母豬子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

孫龍，曹玉美，伍少欽，農(nóng)秀艷，岑玲，韋婧婷，肖有恩，陳澤祥

（1.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西南寧530317；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室，廣西南寧530001）

母豬子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

孫龍1，曹玉美1，伍少欽1，農(nóng)秀艷1，岑玲1，韋婧婷1，肖有恩1，陳澤祥2

（1.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)有限公司良圻原種豬場，廣西南寧530317；2.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室，廣西南寧530001）

為探究母豬子宮內(nèi)膜炎的致病菌及其耐藥情況，無菌采集40份子宮內(nèi)膜炎母豬子宮內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及分離鑒定，共分離到細(xì)菌47株，分離率為100%。經(jīng)過鑒定，分離菌主要為大腸桿菌、葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細(xì)菌。對分離到的細(xì)菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。結(jié)果表明，氧氟沙星、頭孢噻肟是敏感性較高的2種抗生素。通過臨床試驗(yàn)證實(shí)，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果更改子宮保健方案后能夠提高母豬的斷奶配種率。

母豬；子宮內(nèi)膜炎；細(xì)菌分離；藥敏試驗(yàn)

母豬子宮內(nèi)膜炎是由一系列致病微生物侵入母豬子宮黏膜表層或深層，引起子宮黏膜的黏液性或膿性炎癥過程，是母豬繁殖障礙最主要的細(xì)菌性疾病之一。本病在豬場生產(chǎn)中十分常見。發(fā)生子宮內(nèi)膜炎的母豬發(fā)情不正常，或發(fā)情正常但屢配不孕而被迫淘汰，使母豬的非生產(chǎn)天數(shù)增加，減少年產(chǎn)胎次，直接影響母豬的繁殖力，導(dǎo)致養(yǎng)豬成本增高，經(jīng)濟(jì)效益下降，由此可見，子宮內(nèi)膜炎控制不理想會對豬場的生產(chǎn)力帶來較大損失。本研究通過對子宮內(nèi)膜炎母豬無菌采集子宮內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，了解引發(fā)母豬子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌種類，通過藥敏試驗(yàn)了解致病菌的藥物敏感性，為母豬子宮內(nèi)膜炎的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年5—7月在廣西農(nóng)墾永新畜牧集團(tuán)良圻原種豬場進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

血瓊脂平板、伊紅美藍(lán)（EMB）培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、M-H培養(yǎng)基、膽硫乳（DHL）培養(yǎng)基、SC增菌培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSB）均購自北京陸橋生物試劑公司，16s rRNA引物購自Life公司，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 樣品采集

患病豬外陰部位用0.3%新潔而滅溶液清洗消毒后，用滅菌輸精管按人工授精的方法送入子宮腔，注入滅菌生理鹽水20 mL，并立即回抽，待回液10mL左右，用封口膜封住輸精瓶口，低溫避光保存后立即送往實(shí)驗(yàn)室4℃保存。

1.4 細(xì)菌的分離純化

混勻樣品，無菌操作抽取樣品200 μL加入預(yù)先準(zhǔn)備好的營養(yǎng)肉湯、SC增菌液、TSB肉湯培養(yǎng)基中，37℃溫箱中增菌培養(yǎng)24 h，然后在血瓊脂平板、麥康凱平板、TSA平板進(jìn)行分離培養(yǎng)純化，并通過伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基及DHL培養(yǎng)基進(jìn)行初步鑒定。

1.5 菌落觀察

對平板上生長的菌落大小、形狀、顏色、質(zhì)地、光澤進(jìn)行觀察并記錄。挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并通過顯微鏡油鏡觀察。

1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成

利用16s rRNA兩端的保守序列及參考文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)引物27F/1492R序列，由Life公司合成，擴(kuò)增目的片段長度為1.5 kb左右。獲得目的條帶后送廣州Invitrogen公司測序。

1.7 藥敏試驗(yàn)

對分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。所選藥物有頭孢噻肟、頭孢拉定、慶大霉素、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、新霉素、卡那霉素、大觀霉素、強(qiáng)力霉素、阿奇霉素、恩諾沙星、鏈霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、青霉素、諾氟沙星、氨芐西林、復(fù)方磺胺嘧啶等18種常用藥物。藥敏效果判定：抑菌圈直徑≥20 mm為高敏，抑菌圈直徑在15～20 mm為中敏，抑菌圈直徑＜15 mm為低敏或不敏感。

1.8 動物臨床試驗(yàn)

對實(shí)驗(yàn)室篩選的幾種抗生素在不同母豬場進(jìn)行臨床試驗(yàn)，分為混飼給藥和注射給藥兩種途徑，統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)豬的斷奶配種率，從臨床上驗(yàn)證高敏抗生素在體內(nèi)的抑菌殺菌效果，從而探索出最佳的臨床子宮護(hù)理保健方案。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 病原菌的分離檢測結(jié)果

從不同母豬場共40份子宮內(nèi)容物樣品中共分離到細(xì)菌47株，通過培養(yǎng)基鑒別和16s rRNA測序結(jié)果，最終測得主要為大腸桿菌、葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、沙門氏菌等5種細(xì)菌，并以大腸桿菌、葡萄球菌為主，分別占所有檢出菌株比例的59.6%、23.4%。銅綠假單胞菌、變形桿菌和沙門氏菌占比相對較低。具體分布見表1。

