廣西桉樹潰瘍病病原菌鑒定

廖旺姣，鄒東霞，黃乃秀，吳耀軍

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院/國家林業(yè)局中南速生材繁育實驗室/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002)

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廣西桉樹潰瘍病病原菌鑒定

廖旺姣，鄒東霞，黃乃秀，吳耀軍

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學研究院/國家林業(yè)局中南速生材繁育實驗室/廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室，廣西 南寧 530002)

對廣西區(qū)內(nèi)南寧、崇左、欽州、梧州、玉林、河池等市的桉樹潰瘍病進行病害調(diào)查、病原菌分離及致病性測定，采用病原菌形態(tài)特征結(jié)合基因分子系統(tǒng)學分析方法對病原菌進行鑒定，為防治桉樹潰瘍病提供病原學基礎。結(jié)果表明，引起廣西桉樹潰瘍病的病原菌分別是桉殼囊孢菌(Cytosporaeucalypticola)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)和一種新的桉樹潰瘍病致病菌——可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)。

桉樹；潰瘍??；病原菌鑒定

桉樹 (Eucalyptussp．) 是我國南方速生豐產(chǎn)林的主要造林樹種，主要分布于廣西、廣東、福建、海南、云南等省區(qū)[1-3]。目前，廣西擁有速生桉林約200萬hm2。隨著桉樹人工純林面積不斷擴大和經(jīng)營管理不當，桉樹病害種類不斷增加，危害程度及發(fā)生頻率不斷加重[4]。桉樹潰瘍病為近年來危害桉樹的重要病害之一，主要危害主干和枝條，尤以主干受害對木材影響嚴重，主干感病可形成兩種類型病斑，第一種病斑呈龜裂狀或火山口狀，剝開樹皮，可見淡褐色至黑褐色釘狀物，受害木質(zhì)部凹陷。病變擴展到木質(zhì)部后，主干樹皮下明顯呈黑褐色壞死；第二種病斑呈圓形或近橢圓形，病斑凹陷，剖開病斑，韌皮部呈黑褐色壞死，病斑亦可深達木質(zhì)部。該病害在我區(qū)各主要桉樹栽培區(qū)均有不同程度的發(fā)生，嚴重時感病率可高達100 %，影響桉樹的正常生長及木材質(zhì)量。關于桉樹潰瘍病，自1989年Crous等[5]首次報道了Botryosphaeriadothidea引起南非桉樹潰瘍之后，有關潰瘍病病原菌種類就不斷被報道，1989和1996年Wingfield 等[6-7]分別報道Cryphonectriacubensis和Coniothyriumsp.也能引起南非和澳大利亞等地桉樹潰瘍??；Keane等[8]報道Cytosporaeucalypticola是引起澳大利亞、巴西、烏拉圭、印度等國桉樹潰瘍病的病原菌；Iturritxa等[9]報道Neofusicoccumparvu引起西班牙桉樹潰瘍?。挥嗬诘萚10]報道Botryosphaeriadothide是引起云南藍桉潰瘍病病原菌；陳帥飛等[11]報道Teratosphaeriazuluensis是廣東桉樹枝干斑點潰瘍病的主要病原菌。簡而言之，不同地域桉樹潰瘍病病原菌種類不盡相同。目前，廣西桉樹潰瘍病研究較少，準確地對病原物進行鑒定分類是病害防控的基礎。本文通過病原菌分離、致病性測定、形態(tài)特征觀察結(jié)合病原菌分子系統(tǒng)學方法確定潰瘍病病原，以期為病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和病原菌的分離

2013-2015年分別在廣西南寧、崇左、欽州、梧州、玉林、河池等桉樹林地采集潰瘍病樣品，采用組織塊分離法分離病原菌。根據(jù)分離菌菌落性狀和初步的形態(tài)觀察結(jié)果，選出3株分離菌進行致病性測定，確定致病菌[12]。菌株編號分別為EC1-1、EC1-2和EC1-3。

1.2 致病性測定

參考楊樹潰瘍病接種法[13]，用直徑為 5 mm 的打孔器在枝條(20cm)的表面打去樹皮，用同樣大小的菌餅接種在打去樹皮的圓孔中，再用封口膜包扎接種點，每個枝條上接種3個點，每菌株接4個枝條以接無菌的PDA培養(yǎng)基塊為對照，發(fā)病后，對其病組織進行再分離。確定致病菌。接種后的枝條在 26 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中水培培養(yǎng)，接種后10 d 檢查結(jié)果，記錄發(fā)病率、病斑大小。

