烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶基因的克隆及表達

牛 蓓，徐 鶯，宋 君，郭曉恒，符 佳，鄒 亮，陳 放*，高孝錦，郭 靜

(1.成都大學醫(yī)學院，四川 成都 610106；2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064；3.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析檢測中心，四川 成都 610066)

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烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶基因的克隆及表達

牛 蓓1，徐 鶯2，宋 君3，郭曉恒1，符 佳1，鄒 亮1，陳 放2*，高孝錦1，郭 靜1

(1.成都大學醫(yī)學院，四川 成都 610106；2.四川大學生命科學學院，四川 成都 610064；3.四川省農(nóng)業(yè)科學院分析檢測中心，四川 成都 610066)

硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶是植物脂肪酸合成代謝的關鍵酶，直接調(diào)節(jié)膜脂和貯脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例。本研究通過RT-PCR及RACE技術, 克隆烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶(SsSAD)的cDNA全長序列。結果顯示，該序列包含1個1191 bp的完整的開放閱讀框(GenBank登錄號為EF079655)，編碼396個氨基酸，含33個氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)移肽。其成熟肽含有363個氨基酸，推測其分子量為41.5 kDa，等電點為5.42。同源性分析及同源建模數(shù)據(jù)顯示SsSAD和其它物種的SAD有較高的同源性，含有1個保守結構域。構建原核表達載體pMAL-SsSAD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，并對誘導表達條件進行優(yōu)化。

烏桕；硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶；克??；生物信息學分析；原核表達

近年來，全球能源緊張，導致生物柴油倍受重視。早期英法美各國以油料農(nóng)作物為主，進行生物柴油的開發(fā)[1-3]，但這會占用過多的耕地面積。木本植物具有能量密度高，一次性種植多年收益的特點[4]。因而，各國研究者開始對本土油料樹種資源進行篩選，力求尋找到種子中富含油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的樹種加以開發(fā)利用[5]。烏桕為我國四大油料樹種之一，其種子含油量高達41 %～47 %[6-7]，其中飽和脂肪酸含量約為40 %，不飽和脂肪酸含量約占60 %[8]，脂肪酸的碳鏈長度主要集中在C17～C20，與普通生物柴油主要成分的碳鏈長度類似[9]，因此開展烏桕生物質(zhì)能的研究，具有一定的實用價值。

植物硬脂酰-酰基載體蛋白(ACP)脫飽和酶(SAD)是一種脂肪酸合成代謝的關鍵酶。它催化硬脂酰-ACP脫飽和，在第9～10碳原子之間脫氫形成一個雙鍵，產(chǎn)生油酰-ACP，是植物典型不飽和脂肪酸生物合成途徑的第一步脫飽和酶，可直接調(diào)節(jié)膜脂和貯脂中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例[10]，參與植物衰老調(diào)控、化學防御等生理過程[7,10]。近年來，該酶的分子機理及應用引起了人們的廣泛重視。除了從蓖麻、水稻、擬南芥、油菜、玉米、菠菜等植物[9]中陸續(xù)分離到SAD基因外，轉(zhuǎn)基因研究數(shù)據(jù)顯示SAD基因的RNA干擾[11]和核酶處理[12]，都能改變轉(zhuǎn)基因作物中的飽和與不飽和C16及 C18脂肪酸的含量。

因此，本研究通過RT-PCR及RACE技術, 從烏桕中克隆出硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶(SsSAD)的cDNA全長序列，對其進行生物信息學分析。構建原核表達載體pMAL-SsSAD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在不同時間、不同IPTG濃度和不同溫度條件下進行誘導，得到目的蛋白。為今后進一步深入研究烏桕SAD基因的表達情況、功能，以及基因調(diào)控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 烏桕種子采于四川洪雅縣。立即凍存于液氮中，而后放于-80 ℃的冰箱中備用。

1.1.2 主要試劑 大腸桿菌JM109菌株為四川大學資源與開發(fā)實驗室保存。測序和亞克隆載體pMD18-T (TaKaRa, Dalian, China)。原核表達載體pMAL-c2E (Biolab, USA)。大腸桿菌DH5α表達菌株。ExTaq酶、反轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、各種限制性內(nèi)切酶都購于TaKaRa。VentR DNA聚合酶購自BioLabs。小量膠回收試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒購自上海華舜公司。IPTG、瓊脂糖、瓊脂粉、Tris、SDS購于Amersham。

