一例嚴(yán)重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷

趙軍，朱玲，徐志文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川成都611130）

一例嚴(yán)重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷

趙軍，朱玲，徐志文

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)中心，四川成都611130）

2015年7月，四川眉山某豬場(chǎng)發(fā)生15日齡左右仔豬大面積死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、抽搐、呼吸急促、精神沉郁、不采食等，病程短，發(fā)病1 d后死亡，呈現(xiàn)典型病毒病癥狀。發(fā)病率達(dá)80%，死亡率達(dá)100%。剖檢病死豬發(fā)現(xiàn)全身淋巴結(jié)出血，肺瘀血、水腫，打開顱腔后發(fā)現(xiàn)腦和脊髓膜充血出血，通過流行病學(xué)和實(shí)驗(yàn)室診斷確診為偽狂犬病和流行性乙型腦炎混合感染。

豬乙型腦炎；豬偽狂犬病；混合感染；診斷

流行性乙型腦炎是由黃疸病毒科乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）引起的蚊媒性嚴(yán)重危害人畜健康的急性傳染病，主要通過蚊叮咬吸血傳播。臨床表現(xiàn)為高熱、狂暴或沉郁、意識(shí)障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激等神經(jīng)癥狀，具有明顯的季節(jié)性和一定的地理分布區(qū)域，多發(fā)生于蟲蚊較多的夏秋季節(jié)，屬于自然疫源性疾病[1-2]。豬在乙型腦炎的傳播中起著很重要的作用，被認(rèn)為是其擴(kuò)大傳播的主要容器[3]。乙型腦炎能引起母豬繁殖障礙，懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，公豬急性睪丸炎，嚴(yán)重時(shí)喪失配種能力[4]。

豬偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabiesvirus,PRV）引起的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎為主要癥狀的急性高度接觸性傳播疾病，新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[5]；成年豬感染后表現(xiàn)為一過性發(fā)熱，打噴嚏，多可耐過，呈隱性感染，但造成長(zhǎng)期帶毒、排毒，成為傳染源，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年7—8月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心進(jìn)行。

1.2 病料采集

本次通過臨床診斷和剖解病理變化的觀察，對(duì)疾病初步判定為乙腦和偽狂犬病，針對(duì)該兩種疾病無菌采集相關(guān)病變較嚴(yán)重的器官、組織。分別采集兩頭病死豬腦、扁桃體、淋巴結(jié)、肺臟、脾臟、肝臟，分別編號(hào)為1號(hào)、2號(hào)；同時(shí)采集其鼻腔分泌液，分別編號(hào)1號(hào)、2號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原診斷[7]。

1.3 菌種及主要試劑

大腸桿菌DH5α由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存。PMD19-Tsimple載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA Marker DL 2 000、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒等購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物合成

引用文獻(xiàn)[8]乙腦病毒引物序列，根據(jù)GenBank中收錄的偽狂犬病病毒（PRV）全基因序列經(jīng)DNAStar進(jìn)行同源性分析，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，在用NCBI在線BLSAT對(duì)引物的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)計(jì)上、下游引物，分別是PRV-E1：5'-ACCTGAGCGTCC TGCGG-3'，PRV-E2：5'-CCGTTGTGGGTCATCACGA G-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為544 bp；PRV-GE1：5'-CGGG ATCCATGCGGCCCTTTCTGCTGC-3'，PRV-GE2：5'-CGGAATTCTTAAGCGGGGCGGGACATCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 754 bp；JEV-P1：5'-GCTCTTATCACGT TCTTCAAGTTTAC-3'，JEV-P2：5'-TTCCCAGACAAT TAAAACTGTAAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為754 bp。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 病毒總RNA的抽提及PCR擴(kuò)增

組織樣品分別放入勻漿器里，編號(hào)后加1 mL Trizol裂解液進(jìn)行勻漿，勻漿充分后室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液，加入200 μL氯仿迅速振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心15 min；向最后獲得的上清液中加入等量異丙醇沉淀RNA，輕輕搖晃混勻，室溫作用10 min后，12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風(fēng)干，溶解于40 μL無Rnase水中，-20℃保存?zhèn)溆?。按照寶生物工程（大連）有限公司RT-PCR試劑盒說明書合成cDNA，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆?。以P1、P2為檢測(cè)引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。以本實(shí)驗(yàn)室建立的豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的檢測(cè)方法分別進(jìn)行相關(guān)病原的檢測(cè)。反應(yīng)體系為ddH2O 3 μL，2×Taq PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 病毒總DNA的抽提及PCR擴(kuò)增

