一株白僵菌的分離鑒定及對黃胸散白蟻的室內(nèi)毒力測定

羅 蘭，李 娟，孫驪珠，袁忠林

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109）

一株白僵菌的分離鑒定及對黃胸散白蟻的室內(nèi)毒力測定

羅 蘭，李 娟，孫驪珠，袁忠林*

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室，山東青島 266109）

從罹病的玉米螟（Ostrinia furnacalis G）中分離純化獲得一株新菌株，命名為Bb-1。通過對該菌株的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征觀察，以及ITS基因序列分析，鑒定出Bb-1菌株為白僵菌屬的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。用該菌株的5種濃度孢子液對黃胸散白蟻進(jìn)行毒力試驗。結(jié)果表明：用濃度為5×107孢子/mL的孢子液處理8 d，黃胸散白蟻的校正死亡率達(dá)95.00%。5～8 d的LC50值為2.05×104～9.05×106孢子/mL。在5×103～5×107孢子/mL濃度下，菌株的LT50值為4.28～8.59 d。

白僵菌；Bb-1；黃胸散白蟻；鑒定；毒力

白蟻是一類多形態(tài)、群居性昆蟲，以各類纖維素為食，危害農(nóng)、林、水利、交通、房屋建筑等，給人們帶來巨大損失，被國際昆蟲生理生態(tài)研究中心列為世界五大害蟲之一［1-4］。為了減少白蟻的危害，采用化學(xué)藥劑對其種群進(jìn)行控制仍是當(dāng)前主要措施，雖然一些高毒、高殘留藥劑已被替代，但化學(xué)殺蟲劑對生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來的問題不容忽視［5-7］。因此，尋找安全的替代防治措施顯得尤為迫切。

昆蟲病原微生物具有選擇性好、防效高的特點，且對環(huán)境友好，對人畜安全，因此，越來越多的病原微生物被開發(fā)用于害蟲防治。白僵菌是世界各國研究應(yīng)用較多的一類昆蟲病原真菌，可侵染15目149科700多種昆蟲［8］。大量的研究試驗證實，白僵菌可對桃蚜、煙蚜、松毛蟲、玉米螟、木毒蛾、小菜蛾、西花薊馬等多種害蟲有很強(qiáng)的致病性［9-11］。本文對從玉米螟（Ostrinia furnacalis G）上分離獲得的白僵菌進(jìn)行了鑒定，并測定了其對黃胸散白蟻的毒力，為進(jìn)一步研究和利用白僵菌防治黃胸散白蟻奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

收集自然感染蟲生菌的玉米螟幼蟲。培養(yǎng)基有馬鈴薯（PDA）、沙氏（SDAY）和察氏（Czapek）培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)基為SDAY。PDA培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯煮汁過濾至1 000 mL，加20 g葡萄糖、20 g瓊脂；SDAY培養(yǎng)基：1 000 mL含4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%瓊脂；Czapek培養(yǎng)基：1 000 mL含3 g硝酸鈉、1 g磷酸氫二鉀、0.5 g氯化鉀、0.5 g硫酸鎂、0.01 g硫酸亞鐵、30 g蔗糖、20 g瓊脂。

1.1.2 供試?yán)ハx

供試白蟻為黃胸散白蟻（Reticulitermes flaviceps），2014年8月20日采集于福建省南平市延平區(qū)，用松木在人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)（溫度為25℃、濕度為80%），試蟲均為成熟健壯工蟻。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離與純化

參照嚴(yán)智燕等［12］的方法分離蟲生真菌。無菌條件下，用鑷子將全身覆蓋白色粉狀物的玉米螟幼蟲夾到已滅菌的SDAY培養(yǎng)基平板上方輕輕地、快速抖動一下，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌落到純化培養(yǎng)基上，置26℃下進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的鑒定

采用插片法對分離純化的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察［13］。將滅菌蓋玻片以45°斜插在有待觀察菌培養(yǎng)基中，26℃培養(yǎng)3～5 d后，取出蓋玻片，在顯微鏡下觀察其孢子梗、孢子的形態(tài)與大小。

用直徑為6 mm的打孔器制作菌餅，分別接種到PDA、SDAY和Czapek培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基設(shè)3次重復(fù)，26℃恒溫培養(yǎng)，第4，8，13，16天測定其菌落直徑及產(chǎn)孢情況，第16天測定其產(chǎn)孢量。菌落直徑采用十字交叉法測定。用直徑為6 mm的打孔器在菌落中央到邊緣的中點處取菌落塊，移入三角燒瓶中，加入含有0.2%Tween-80的無菌水，振蕩15 min，使孢子均勻分散，配制成孢子懸浮液，用血球計數(shù)板測定孢子數(shù)量。