1.2 實驗方法

1.2.1 RNA的提取 采用張容等人[13]的方法對總RNA進行提取。提出的RNA先經(jīng)DNase37 ℃保溫30 min，除去DNA，再參照植物RNA提取試劑盒使用手冊(華舜)純化?；厥盏腞NA經(jīng)過純度和濃度檢測后，存放-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的克隆 保守區(qū)片段、5′端和3′端RECE片段[14]克?。和ㄟ^BLAST對比，根據(jù)保守區(qū)設計一對簡并引物91和92(表1)。用純化的RNA為模板，以oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，進行反轉(zhuǎn)錄。再以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴增得到烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶基因cDNA保守片段。對擴增片段跑膠、回收并測序比對驗證其正確性。根據(jù)保守片段的測序結果，設計5個特異引物(931，932，951，952和953)以及2個通用引物AP1和AP2(表1)。通過5′-RACE和3′-RACE的方法，分別擴增得到SsSAD基因的5′端和3′端片段。所有反應程序均為：95 ℃ 5 min ；35個循環(huán)(94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min),72 ℃延伸8 min，4 ℃保溫。所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序。測序結果在NCBI的Blastn 進行比對分析，驗證克隆片段是否屬于SAD基因。

表1 基因克隆及表達所用引物序列

全長cDNA片段和閱讀框的克?。焊鶕?jù)拼接片段設計引物9c1和9c2、9ORF1和9ORF2，采用高保真VentR DNA聚合酶分別克隆SsSAD基因的cDNA全長和閱讀框序列。反應程序為：95 ℃ 5 min；35個循環(huán)(94 ℃ 40 s，50 ℃ 50 s，72 ℃ 2 min), 72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序。所得序列在NCBI的Blastn 進行比對分析，驗證克隆片段是否屬于SAD基因。

1.2.3 硬脂酰-ACP脫飽和酶基因生物信息學分析 使用的生物軟件：DNAMAN6.0、Clustalx 1.8、TreeView、 Primer Primer5.0、Vector NIT 7.0，DNA star，COOT，PyMOL, MEGA6.0。使用的網(wǎng)上的數(shù)據(jù)庫和在線分析：

Blast: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi；

ORF finder: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html；

Compute pI/Mw: http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html；

綜上可知，隨著日中有“金雞”說法的出現(xiàn)與流傳，自宋以后，學者們又試圖從如鏡像、折射的角度；或從陰陽互藏、陰陽交感的理論，來推測日中為何會有“雞”。但由前引北宋董逌的《跋月宮圖》中駁斥當時人“知日中為烏，而不知為雞”之語，以及以上各家的解釋亦可發(fā)現(xiàn)：宋代以后的人們，對于此說可能已多有質(zhì)疑。

TMHMM: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；

Protparam: http://web.expasy.org/protparam/；

CD Search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi；

Swiss-model: http://swissmodel.expasy.org/；

ChloroP: http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/；

SOPMA：https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html。

外源基因的誘導表達和SDS-PAGE檢測[15]：挑取含重組質(zhì)粒的DH5α單菌落接種于含Amp(100 mg/L)的LB中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按5 %的比例轉(zhuǎn)接到新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)30 min左右，至菌液的OD600達到0.6。將菌液分成13份。一份不加IPTG，10 000 r/min離心1 min，收集菌體保存于-20 ℃；其余12份按表2所列進行誘導，分別于1、2、3、5 h，取出相應的1 mL的菌液，10 000 r/min離心1 min，收集菌體保存于-20 ℃。同時做pMAL-c2E空載的DH5α菌對照。 以pMAL-SsSAD重組不加IPTG誘導的菌體和pMAL-c2E空載菌作為本底表達對照，將各處理收獲的菌體進行SDS-PAGE(12 %)分析。

2 結果與分析

2.1 硬脂酰-ACP脫飽和酶基因全長cDNA的克隆

根據(jù)其他物種在GenBank中登錄的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的保守序列設計簡并引物，以烏桕種子cDNA為模板，擴增出長約473 bp的片段(圖1-1)。將測序結果在NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blastn比對，其與蓖麻 (X56508), 麻瘋樹(DQ084491)和擬南芥 (AF395441.1)有很高的同源性, 分別為94 %, 92 %和84 %,因此初步推測其為烏桕的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因的保守區(qū)片段。根據(jù)該保守區(qū)序列設計特異引物，通過巢式PCR擴增到約658 bp 3′端片段(圖1-2)，又采用TdT末端加尾和巢式PCR的方法擴增得到約656 bp 5′端片段(圖1-3)。采用軟件Vecter NTI suite 7.0的ContigExpress軟件對三段序列進行拼接，得到全長cDNA。用NCBI中的ORF finder對序列分析發(fā)現(xiàn),全長cDNA包含一個完整的開放閱讀框1191 bp，編碼396個氨基酸.根據(jù)拼接序列,設計引物9ORF1和9ORF2、9c1和9c2，得到烏桕的硬脂酰-ACP脫飽和酶基因閱讀框和全長cDNA(圖1-4和圖1-5)。GenBank登錄號為EF079655。