1.3 病原菌的鑒定

將經(jīng)致病性測定的菌株置于PDA(馬鈴薯200 g、葡萄糖15.00 g、瓊脂粉20.00 g、水1 000 mL。)培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)，觀察菌落特征；顯微觀察測量其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)及大小，參照相關文獻進行形態(tài)鑒定[8-9，14-17]。

1.4 病原菌分子系統(tǒng)學分析

病原菌的DNA提取參考朱英芝等[18]方法。核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(rDNA-ITS)基因采用通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。反應體系和條件參考White等[19]；EC1-2和EC1-3菌株還擴增α-延伸因子(EF1-α)基因，引物為EF1-728F和 EF1-986R，反應體系和條件參考Alves 等[20]。PCR產(chǎn)物送上海立菲生物技術公司廣州測序部測序，將測序結(jié)果即核糖體rDNA-ITS和EF1-α序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行同源性比較。下載相關病原菌序列，采用Clustal X 2.0 軟件對序列片段進行比對，用Mega 5.0軟件中的鄰接法(neighbor joining，NJ)進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測定結(jié)果

菌株接種3 d后，接種點表皮逐漸變褐，形成橢圓形或梭形病斑，隨時間推移，病斑逐漸擴大。接種10 d，3個種菌株形成病斑大小略有不同。病斑大小分別為10.85、48.66和36.20 mm。EC1-1較EC1-2和EC1-3菌株致病力弱。

2.2 病原菌形態(tài)特征

EC1-1分離菌在PDA培養(yǎng)基平板上生長較慢，形成圓形或近圓形菌落。菌落邊緣不整齊，氣生菌絲較少，菌落灰黑色至墨綠色(圖1，A)，在PDA平板上28 ℃培養(yǎng)7～10 d可產(chǎn)生分生孢子器，分生孢子器近球形或不規(guī)則形。分生孢子香蕉型、大小為(3.80～6.40)μm×(0.80～1.50)μm，平均為(5.68±0.73) μm×(1.17±0.19)μm(圖1，B)，與Keane等[8]Cytosporaeucalypticola形態(tài)特征相符，初步確認EC1-1為Cytosporaeucalypticola。

EC1-2分離菌在PDA培養(yǎng)基平板上生長較快，形成圓形或近圓形菌落。菌落邊緣整齊，氣生菌絲生長旺盛，菌落初期灰白色，后轉(zhuǎn)灰黑色至黑色(圖32，A)，在PDA平板上添加滅菌桉樹枝條可促進分生孢子器產(chǎn)生，分生孢子器近球形或不規(guī)則形。分生孢子梭形、正直無色、單孢內(nèi)含不規(guī)則油球，頂端鈍圓，基部平截。分生孢子大小為(16.23～31.79)μm×(6.22～9.02)μm，平均為(22.53±2.86) μm×(7.78±0.63)μm(圖2，AB)。這些形態(tài)特征與小新殼梭孢Neofusicoccumparvum形態(tài)特征相符。因此，初步確認菌株EC1-2為Neofusicoccumparvum。

A，Cytospora eucalypticola培養(yǎng)性狀；B，分生孢子形態(tài)A: Colony；B: Conidia圖1 Cytospora eucalypticola培養(yǎng)性狀及分生孢子形態(tài)Fig.1 Morphological characteristics and incubation traits of Cytospora eucalypticola

A，小新殼梭孢菌培養(yǎng)性狀；B，分生孢子形態(tài) A: Colony；B: Conidia圖2 小新殼梭孢菌培養(yǎng)性狀及分生孢子形態(tài)Fig.2 Morphological characteristics and incubation traits of Cytospora eucalypticola

A，可可毛色二孢菌培養(yǎng)性狀；B，分生孢子形態(tài) A: Colony; B: Conidia圖3 可可毛色二孢菌培養(yǎng)性狀及分生孢子形態(tài)Fig.3 Morphological characteristics and incubation traits of Lasiodiplodia theobromae