將純化的菌株交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行分子測序。特異引物為：ITS1（5'-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3'）、ITS4（5'-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3'）。

詳細(xì)方法參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。

1.2.3 菌株對白蟻的活性測定

將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)10 d，然后用0.02%Tween-80無菌水配成孢子液，用血球計數(shù)板測定孢子濃度，然后配成5×107，5×106，5×105，5×104，5×103，5×102孢子/mL6種濃度菌液。

在6孔培養(yǎng)板上測定菌株對白蟻的活性［15］。將直徑為3.5 cm的濾紙放在孔中，取100 μL不同孢子濃度的菌液點滴到濾紙上，空白對照為0.02%Tween-80，每孔20頭工蟻，每個濃度重復(fù)3次。在（26±1）℃黑暗環(huán)境中飼養(yǎng)，連續(xù)觀察8 d，每天取出死亡個體，并詳細(xì)記錄各濃度組及對照組的累計死亡率。始終保持實驗培養(yǎng)皿中較濕潤的環(huán)境，空白對照的試蟲死亡率控制20%以內(nèi)［16］。

死亡率及校正死亡率按下列公式計算。

數(shù)據(jù)采用Excel 2007處理，以濃度和時間取對數(shù)作為x，校正死亡率換算成幾率值作為y，進(jìn)行直線回歸［17］。求得毒力方程，并計算LC50值、LT50值及相關(guān)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

采用抖動法從自然感染的蟲體上分離得到了菌株Bb-1。菌株Bb-1在SDAY培養(yǎng)基上的菌落呈平絨狀圓形，顏色由白色逐漸變?yōu)槿榘谆虻S色，菌絲蓬松，粉層疏松（圖1）。

采用插片法，在顯微鏡下觀察其孢子梗、孢子的形態(tài)及大小。其孢子梗呈瓶狀延伸形成“之”字形，孢子梗多數(shù)呈幾束聚集一起，分生孢子多為球形，外部光滑，顏色透明且垂直著生于菌絲分支或短的小分支上，分生孢子大小為1～15 μm（圖2），初步鑒定為白僵菌。

圖2 菌株Bb-1的孢子梗及孢子

從PDA培養(yǎng)基取白僵菌Bb-1的菌絲及孢子進(jìn)行DNA提取，PCR擴(kuò)增和序列比對來鑒定白僵菌Bb-1。測序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫比對表明：經(jīng)特異引物擴(kuò)增獲得的白僵菌Bb-1核糖體DNA-ITS的長度為549 bp；登錄NCBI數(shù)據(jù)庫檢索時可見與庫內(nèi)多株球孢白僵菌菌株核糖體DNA-ITS序列同源性最高達(dá)到99%。通過鑒定得到的DNA序列為：GTAGGG GTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTT CAACTCCCTAACCCTTCTGTGAACCTACCTATC GTTGCTTCGGCGGACTCGCCCCAGCCCGGACG CGGACTGGACCAGCGGCCCGCCGGGGACCTC AAACTCTTGTATTCCAGCATCTTCTGAATACG CCGCAAGGCAAAACAAATGAATCAAAACTTT CAACAACGGATCTCTTGGCTCTGGCATCGATG AAGAACGCAGCGAAACGCGATAAGTAATGTG AATTGCAGAATCCAGTGAATCATCGAATCTTT GAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCG GGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTC GACCTCCCCTTGGGGAGGTCGGCGTTGGGGAC CGGCAGCACACCGCCGGCCCTGAAATGGAGT GGCGGCCCGTCCGCGGCGACCTCTGCGCAGTA ATACAGCTCGCACCGGGACCCCGACGCGGCCA CGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAACGTTGAC CTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTA AG。

通過對ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增和測序及同源性比對，從分子遺傳信息上最終明確為球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。

2.2 菌株的生物學(xué)特性

菌株Bb-1在PDA、SDAY、Czapek固體培養(yǎng)基的生長情況詳見表1。菌株Bb-1在3種培養(yǎng)基上均能良好生長，但有差異。其在PDA培養(yǎng)基上生長較快，菌落呈平絨狀，顏色由白色逐漸變?yōu)榈S，2 d后產(chǎn)孢；其次是SDAY培養(yǎng)基，菌落由白色逐漸變?yōu)槿榘谆虻S，3 d后產(chǎn)孢；在Czapek培養(yǎng)基上生長最慢，菌落散亂，呈雪花狀，極不規(guī)則，顏色由白色逐漸變成淡黃或透明，4 d后產(chǎn)孢。第16天產(chǎn)孢量的順序為：PDA＞SDAY＞Czapek。