表2 SsSAD基因原核誘導表達的時間、濃度和溫度條件優(yōu)化

注：誘導溫度優(yōu)化時，加入IPTG終濃度為1 mM，誘導時間為2 h；誘導時間優(yōu)化時，加入IPTG終濃度為1 mM, 溫度為37 ℃；IPTG濃度梯度優(yōu)化時，誘導時間為2 h，溫度為37 ℃。

1:SsSAD基因中間cDNA片段；2: SsSAD基因3′端cDNA片段；3: SsSAD基因5′端cDNA片段(箭頭處); 4: SsSAD基因ORF；5: SsSAD基因全長(箭頭處)1: The middle fragments; 2: The 3′fragments of SsSAD gene; 3: 5′fragments of SsSAD gene (arrow); 4: ORF of SsSAD gene; 5:The full-length cDNA of SsSAD (arrow)圖1 烏桕的SsSAD基因片段、ORF和全長cDNA的克隆Fig.1 Amplification of fragments, ORF and the full-length cDNA of SsSAD gene

1-SAD:Sapium sebiferum SAD (ABN13874);2-SAD: Olea europaeafruit SAD (AAB67840) ;3-SAD:Ricinus communis SAD (CAA39859); 4-SAD:Jatropha curcas SAD(AAY86086); 5-SAD:Helianthus annuus SAD (AAB65144); 6-SAD:Sesamum indicum SAD (BAA07681);7-SAD:Glycinemax SAD (AAX86050); 8-SAD:Gossypium hirsutum SAD(CAB75356);9-SAD:Carthamus tinctorius SAD (AAA33021); 10-SAD:Oryza sativa SAD(NP001045215); 11-SAD: Brassica napus SAD (CAA52786.1);12-SAD:Arabidopsis thaliana (AtSAD) (AAK85232.1);葉綠體轉(zhuǎn)移肽, 2. Π型酶保守區(qū)；1.a chloroplast transit peptide，2. conservative district of Π enzyme圖2 SsSAD基因推測的氨基酸序列與其他植物SADs的同源比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of Sapium sebiferum SsSAD and other plant SADs

2.2 烏桕的SsSAD的氨基酸序列分析

利用在線蛋白質(zhì)分析軟件ChloroP和Compute pI/Mw進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白前端含一個33個氨基酸的葉綠體轉(zhuǎn)移肽(圖2)。其成熟肽的分子量為41.5 kDa，等電點為5.42。其中，含中性疏水性氨基酸 43.7 %，中性親水性氨基酸 27.8 %，酸性氨基酸 14.1 %，堿性氨基酸 14.4 % 。TMHMM-2.0預測結果顯示，該蛋白沒跨膜結構，位于膜外。高級結構預測顯示，α螺旋是SsSAD成熟肽的主要結構元件，其含量占50.28 %，此外，無規(guī)則卷曲占28.45 %，β片層占12.28 %，β折疊占9.12 %。同源性比對結果顯示，烏桕SsSAD全長氨基酸序列和其他物種有較高的同源性(76.24 %～92.57 %)，具有1個高度保守的基序(圖2)。

圖3 13種植物的SAD的N-J系統(tǒng)進化樹分析Fig.3 Phylogenetic N-J tree analysis of SADs from 13 plants

1: SsSAD和RcSAD成熟肽氨基酸的比對； 2:SsSAD蛋白預測的3D結構；3: SsSAD和RcSAD活性中心的對比,淺灰色為SsSAD的活性中心，深灰色為RcSAD的活性中心1: Amino acid squences comparison between mature SsSAD and RcSAD; 2：The predicted 3D protein structure of mature SsSAD；3:Comparison in active domains from SsSAD and RcSAD；Light gray: Active domains from SsSAD; Deep gray: Active domains from RcSAD圖4 SsSAD成熟肽的空間結構Fig.4 The spatial structure of mature SsSAD

采用MEGA6.0 對13種植物的SAD進行N-J系統(tǒng)進化樹分析，圖3顯示烏桕的SAD與大戟科的麻瘋樹、蓖麻、油桐和木油桐的SAD在同一個分枝，親緣關系很近。