EC1-3分離菌在PDA培養(yǎng)基平板上形成圓形或近圓形菌落。菌落邊緣整齊，氣生菌絲生長旺盛，菌落初期灰白色，后轉(zhuǎn)墨綠色或黑色，生長迅速，基質(zhì)由淡黃色轉(zhuǎn)至黑褐色(圖3，A)。在PDA平板上添加滅菌桉樹枝條可促進分生孢子器產(chǎn)生，分生孢子器近球形或不規(guī)則形，常多個聚生于子座內(nèi)。分生孢子橢圓形或卵形，初期單胞無色，老熟后變褐色，近中部有一橫隔，表面具縱紋。分生孢子大小為(19.54～25.86)μm×(11.46～14.59)μm,，平均為 (24.10±1.52) μm ×(13.56±0.77) μm(圖3，B)。這些形態(tài)特征與可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae(Pat.) Griffon&Maubl形態(tài)特征相符。因此，初步確認菌株EC1-3為Lasiodiplodiatheobromae。

2.3 病原菌基因序列分析

經(jīng)rDNA ITS1和ITS4引物對EC1-1菌株進行PCR擴增，獲得一條長度為550 bp大小的片段。將該序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行同源性比較，基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如下圖所示，EC1-1菌株與Cytosporaeucalypticola同源性高達100 %，進化分析聚在同一分支上，與其他Cytosporasp.屬真菌形成明顯分支。因此，可以確定EC1-1為Cytosporaeucalypticola(圖3)。

將EC1-2和EC1-3菌株的ITS 和EF1-α基因序列的測序結(jié)果與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行同源性比較，下載相關葡萄座腔菌屬真菌序列，合并各菌株2個基因序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，EC1-2菌株與不同來源的Neofusicoccumparvum聚在同一分支上；EC1-3菌株與Lasiodiplodiatheobromae聚在在同一分支上。分支間具有100 %支持率，遺傳關系清晰。因此，可以確定EC1-2和EC1-3菌株分別為Neofusicoccumparvum和Lasiodiplodiatheobroma(圖5)。

圖4 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.4 Molecular phylogenetic tree based on ITS sequences

圖5 基于ITS和 EF1-α基因序列以Botryosphaeria dothidea(菌株CBS115476)為外群構(gòu)建的系統(tǒng)樹Fig.5 Molecular phylogenetic tree based on ITS, EF1-αsequences and rooted with Botryosphaeria dothidea (strains: CBS115476)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)3種能導致桉樹潰瘍病的病原菌，根據(jù)形態(tài)特征和ITS、ITS-EF1-α序列分析，確定EC1-1、EC1-2和EC1-3分別為為Cytosporaeucalypticola、Neofusicoccumparvum和Lasiodiplodiatheobroma，均為廣西桉樹潰瘍病病原首次報道，其中以C.eucalypticola分離頻率最高為52.9 %，是引起廣西桉樹的主要病原菌，與Keane等[8]報道澳大利亞等國桉樹潰瘍病病原菌C.eucalypticola相同；N.parvum與Iturritxa等[9]報道西班牙桉樹潰瘍病病原N.parvum相同；而L.theobroma引起桉樹斑點潰瘍病目前尚未見報道，雖然陳帥飛[11]、廖旺姣[21]報道L.theobroma能引起廣西桉樹Lasiodiplodia枝干潰瘍病，但危害癥狀是枝條枯死，與本文描述的桉樹主干及枝條斑點狀潰瘍病危害狀不相同，反而與劉月廉[22]、周娟[17]等報道的廣東桉樹枝枯病危害狀相似，病原也相同，均為L.theobroma。筆者從桉樹梢枯病樣本中也獲得該菌[22]，與潰瘍病樣本分離獲得的病原菌是否為同一病原，有待進一步研究。研究也發(fā)現(xiàn)，在同一病斑上能分離出1～2種不同病原菌，L.theobromae和N.parvum經(jīng)常混合出現(xiàn)，C.eucalypticola有時也與L.theobromae和N.parvum其中之一同時出現(xiàn)，所形成的病斑也難區(qū)分。

4 結(jié) 論

本研究分離鑒定出3種能引起廣西桉樹潰瘍病的病原菌分別是桉殼囊孢菌(Cytosporaeucalypticola)、小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)和一種新的桉樹潰瘍病致病菌——可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)。

[1]祁述雄.中國桉樹(第2版)[M]. 北京：中國林業(yè)出版社，2002：1-50.

[2]呂 詩，盧成陽，賴家業(yè)，等. 七坡林場桉樹萌芽林林下植被多樣性分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43(10)：1534-1538

[3]田 湘，趙 瑛，于永輝，等. 人工撫育對桉樹人工林林下生物多樣性的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，2014，45(1)：85-89.

