煙草根黑腐病拮抗木霉菌株TB72的鑒定及抑菌作用

易 龍, 肖崇剛

(1. 贛南師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所，重慶 400716)

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煙草根黑腐病拮抗木霉菌株TB72的鑒定及抑菌作用

易 龍1,2, 肖崇剛2

(1. 贛南師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，江西 贛州 341000；2. 西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所，重慶 400716)

菌株TB72是針對(duì)煙草根黑腐病菌從煙草根際土壤中分離篩選出有較強(qiáng)拮抗作用的木霉菌，為進(jìn)一步明確其抑菌能力、控病效果及其對(duì)煙草根黑腐病的生防潛能，本研究通過(guò)平板對(duì)峙培養(yǎng)法、抑菌活性檢測(cè)和控病測(cè)試，結(jié)合菌株TB72的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和分子鑒定確定其分類地位。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株TB72對(duì)煙草根黑腐病菌具有明顯拮抗作用，抑菌率達(dá)52.3 %；控病試驗(yàn)表明菌株TB72對(duì)煙草根黑腐病的防效達(dá)84.5 %，能顯著降低煙株接種病菌后的發(fā)病率和病情指數(shù)。抑菌活性檢測(cè)菌株TB72無(wú)菌濾液在測(cè)試的各濃度下對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有較好的抑制效果。通過(guò)對(duì)菌株TB72的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征及ITS序列分析，確定其為木霉屬中的棘孢木霉Trichodermaasperellum。

煙草根黑腐??；木霉菌；生物防治；抑菌作用

由于煙草種植面積的調(diào)整，耕作制度及煙草品種的變化，煙草根黑腐病近年有加重為害的趨勢(shì)，煙株苗期至成株期均可受害，重者出現(xiàn)萎蔫死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為威脅煙區(qū)煙草生產(chǎn)上重要的土傳病害，其由基生根串珠霉菌(Thielaviopsisbasicola)侵染引起[1]。目前煙草根黑腐病的防治措施主要通過(guò)化學(xué)藥劑來(lái)進(jìn)行治理[2]，帶來(lái)了一系列如農(nóng)藥殘留等影響卷煙安全衛(wèi)生等問(wèn)題，為符合國(guó)家煙草專賣局提出的“綠色農(nóng)業(yè)、綠色煙草”的要求，走生態(tài)之路、環(huán)保之路，尋找其他防控措施以減少農(nóng)藥殘留和病原菌抗藥性等問(wèn)題成為當(dāng)前煙草病害防控研究中的重點(diǎn)任務(wù)。木霉菌是植物病害生物防治中重要的生物菌劑，來(lái)源于自然，對(duì)環(huán)境友好，國(guó)內(nèi)外關(guān)于其在植物病害防治研究上已取得了良好的效果[3-5]，針對(duì)煙草根黑腐病的生防木霉菌相關(guān)研究尚未見報(bào)道，本文研究了從煙區(qū)土壤中分離獲得的對(duì)根黑腐病菌有較好拮抗作用的木霉TB72菌株的抑菌和控病作用及其分類學(xué)地位，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)菌株: 煙草根黑腐病原菌，分離自煙草根際土壤的木霉菌株TB72，均由西南大學(xué)植物生態(tài)病理研究所提供。對(duì)照藥劑為市售70 %甲基托布津可濕性粉劑(日本曹達(dá)株式會(huì)社)、50 %多菌靈可濕性粉劑(四川國(guó)光農(nóng)化有限公司)。烤煙品種K326由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院惠贈(zèng)，溫室培育至10片真葉備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌株抑菌作用 采用平板對(duì)峙法[6]，將活化的煙草根黑腐病菌直徑5 mm的菌餅接種在PDA平板中心，培養(yǎng)2 d后，將活化的TB72菌株接種在距離靶標(biāo)菌餅3 cm處，以單獨(dú)接種病原菌的平板為對(duì)照，26 ℃培養(yǎng)5 d后，分別測(cè)量處理病原菌和對(duì)照病原菌的生長(zhǎng)直徑，觀察記錄抑菌情況，并挑取受抑制的病菌菌絲進(jìn)行鏡檢。

