)內(nèi)源酶活性的影響

不同抑制劑在不同pH環(huán)境中對(duì)內(nèi)源酶活性的影響如表2所示,PMSF抑制劑在中堿性(pH為7～9)范圍內(nèi)對(duì)內(nèi)源酶活力具有顯著抑制作用(p<0.05),且最大抑制率為 90.5%±1.21%(pH8)E. Serviere-Zaragoza[10]等人報(bào)道,用PMSF處理后的鮑魚蛋白酶液進(jìn)行電泳的結(jié)果表明,PMSF導(dǎo)致蛋白酶條帶的減少,說明蛋白酶液中至少有一種絲氨酸蛋白酶。Pepstain抑制劑在酸性(pH為2～6)環(huán)境下對(duì)內(nèi)源酶活力有顯著影響(p<0.05),當(dāng)pH為3～4的時(shí),Pepstain對(duì)內(nèi)源酶活力的抑制率大于82.7%,抑制作用最強(qiáng)。SBTI抑制劑在中堿性(pH為7～9)范圍內(nèi)對(duì)內(nèi)源酶活力的抑制作用較強(qiáng),最大抑制率79.3%(pH8)。呂英濤[3]等人研究SBTI對(duì)鯷魚胰蛋白酶活的影響,發(fā)現(xiàn)SBTI對(duì)鯷魚胰蛋白酶的抑制作用強(qiáng)烈,抑制率高達(dá)90%。TPCK抑制劑在中性和堿性(pH為7～10)條件下對(duì)內(nèi)源酶活力抑制作用較強(qiáng),其中在 pH8～9 范圍內(nèi),其抑制作用最強(qiáng),抑制率超過66%。EDTA抑制劑在pH7～9 的范圍內(nèi)對(duì)內(nèi)源酶有微弱的抑制作用,最大抑制率為 20.6%(pH8)。綜上所述,特異性抑制劑對(duì)內(nèi)源酶的最大抑制率從高到低依次是:

PMSF(90.5%)>Pepstain(83.1%)>SBTI(79.3%)>TPCK(68.5%)>EDTA(20.6%),即絲氨酸蛋白酶抑制劑>胃蛋白酶抑制劑>胰蛋白酶抑制劑>胰凝乳蛋白酶抑制劑>金屬蛋白酶抑制劑。由此可以說明,內(nèi)源酶中可能存在絲氨酸蛋白酶、類胃蛋白酶、類胰蛋白酶和類胰凝乳蛋白酶。

3 結(jié)論

經(jīng)測(cè)定,本實(shí)驗(yàn)所用的內(nèi)源酶液中蛋白質(zhì)含量為125.10 mg/mL。并分別研究了pH、溫度、金屬離子及特異性蛋白酶抑制劑對(duì)內(nèi)源酶活力的影響,結(jié)果表明:內(nèi)源酶中至少有三類蛋白酶即類胃蛋白酶、類胰蛋白酶、類胰凝乳蛋白酶;內(nèi)源酶最適pH為4左右和7左右;當(dāng)pH為3～4時(shí),內(nèi)源酶有很高的酶活力和很好的熱穩(wěn)定性,且能被Pepstain抑制;當(dāng)pH為7～8時(shí),內(nèi)源酶有較高的酶活力,且能被PMSF、SBTI、TPCK抑制,其中在pH為8時(shí),內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性很好;而pH為4和7.5時(shí)內(nèi)源酶的熱穩(wěn)定性較好。不同金屬離子對(duì)酶活力的影響各異:鈉離子在低濃度范圍內(nèi)(0～1.36 mol/L)對(duì)內(nèi)源蛋白酶活性有促進(jìn)作用,鈣離子對(duì)內(nèi)源酶活力沒有顯著影響,而銅離子和鋅離子對(duì)蛋白酶活性有抑制作用。

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Characteristics of endogenous proteases from ablone(HaliotisDiscusHannaiIno)viscera

LI Mei-juan,LIU Dan,JIA Zhen,CHEN Xiao-yi,FANG Ting,CHEN Jin-quan*

(Fujian Agriculture and Forestry University,College of Food Science,Fuzhou 350002,China)

Toresearchthecharacteristicsofendogenousproteasesfromabalone(Haliotis Discus Hannai Ino)viscera.TheeffectsofpH,temperature,metalionsandspecificproteaseinhibitorsonendogenousproteasesactivitywereinvestigated.Theresultsshowedthatthecontentofendogenousproteaseswas125.10mg/mL.Theproteaseactivitycouldbeincreasedatlowconcentrations(0～1.36mol/L)ofNa+,andtheactivityofproteasetendedtobestableunderthepresenceofCa2+,however,highconcentrationsofNa+,Cu2+andZn2+significantlyinhibitedtheactivityofprotease.TheoptimumworkingpHofendogenousproteaseswerelocatedatabout4and7atwhichconditionproteaseshowedhighactivityandgoodthermalstability.EndogenousproteasescouldbeinhibitedbyPepstain,PMSF(phenyl-methyl-sulphonyl-fluoride),SBTI(soybeantrypsininhibitor)andTPCK(tosyl-phenylalaninechloromethyl-ketone).Theresearchcanprovidetheoreticalbasisforshorteningthetraditionalfermentationtimeofabalonesauce.

abaloneviscera;endogenousprotease;proteaseactivity;relativemolecularweight

2016-04-27

李梅娟 (1991-)，女，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏,E-mail:15392487183@163.com。

*通訊作者:陳錦權(quán)(1954-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)加工，非熱力加工技術(shù),E-mail:chenjq6613@163.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金(3140101191);福建省發(fā)改委項(xiàng)目:閩發(fā)改投資[2014]168號(hào); 福建省高水平大學(xué)建設(shè)項(xiàng)目(612014043)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)19-0081-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.19.007