[4]羅基同，吳耀軍，奚福生.速生桉林重大病蟲害控制技術彩色原生態(tài)圖鑒 [M].南寧：廣西科學技術出版社，2012：1-120.

[5]Crous P W，Knox Davies P S，Wingfield M J, et al. Newly recorded foliage fungi ofEucalyptusspp．in South Africa[J]. Phytophylauea，1989，21(1): 85-88．

[6]Wingfield M J. Swart,W J. and Abear, B J, et al. First record of Cryhonectria canker of Eucalyp tus in South Africa[J].Phytophylactica,1989, 21: 311-313.

[7]Wingfield M J,Crous P W,Coutinho T A, et al. A serious canker disease ofEucalyptusin South Africa caused by a new species of Conio-thyrium[J].Mycopathologia,1996,136(3):139-145.

[8]Keane P J, Kile G A, Podger B N, et al. Disease and pathogens of Eucalyptus [M].Australia: Brown Ptior Anderson，2000:241-250.

[9]Iturritxa E, Slippers B, Mesanza N, et al. First report of Neofusicoccum parvum causing canker and die-back ofEucalyptusin Spain[J]. Australasian Plant Disease,2011,6(1):57-59.

[10]余 磊，鄭建芬，王荔芳，等. 桉樹潰瘍病病原菌的鑒定[J]. 植物病理學報，2012，42(6): 633-636.

[11]陳帥飛，李國清，李天會，等. 桉樹Teratosphaeria 枝干斑點潰瘍病研究進展[J].桉樹科技，2013,30(2):36-42.

[12]方中達. 植病研究方法[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001: 122-125.

[13]張星耀, 趙嘉平, 梁 軍，等. 樹木枝干潰瘍病菌致病力分化研究[J]. 中國森林病蟲，2008, 27(1):1-4.

[14]陸家云. 植物病原真菌學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000:454-459.

[15]袁志林，陳益存，汪陽東. 一種新發(fā)生的油桐葉枯病病原真菌[J]．菌物學報，2011, 30(4): 658-662.

[16]Crous P W, Slippers B, Wingfield M J, et al. Phylogeneticlineages in the Botryosphaeriaceae[J]. Studies in Mycology, 2006, 55:235-253.

[17]周 娟，梁承豐，習平根，等.廣東桉樹梢枯病病原鑒定[J].華南農(nóng)業(yè)大學學報，2012, 33(2):163-166.

[18]朱英芝，廖旺姣，鄒東霞，等.廣西油茶炭疽病病原菌鑒定及生物學特性[J].植物保護學報，2015,42(3)：382-389.

[19]White T J, Bruns T D, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal DNA genes for phylogenetics[M]. London： Academic Press Inc，1990：315-322

[20]Alves A, Crous P W, Correia A, et al. Morphological and molecular data reveal cryptic speciation inLasiodiplodiatheobromae[J]. Fungal Diversity, 2008, 28(1): 1-13.

[21]廖旺姣，鄒東霞，黃乃秀，等. 廣西桉樹梢枯病病原菌鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2012,40(31):15239-15242.

[22]劉月廉．桉樹枯枝病病害研究[J]．森林病蟲通訊，2000(1):6-8.

(責任編輯 麻小燕)

Identification of Pathogenic Spot Canker on Stem ofEucalyptusin Guangxi

LIAO Wang-jiao, ZOU Dong-xia, HUANG Nai-xiu，WU Yao-jun

(Guangxi Zhuang Autonomous Region Forestry Research Institute, Key Laboratory of Central South Fast-growing Timber Cultivation of Forestry Ministry of China, Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation, Guangxi Nanning 530002, China)

Spot canker survey, pathogen isolation and identification ofEucalyptusin several cities of Guangxi such as Nanning, Chongzuo, Qinzhou, Wuzhou, Yulin and Hechi were performed. The pathogen was identified through morphological characteristics and genetic molecular analysis, which could lay an etiology foundation for preventing and treatingEucalyptuscanker. The results showed that the pathogen causing canker wasCytosporaeucalypticola,NeofusicoccumparvumandLasiodiplodiatheobromae, of whichLasiodiplodiatheobromaewas a newly-found canker pathogen.

Eucalyptusspp.; Canker; Pathogen identification

1001-4829(2016)08-1884-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.023

2016-03-15

廣西自然科學基金項目(2013GXNSFBA019101)

廖旺姣(1980-)，女，工程師，主要從事林木病害研究，E-mail：liaowangjiao@126.com。

S792.39

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