表1 菌株Bb-1在不同培養(yǎng)基上的生長狀況

2.3 菌株對黃胸散白蟻的毒力

用菌株Bb-1不同濃度的孢子液對黃胸散白蟻進(jìn)行活性測定，結(jié)果見表2。毒力測定的結(jié)果表明：隨著菌株Bb-1分生孢子濃度的逐漸升高，黃胸散白蟻的校正死亡率也隨之增大。當(dāng)孢子濃度為5×107孢子/mL時，第8天校正死亡率為95.00%；濃度為5×103孢子/mL時，第2天黃胸散白蟻出現(xiàn)死亡，隨著時間推移和濃度增加，校正死亡率呈逐漸增加趨勢。第5～8天，菌株Bb-1對黃胸散白蟻的LC50值依次為9.05×106，7.72×105，1.17×105，2.05×104孢子/mL；LC95值依次為1.12×1012，8.30×1010，1.95×109，3.92× 107孢子/mL（見表3）。

由表4可知，隨著孢子濃度的增加，LT50值逐漸減小，在5×103～5×107孢子/mL濃度下的LT50值分別為8.59，6.68，5.87，5.13，4.28 d。

3 結(jié)論與討論

本研究從自然染病的玉米螟幼蟲上分離純化出1株蟲生真菌，鑒定為白僵菌屬（Beauveria）的球孢白僵菌（Beauveria bassiana）。用其不同的孢子濃度測定對黃胸散白蟻的活性，最高濃度8 d的校正死亡率達(dá)到95.00%，致死中時間LT50值為4.28 d， 8 d的致死中濃度LC50值為2.05×104孢子/mL。白僵菌對黃胸散白蟻具有較強(qiáng)的生物活性，與陳紅梅［18］的研究結(jié)果一致，說明白僵菌可以用于白蟻的生物防治。

表2 菌株Bb-1對黃胸散白蟻的毒力測定結(jié)果

表3 菌株Bb-1對黃胸散白蟻的致死中濃度

表4 菌株Bb-1對黃胸散白蟻的致死中時間

白僵菌是真菌殺蟲應(yīng)用較為廣泛的一個類群，具有誘人的前景，在害蟲的綜合防治中具有重要的作用。在我國，白僵菌主要用于防治松毛蟲、玉米螟和蠐螬等，利用球孢白僵菌防治白蟻的相關(guān)文獻(xiàn)在國內(nèi)外還鮮有報道［15］。本研究分離的球孢白僵菌對黃胸散白蟻表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒力，具有較好的應(yīng)用潛力，但田間環(huán)境比室內(nèi)環(huán)境復(fù)雜得多，其推廣應(yīng)用還有待于進(jìn)一步深入研究。該菌株對其他白蟻的毒力也有待進(jìn)一步驗證。

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Isolation and Identification of a Strain of Beauveria and Its Virulence to Reticulitermes flaviceps

LUO Lan，LI Juan，SUN Li-zhu，YUAN Zhong-lin*
（Key Lab of Integrated Crop Pest Management of Shandong Province，College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Shandong Qingdao 266109）

A new strain of Beauveria bassiana designated No. Bb-1 was isolated and purified from the diseased larvae of Ostrinia furnacalis G. The strain was identified bases on its culture traits，morphological characteristics，and ITS sequence analysis. The results showed that the strain belonged to Beauveria bassiana. In virulence test，the corrected mortality rate reached 95.00%under the concentration of 5×107spores/mL. The values of LC50were 2.05×104-9.05×106spores/mL. Under different concentrations，the LT50values were 4.28-8.59 d.

Beauveria bassiana；Bb-1；Reticulitermes flaviceps；identification；virulence

TQ 450.2+1

A

10.3969/j.issn.1671-5284.2016.02.005

2015-12-23

國家自然科學(xué)基金項目（31272106）；山東省“泰山學(xué)者”建設(shè)工程專項

羅蘭（1965—），女，陜西省咸陽市人，教授，博士，主要從事農(nóng)藥的教學(xué)與研究。Tel：0532-88030495；E-mail：luolanchinese@163.com

袁忠林（1964—），男，陜西省扶風(fēng)縣人，教授，博士。E-mail：zhongliny@163.com

顧林玲）

◆研究與開發(fā)◆