氨基酸序列比對顯示烏桕SsSAD成熟肽的氨基酸與蓖麻的硬脂酰-ACP脫飽和酶成熟肽RcSAD具有較高的相似性，這兩條多肽在酶活性中心的4個α-螺旋上，氨基酸幾乎完全一致(圖4-1)。通過同源建模預測烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶的3D結構(圖4-2)。將烏桕SsSAD成熟肽與蓖麻的RcSAD成熟肽的結構進行重疊，結果顯示這2個蛋白在活性中心的6個氨基酸完全一致，其余部分幾乎完全重合(圖4-3)。

2.3 烏桕的SsSAD的原核表達

為進一步研究SsSAD基因的表達情況，將切去葉綠體轉(zhuǎn)移肽的SsSAD基因ORF序列與pMAL載體重組，構建了原核表達的pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒，并將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α菌株中，經(jīng)IPTG誘導后，對表達產(chǎn)物進行了SDS-PAGE電泳檢測。通過對蛋白質(zhì)電泳圖分析，pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒在IPTG誘導作用下，出現(xiàn)了一條新的蛋白質(zhì)條帶，分子量約為81 kDa，扣除載體上約40 kDa的malE麥芽糖結合蛋白，即得到一個約為41 kDa的蛋白質(zhì)，這與SsSAD蛋白理論分子量相符。此外，又對轉(zhuǎn)化子做了溫度梯度、誘導時間梯度和IPTG濃度梯度的誘導，優(yōu)化誘導條件。實驗結果顯示：當菌體在不同溫度梯度下，用相同IPTG濃度(1 mM)下誘導2 h，發(fā)現(xiàn)在37 ℃的時候，表達產(chǎn)物最高(圖5)。這說明37 ℃是菌體表達產(chǎn)物的最適溫度；在37 ℃、1 mM IPTG濃度誘導下，目的蛋白隨誘導時間的增加而增多(圖6)；而在37 ℃下，用不同濃度梯度的IPTG誘導2 h后，目的蛋白表達量基本一致，說明IPTG濃度的變化對pMAL-SsSAD重組質(zhì)粒的誘導表達沒有明顯的影響(圖7)。

1：空載誘導對照; 2：蛋白質(zhì)分子量Marker; 3：未誘導重組對照; 4：37 ℃誘導; 5：32 ℃誘導; 6：28 ℃誘導;7：24° ℃誘導; 箭頭所指條帶為目的蛋白1:Empty vector induced by IPTG as control1; 2:Protein marker; 3:No induced recombinant plasmid as control2; 4:Induced in 37 ℃; 5:Induced in 32 ℃; 6: Induced in 28 ℃; 7 :Induced in 24 ℃; Arrow stripe for target protein 圖5 溫度梯度對SsSAD基因的原核表達影響Fig.5 Effects of temperature gradient on prokaryotic expression of SsSAD

1：蛋白質(zhì)分子量Marker; 2.空載誘導對照; 3. 未誘導的重組對照; 4:誘導5 h; 5:誘導3 h; 6:誘導2 h; 7: 誘導1 h; 箭頭所指條帶為目的蛋白1:Protein marker; 2: Empty vector induced by IPTG as control1; 3: No induced recombinant plasmid as control2; 4: Induced in 5 h; 5: Induced in 3 h; 6: Induced in 2 h; 7: Induced in1 h; Arrow stripe for target protein 圖6 時間梯度對SsSAD基因的原核表達影響Fig.6 Effect of time gradient on prokaryotic expression of SsSAD

1:2 mM IPTG誘導; 2:1.5 mM IPTG誘導; 3:1 mM IPTG誘導; 4: 0.5 mM IPTG誘導; 5:空載誘導對照; 6:蛋白質(zhì)分子量Marker; 7:未誘導重組對照; 箭頭所指條帶為目的蛋白1: Induced by 2 mM IPTG; 2: Induced by 1.5 mM IPTG; 3:Induced by1 mM IPTG; 4: Induced by 0.5 mM IPTG; 5: Empty vector induced by IPTG as control1; 6:Protein marker; 7: No induced recombinant plasmid as control2; Arrow stripe for target protein圖7 IPTG梯度對SsSAD基因的原核表達影響Fig.7 Effect of IPTG gradient on prokaryotic expression of SsSAD