1.2.2 木霉菌的控病效果 將在PDA平板上活化的直徑為5 mm的TB72菌餅接種到PDB培養(yǎng)液，28 ℃下160 r/min培養(yǎng)7 d，收集發(fā)酵液。用5 mL發(fā)酵液灌根備用煙苗，每處理15株煙苗，重復(fù)4次，設(shè)70 %甲基托布津可濕性粉劑、50 %多菌靈可濕性粉劑1000倍液以及清水和液體培養(yǎng)基處理的為對(duì)照。上述處理24 h后灌根接種。

將煙草根黑腐病菌接種于PDA平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，用無(wú)菌水將孢子洗脫下來(lái)，兩層紗布過(guò)濾去除菌絲，配制成2×105個(gè)/mL濃度的孢子懸浮液。取2 mL孢子懸浮液灌根接種于煙株莖基部，26 ℃培養(yǎng)15 d后根據(jù)國(guó)家煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法(YC/T 39-1996)]調(diào)查發(fā)病率及發(fā)病嚴(yán)重度，SPSS12.0軟件統(tǒng)計(jì)分析病情指數(shù)和防效。

1.2.3 木霉菌無(wú)菌濾液抑菌活性測(cè)定 按上述方法將菌株TB72接種到液體培養(yǎng)基中，28 ℃下160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d后，用定性濾紙抽濾培養(yǎng)液，盡量除去培養(yǎng)液中的菌絲和孢子，再經(jīng)10 000 r/min離心20 min，將上清液經(jīng)孔徑為0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌即得無(wú)菌濾液。

(1)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。采用菌落直徑法，將直徑5 mm的根黑腐病菌菌塊置入含無(wú)菌濾液終濃度為3 %、6 %、10 %、15 %的平板，以未接菌的液體培養(yǎng)基過(guò)濾液制成的相同濃度的平板為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，26 ℃培養(yǎng)3、6、9 d后，測(cè)量各處理菌落增長(zhǎng)直徑。

(2) 對(duì)孢子萌發(fā)的影響。將無(wú)菌濾液10 %、20 %、40 %、80 %的稀釋液按1∶1體積比同濃度為2×105個(gè)/mL根黑腐病菌孢子懸浮液混和，使無(wú)菌濾液終濃度為5 %、10 %、20 %、40 %, 以未接菌的液體培養(yǎng)基過(guò)濾液以相同比例處理的作對(duì)照，26 ℃下6、12、24 h后鏡檢孢子萌發(fā)數(shù)，以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每處理3次重復(fù)，計(jì)算抑制孢子萌發(fā)率。

1.2.4 木霉菌分類鑒定 根據(jù)《木霉分類與鑒定》[7]，觀察菌株TB72在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特征、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)，利用TaKaRa公司的試劑盒提取木霉菌基因組，采用ITS通用引物[8]對(duì)木霉菌ITS基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送交華大基因科技有限公司采用凝膠回收試劑盒回收、純化等，并進(jìn)行核酸序列測(cè)定。將測(cè)定的ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并用MEGA5.03軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株抑菌效果

抑菌實(shí)驗(yàn)表明木霉菌TB72對(duì)煙草根黑腐病菌菌落擴(kuò)展具有明顯拮抗作用，抑菌率達(dá)52.3 %，對(duì)峙培養(yǎng)中的根黑腐病菌菌落邊緣和抑菌帶接觸部分的菌絲稀疏、長(zhǎng)勢(shì)減弱，而對(duì)照根黑腐病菌生長(zhǎng)正常，呈圓形向四周擴(kuò)展。進(jìn)一步鏡檢觀察到對(duì)峙培養(yǎng)中的根黑腐病菌菌絲及分生孢子梗生長(zhǎng)形態(tài)均受到影響，表現(xiàn)在菌絲萎縮、呈脫水狀，生長(zhǎng)頂端呈泡狀，部分菌絲前端破裂、消解，內(nèi)含物外溢，失去進(jìn)一步生長(zhǎng)的能力，分生孢子梗形態(tài)扭曲、溢縮、呈現(xiàn)暗黑色，不能正常產(chǎn)生分生孢子(圖1)。

2.2 溫室控病試驗(yàn)