表140 份母豬子宮內(nèi)膜炎細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

將分離到的主要致病菌28株大腸桿菌和11株葡萄球菌應(yīng)用紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)以篩選敏感藥物，結(jié)果如表2所示。分離的28株大腸桿菌中，對頭孢噻肟、大觀霉素、氧氟沙星、左旋氧氟沙星、頭孢拉定、阿奇霉素具有較高的敏感性，高度敏感菌株比例均能達(dá)到50%以上，而對常規(guī)使用的子宮保健藥物青霉素、鏈霉素均出現(xiàn)耐藥性。

分離到的11株葡萄球菌對頭孢噻肟、頭孢拉定、氧氟沙星、左旋氧氟沙星高度敏感比例最大，對喹諾酮類抗生素較為敏感。而對氨基糖苷類抗生素基本都產(chǎn)生耐藥，對常規(guī)使用較為頻繁的青霉素也出現(xiàn)了耐藥性。

表2 大腸桿菌和葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)

2.3 臨床試驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)室分離細(xì)菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選出兩種敏感的抗生素，在兩個(gè)2 000頭規(guī)模的母豬場內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)。A場試驗(yàn)主要驗(yàn)證林可霉素+大觀霉素對子宮炎病菌的抑制作用，B場試驗(yàn)主要驗(yàn)證氧氟沙星對子宮炎病菌的抑制作用，產(chǎn)后8 d進(jìn)行斷奶配種率的統(tǒng)計(jì)分析。具體試驗(yàn)分組及結(jié)果見表3和表4。

表3 A場兩種產(chǎn)后保健方案的對比結(jié)果

表4 B場3種保健方案對比結(jié)果

A場試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)組（林可霉素+大觀霉素組）較對照組（紐弗羅+金霉素組）具有更高的斷奶配種率，試驗(yàn)組和對照組斷奶配種率分別為89.1%、86.8%；但采食量試驗(yàn)組（林可霉素+大觀霉素組）不及對照組（紐弗羅+金霉素組），說明林可霉素+大觀霉素在口感方面沒有紐弗羅+金霉素好，影響了母豬的采食量。

B場試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，氧氟沙星組比阿莫西林組及青霉素+鏈霉素組具有更高的斷奶配種率，且對子宮流膿的控制情況也優(yōu)于阿莫西林組和青霉素+鏈霉素組兩組。采食量方面沒有較大影響，說明氧氟沙星組可以較好地控制子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生，提高斷奶配種率，減少母豬的非生產(chǎn)天數(shù)。

3 討論

子宮內(nèi)膜炎是影響母豬斷奶再次發(fā)情的主要疾病，主要由幾種病原體的混合感染引起，是臨床中降低豬場非生產(chǎn)天數(shù)和增加母豬淘汰率的主要因素，不同地區(qū)甚至不同的畜牧公司病原菌的種類差異較大。本次試驗(yàn)從本公司4個(gè)母豬場中出現(xiàn)子宮內(nèi)膜炎母豬的40份病料中分離到細(xì)菌47株，主要病原菌是大腸桿菌、葡萄球菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、沙門氏菌，檢出率分別為70.0%、27.5%、10.0%、5.0%和5.0%。大腸桿菌和變形桿菌是條件性致病菌，在豬抵抗力降低或環(huán)境較差時(shí)，細(xì)菌會進(jìn)入子宮并大量繁殖，可單獨(dú)或與其他細(xì)菌配合引起母豬子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生。葡萄球菌是常見的革蘭氏陽性菌，往往會引起急性炎癥或化膿性感染。本次試驗(yàn)分離到較多的大腸桿菌和葡萄球菌，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，而子宮感染分離率較高的鏈球菌在本次試驗(yàn)中沒有分離到。

藥敏試驗(yàn)是對分離到的致病菌在分離培養(yǎng)后進(jìn)行的藥物敏感性試驗(yàn)，能夠指導(dǎo)臨床用藥。本次試驗(yàn)還對檢出率較高的大腸桿菌和葡萄球菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，本公司豬場使用率較低的頭孢類抗生素對大腸桿菌和葡萄球菌具有較高的敏感性，大觀霉素對大腸桿菌具有較高的抑制作用，而對革蘭氏陽性菌葡萄球菌的作用較弱。豬場實(shí)際應(yīng)用過程中，大觀霉素雖能提高斷奶配種率，卻遇到采食量稍有下降的問題，可能是生產(chǎn)工藝不好、口感欠佳造成的。氧氟沙星屬喹諾酮類藥物，抗菌譜廣，抗菌活性高，對分離到的大腸桿菌和葡萄球菌都具有較強(qiáng)的抑制作用。根據(jù)藥物代謝動力學(xué)/藥物效力動力學(xué)理論，喹諾酮類藥物屬于濃度依賴性藥物，是抗菌活性在很大范圍內(nèi)隨藥物濃度的增大而增加的一類藥物，跟作用時(shí)間關(guān)系不大，因此相對高劑量的給藥能夠獲得較好的效果。臨床使用氧氟沙星對產(chǎn)后母豬進(jìn)行連續(xù)3 d的肌肉注射能夠明顯提高母豬的斷奶配種率。但由于氧氟沙星不是獸用專用藥，在食用動物上的廣泛使用可能會造成細(xì)菌的耐藥，造成在人身上用時(shí)效果減退，因此2015年6月9日農(nóng)業(yè)部發(fā)布公告自2016年1月1日起停止經(jīng)營、使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑。以后子宮炎細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)要避免使用此4類抗生素進(jìn)行試驗(yàn)。