3 討論與結論

Lindqvist Y.[16]于1996年報道蓖麻的硬脂酰-ACP脫飽和酶的晶體結構，這就為預測同家族的SAD蛋白結構提供了一個平臺。通過蓖麻RcSAD成熟肽和烏桕SsSAD成熟肽的比對,采用同源建模的方法得到烏桕硬脂酰-ACP脫飽和酶的結構。其具有11個α-螺旋，包含的氨基酸分別為：α1(36～51)、α2(75～88)、α3a(91～106)、α3b(108～118)、α4(130～158)、α5(161～176)、α6(184～213)、α7(215～245)、α8(249～262)、α9(278～290)、α10(293～309)、α11(317～341)(圖4-1)。這些螺旋中的9個α-螺旋(α3～α11)形成一個反向平行的α-螺旋束，其中α3、α4、α6和α7形成的一個四螺旋束結構[16]。該結構位于SsSAD的保守區(qū)，并含有著一個由兩個鐵原子組成的二鐵中心[17]。圖4-2和圖4-3結構中深灰色的球代表Fe原子。Fe原子的6個配基即是四螺旋束的6個氨基酸的側鏈或其基團，其中一個鐵原子的配基是E196、H232，另一個鐵原子的配基是E105、H146，而E143、E229是兩個鐵原子的橋連配基[16-17]。將蓖麻RcSAD和烏桕SsSAD蛋白結構重疊，比較二者在結構上的差異。圖4-3顯示這2個蛋白在活性中心的6個氨基酸完全一致，其余部分幾乎完全重合。兩鐵原子之間均通過一個氧原子相連，形成非常對稱的Fe-O-Fe二鐵氧簇，二鐵中心及部分四螺旋束的氨基酸側鏈或基團形成酶活性中心[17-18]。從結構推測兩者的功能也十分相近, 特異性的底物硬脂酰 -ACP 分子通過與位于二聚體分子表面的凹槽內(nèi)部的酶活性中心結合，進行脂肪酸碳鏈第9～10碳原子的氧化還原反應[9,18]。

為下一步蛋白的活性鑒定提供一定結構基礎，構建pMAL-c2E-大腸桿菌DH5α的原核表達體系來誘導蛋白表達。成功獲得分子量約為 41.5 kDa 的蛋白質(zhì)，推測該蛋白可能是烏桕SsSAD 天然二聚體的寡聚單體形態(tài)。

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(責任編輯 陳 虹)

Cloning and Expression of Stearoyl-acyl Carrier Protein Desaturase Gene fromSapiumsebiferum

NIU Bei1, XU Ying2, SONG Jun3, GUO Xiao-heng1, FU Jia1, ZHOU Liang1, CHEN Fang2*, GAO Xiao-jin1, GUO Jing1

(1.School of Medical, Chengdu University, Sichuan Chengdu 610106,China; 2.College of Life Science, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610064,China; 3.Analysis and Test Center of Sichuan Academy of Agriculture Science, Sichuan Chengdu 610066,China)

Stearoyl-acyl carrier protein (stearoyl-ACP) desaturase catalyzes the first desaturation step in seed oil biosynthesis, converting stearoyl-ACP to oleoyl-ACP. It plays a key role in determining the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids in membrane lipids and store lipids form plants. In this study, cDNA sequence ofSsSADgene was cloned by RT-PCR and RACE technology. The result showed that a full-lengthSsSADgene contained an 1191 bp open reading frame (ORF) encoding 396 amino acid residues (GenBank accession number: EF079655), which had a chloroplast transit peptide of 33 amino acids. The mature peptide contained 363 amino acids, and the calculated molecular weight and isoelectric point of the mature protein were predicted to be 41.5 kDa and 5.42, respectively. The amino acid sequence having a conserved region had a much higher match with other stearoyl-acyl carrier protein desaturases (SADs) by homology modeling analysis. The recombinant plasmid pMAL-SsSAD was constructed and expressed inE.coliDH5α, and its best induction conditions were optimized.

Sapiumsebiferum; Stearoyl-acyl carrier protein desaturase; Cloning; Bioinformatics analysis; Prokaryotic expression

1001-4829(2016)08-1806-07

10.16213/j.cnki.scjas.2016.08.009

2016-01-12

四川省教育廳項目“油料樹種烏桕的FAD2基因表達調(diào)控研究”(12ZB178); 成都大學自然科學青年基金“大戟科藥用植物活性物質(zhì)篩選”(2010XJZ29); 成都大學大學生創(chuàng)新訓練計劃孵化培育項目“烏桕硬脂酰-?；d體蛋白脫飽和酶基因的克隆和表達分析”

牛 蓓，女，四川成都人，博士，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail: niubeiucd@126.com,*為通訊作者。

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