試驗(yàn)觀察到對(duì)照煙苗全部發(fā)病，出現(xiàn)萎蔫癥狀，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，而經(jīng)木霉菌TB72處理的煙苗植株發(fā)病率明顯降低，發(fā)病程度輕微，未表現(xiàn)出明顯癥狀，生長(zhǎng)正常。TB72菌株處理后煙株的病情指數(shù)與對(duì)照相比，在α= 0.05水平上達(dá)到顯著，防治效果達(dá)84.5 %(表1)，與對(duì)照藥劑多菌靈和甲基托布津處理效果無(wú)明顯差異，可作為煙草根黑腐病的生防菌株進(jìn)一步研究。

2.3 木霉菌無(wú)菌濾液對(duì)根黑腐病菌的抑制作用

2.3.1 對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用 從表2可見，無(wú)菌濾液在實(shí)驗(yàn)的各濃度下對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲生長(zhǎng)均有抑制作用，6 %以上的終濃度抑菌效果明顯，無(wú)菌濾液10 %和15 %濃度處理結(jié)果相比，對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用并無(wú)顯著差異，表明10 %是較為理想的處理濃度，隨著無(wú)菌濾液濃度的增加，抑制效果并未表現(xiàn)出明顯增效作用。

A:正常菌絲，B:畸形菌絲A: Normal mycelium，B: Deformity mycelium圖1 受木霉菌TB72抑制的煙草根黑腐病菌菌絲形態(tài)Fig.1 Morphology of mycelium of T. basicola inhibited by TB72 under the microscope

2.3.2 對(duì)病菌孢子萌發(fā)的抑制作用 從表3可見，木霉菌TB72菌株無(wú)菌濾液在測(cè)試的各濃度范圍下對(duì)煙草根黑腐病菌孢子的萌發(fā)均有抑制作用，在10 %以上的測(cè)試濃度下抑制效果明顯，5 %的濃度與其他濃度抑制作用相比，雖然效果不明顯，有大量的病菌孢子萌發(fā)，但孢子萌發(fā)后產(chǎn)生的芽管生長(zhǎng)緩慢、扭曲，不能進(jìn)一步發(fā)育為正常菌絲體。同時(shí)還觀察到隨著時(shí)間的推移，各處理的抑制率逐漸降低，表明有部分孢子還是萌發(fā)出芽管，但萌發(fā)后即停止生長(zhǎng)，前端膨大、扭曲，失去正常生長(zhǎng)的能力。

2.4 菌株TB72的分類地位

菌株TB72在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，輻射狀向四周同心環(huán)擴(kuò)展，菌絲緊密，暗培養(yǎng)條件下近中央的分生孢子暗綠色，分生孢子壁有細(xì)刺，近球形或卵形，分生孢子梗細(xì)長(zhǎng)、彎曲，次級(jí)分枝對(duì)生，瓶梗短，中間膨大，基部細(xì)。菌株TB72的ITS經(jīng)PCR擴(kuò)增測(cè)序獲得576 bp的核苷酸序列，將其在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與其同源性較高的菌株均屬于木霉屬，發(fā)現(xiàn)測(cè)定的TB72菌株ITS序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)相應(yīng)序列相似性達(dá)100 %，從構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹可見菌株TB72與Trichodermaasperellum聚類在同一枝，相似性最高(圖2)。結(jié)合菌株TB72的培養(yǎng)性狀，形態(tài)特征及ITS序列與T.asperellum一致，確定菌株TB72為棘孢木霉(T.asperellum)。

表1 木霉菌TB72菌株控病效果

注：防治效果=(對(duì)照病情指數(shù) -處理病情指數(shù))/對(duì)照病情指數(shù)。同一列數(shù)據(jù)標(biāo)記的字母相同者表示差異不顯著(P<0.05，鄧肯氏新復(fù)極差法)，下同。 Note: Control efficacy = (control disease index-treated disease index) /control disease index. Data followed by the same small letters in the same column showed no significant differences at 0.05 level by DMRT. The same as below.

表2 木霉菌TB72無(wú)菌濾液對(duì)煙草根黑腐病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表3 木霉菌TB72無(wú)菌濾液對(duì)煙草根黑腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

注：每個(gè)處理檢測(cè)150個(gè)孢子。

Note： Check 150 conidia for each treatment.