在我國當(dāng)前的養(yǎng)殖條件下，母豬子宮內(nèi)膜炎的情況依然嚴(yán)重，是影響母豬的產(chǎn)后發(fā)情率的主要因素。環(huán)境中常在的條件性致病菌是母豬子宮內(nèi)膜炎主要感染菌，其中大腸桿菌是本病的主要感染菌。良好的豬舍環(huán)境和徹底的空欄消毒是控制本病的最佳解決方案。依靠藥物治療只能起到緩解的作用，很難對患病動物進(jìn)行根除。同時(shí)，在使用藥物進(jìn)行產(chǎn)后保健時(shí)還應(yīng)遵循交叉用藥和輪換用藥的原則，不能長時(shí)間的依靠某一種抗生素，這樣才會盡量減少細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

[1]操繼躍，吳君.豬產(chǎn)科疾病與繁殖障礙的病因及防治[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2000（3）：8-12.

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（致謝：本試驗(yàn)得到廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所細(xì)菌研究室陳澤祥研究員團(tuán)隊(duì)的大力支持，特此表示衷心感謝。）

（編輯：富春妮）

不吃肉會導(dǎo)致營養(yǎng)缺乏

【法國《費(fèi)加羅報(bào)》10月27日報(bào)道】題：不攝入動物蛋白，難以避免營養(yǎng)缺乏

法國雷恩農(nóng)學(xué)院人類營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人菲利普·勒格朗接受本報(bào)記者采訪，主要內(nèi)容如下：

《費(fèi)加羅報(bào)》問：為什么肉類攝入問題在我們的膳食平衡中非常敏感？

菲利普·勒格朗答：肉類是蛋白質(zhì)的重要和均衡的來源。蛋白質(zhì)構(gòu)成了對人體非常重要的氨基酸。簡而言之，沒有蛋白質(zhì)就沒有生命。但我們不清楚如何靠自己來產(chǎn)出氨基酸，因此必須從飲食中獲取。

問：植物也含有蛋白質(zhì)。我們是否可以擺脫動物蛋白？

答：植物食品和動物食品的蛋白質(zhì)富含度差別非常大。動物在進(jìn)食時(shí)自身也在合成蛋白質(zhì)，因此它們向我們提供了無與倫比的多種氨基酸，其中一些氨基酸是我們無法自己制造的，而植物提供的不可或缺的氨基酸較少。

問：是否可以說沒有肉制品的素食飲食結(jié)構(gòu)必然不均衡？

答：顯然如此!素食需要精確的計(jì)算以及大量飲食才能達(dá)到人體必需的營養(yǎng)。另外，貧血的風(fēng)險(xiǎn)會增加。在提供可吸收的鐵元素方面，肉類是無可比擬的來源，它在提供維生素B12方面同樣如此?？傊蔀樗厥痴呔托枰獣r(shí)間，因?yàn)檫@很復(fù)雜，而復(fù)雜就意味著風(fēng)險(xiǎn)。素食者通常缺乏維生素，輕度貧血……他們還需額外補(bǔ)充營養(yǎng)食品。

問：避免營養(yǎng)不良的最佳食譜是什么？

答：什么都吃，但要適量。這樣就能遠(yuǎn)離營養(yǎng)不良。正因如此，我們才是雜食動物！魚和雞蛋作為紅肉的替代也是動物蛋白的良好來源，而紅肉能提供更多的維生素B12和鐵。最根本的是不要排斥任何一類食品。比如，如果我們不愛喝奶或者對奶消化不良，那么我們也不能放棄所有奶制品，可以繼續(xù)吃奶酪或喝酸奶。

問：對不同的年齡段是否有特別的建議？

答：成年人可以少吃一點(diǎn)動物蛋白，因?yàn)槌赡耆松眢w具有不可思議的適應(yīng)性。但要求小孩或老人吃素食則會帶來巨大的營養(yǎng)不良風(fēng)險(xiǎn)。目前的社會試圖將蔬菜視為有百利而無一害的食品，這是錯誤的。為了達(dá)到健康的最佳狀態(tài)以及恪守預(yù)防在先的原則，應(yīng)該選擇雜食。

但請注意，這并不意味著每天吃兩次肉。在當(dāng)下這個(gè)飽食的社會，一些人確實(shí)吃肉過量。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2015-10-29）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0121-03

2015-12-10

孫龍（1988-），男，山東昌邑人，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)橐?guī)模化豬場主要疫病的控制與凈化. E-mail：461579682@qq.com