圖2 菌株TB72與相關(guān)菌株ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of ITS nucleotide sequences of strain TB72 and its relatives

3 討 論

木霉菌是目前研究最多，應(yīng)用最廣泛的一種生防菌群，國(guó)內(nèi)外對(duì)于木霉菌用于防治植物病害已有成功報(bào)道[3,5,9]。本研究菌株TB72經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為棘孢木霉(Trichodermaasperellum)，棘孢木霉是近年記錄發(fā)現(xiàn)的木霉菌種，但其具有較好的生防作用，已在國(guó)內(nèi)外得到了公認(rèn)，是一種具有較好生防潛能的菌種[10-15]，到目前為止，對(duì)煙草生產(chǎn)越增危害的根黑腐病的生防研究還落后于其它煙草病害的生防研究，試驗(yàn)菌株TB72來(lái)之于煙區(qū)煙株根際土壤，對(duì)煙田生態(tài)環(huán)境更為適應(yīng)，并且在控病測(cè)試中，拮抗木霉菌TB72處理煙草幼苗后，植株發(fā)病率和病情指數(shù)與對(duì)照相比明顯降低，溫室盆栽防效達(dá)84.5 %，接近目前在生產(chǎn)上使用的甲基托布津、多菌靈藥劑的處理效果，對(duì)煙草根黑腐病有較好的控病作用，顯示該菌株具有較好的開發(fā)價(jià)值。

本研究測(cè)定了木霉菌TB72菌株對(duì)煙草根黑腐病菌的抑制能力及其控病作用，發(fā)現(xiàn)其對(duì)病菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)有明顯抑制作用，通過(guò)阻止病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管侵入寄主植物而防治病害的發(fā)生發(fā)展，獲得了有較好的控病效果，因木霉菌還存在對(duì)寄主產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生等復(fù)雜的生防機(jī)理，TB72菌株代謝產(chǎn)物的提取、濃縮和抗菌物質(zhì)的深入分析以及其具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。因此繼續(xù)探索其生防機(jī)理以明確對(duì)病害的控制原理，對(duì)于進(jìn)一步加大其生防效果的大田驗(yàn)證和生防制劑的研發(fā)力度，建立和完善與之配套的施用技術(shù)體系，對(duì)實(shí)現(xiàn)煙草根黑腐病的安全、有效治理具有十分重要的意義。

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(責(zé)任編輯 李 潔)

Identification and Inhibition Effect of AntagonisticTrichodermaStrain TB72 againstThielaviopsisbasicola

YI Long1,2, XIAO Chong-gang2

(1. College of Life and Environmental Sciences, Gannan Normal University, Jiangxi Ganzhou 341000, China; 2. Institute of Plant Ecology & Pathology, Southwest University, Chongqing 400716, China)

ATrichodermastrain TB72 which can inhibit the pathogen of tobacco black root rot intensively was isolated and screened from the rhizospheric soil of tobacco fields. In order to evaluate scientifically the biocontrol potential of strain TB72 against tobacco black root rot, by pairing culture on PDA plate, inhibiting the pathogen, disease controlling test and taxonomic identification with cultural character, morphological characteristics and molecular methods, the results showed that theTrichodermastrain TB72 exhibited significantly antifungal activities againstThielaviopsisbasicola, the pathogen of tobacco root rot, and the inhibitory effect reached 52.3 % by pairing culture on PDA plate. It was found that the effect of strain TB72 on reduction the incidence of tobacco black root rot, the control efficacy reaching to 84.5 % in a greenhouse experiment. And the results of inhibiting the pathogen showed that culture filtrate of TB72 was effective for inhibiting mycelium growth and reducing spore germination ofT.basicola. According to the characteristics of cultural, morphological, as well as sequence analysis of the internal transcribed spacer region of the ribosomal DNA(ITS), the strain TB72 was identified asTrichodermaasperellum.

Tobacco black root rot;Trichodermaspp.; Biocontrol; Inhibition

1001-4829(2016)08-1889-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.024

2015-06-29

中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目(NY2010060103007)；重慶市煙草公司科技項(xiàng)目(2008YY01010)

易 龍(1978-)，男，博士，教授，主要從事植物病害生物防治研究，E-mail:yilongswu@163.com，Tel：0797-8397768。

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