組織樣品放入勻漿器，勻漿充分后室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液500 μL，加入500 μL飽和酚迅速振蕩，室溫靜置5 min，12 000 r/min，離心5 min；取上清液，向獲得的上清液中加入200 μL氯仿、飽和酚搖勻靜置5 min，輕輕搖晃混勻，12 000 r/min離心5 min；取上清液，向上清液中加400 μL的氯仿?lián)u勻靜置5 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加2倍體積的異丙醇輕輕搖勻，放入-20℃凍20 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，加1 mL 700 mL/L冰乙醇，12 000 r/min離心5 min，輕輕棄去無水乙醇，自然風(fēng)干，溶解于40 μL ddH2O中，-20℃保存?zhèn)溆?。以E1、E2為檢測(cè)引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min，95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。反應(yīng)體系為ddH2O 2 μL La Taq DNA聚合酶0.1 μL dNTP Mixture 1 μL，2×GC Buffer II 5 μL，上下游引物各0.5 μL模板1 μL，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.7 JEV PrM/c基因和PRV-gE全基因的克隆與序列測(cè)定

用膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，按照PMD19-Tsimple載體試劑盒說明書連接后將篩選的陽性重組質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司測(cè)序。

使用DNAStar軟件[6]對(duì)克隆獲得的PRV gE全基因序列進(jìn)行拼接。從NCBI的GenBank中下載部分世界毒株序列作為參考與試驗(yàn)獲得的序列比較。同時(shí)用Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）對(duì)序列的同源性進(jìn)行確認(rèn)。多重序列的對(duì)齊由ClustalW完成。采用MEGA6.0中的近鄰結(jié)合法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹用于PCV2全基因的分子遺傳進(jìn)化分析。所有分析都是在使用Kimura-2參數(shù)模型下對(duì)JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）而進(jìn)行的。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病哺乳仔豬體溫41.3～41.7℃，患豬渾身無力，顫抖，抽搐，站立不穩(wěn)，精神沉郁，昏睡，嘔吐奶汁，呼吸急促、精神沉郁、不采食、排黃色水狀稀糞。眼瞼水腫，眼球外突，四肢呈游泳狀劃動(dòng)，死亡時(shí)發(fā)出尖叫，牙關(guān)緊咬，角弓反張。

2.2 剖檢病變

剖檢2頭發(fā)病剛死亡哺乳仔豬，主要病變表現(xiàn)為肝臟呈土黃色；腎臟表面有大量針尖狀的紅色出血點(diǎn)，質(zhì)地變脆；肺臟有散在的出血斑，輕微水腫；心臟冠狀脂肪上有針尖狀的出血點(diǎn)；腦膜充血明顯、腦脊液增多；扁桃體腫大、充血、喉頭黏膜充血、水腫。

2.3 病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果

結(jié)合臨床癥狀和流行病學(xué)調(diào)查，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)針對(duì)病原做了相關(guān)檢測(cè)。乙腦病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒做了RT-PCR檢測(cè)，偽狂犬病病毒做了PCR檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見表1，凝膠電泳如圖1。

表1 乙腦病毒和偽狂犬病病毒檢測(cè)

圖1 電泳檢測(cè)結(jié)果

2.4 序列分析

對(duì)JEV PrM/c基因（721 bp）和PRV-gE全基因序列（1 737 bp）進(jìn)行序列同源性分析，結(jié)果顯示，發(fā)病豬場(chǎng)感染的乙腦病毒屬于基因Ⅲ型，序列同源性為99%；眉山（ms）分離到的豬偽狂犬病gE全基因與參考株之間的相似性為98.3%～98.7%（圖2），表明眉山株gE基因的變異明顯。從圖3進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，眉山株與福建分離株（福建株登錄號(hào)為FJ176390.1）距離最近。

圖2 眉山株與選取的參考株之間的遺傳距離

圖3 眉山株與參考株建立的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

豬偽狂犬病病毒和豬乙型腦炎病毒是導(dǎo)致豬繁殖障礙的兩種主要病原，并且兩種病毒均為多宿主病原。乙型腦炎作為人獸共患病受到很大的重視并積極預(yù)防；除了豬以外其他宿主感染偽狂犬病病毒后死亡率為100%。當(dāng)前針對(duì)偽狂犬病雖然有基因缺失疫苗[9]，針對(duì)乙型腦炎有弱毒疫苗[10]，但是在養(yǎng)豬生產(chǎn)中這兩種疾病卻常有發(fā)生。本次案例發(fā)生時(shí)間為2015年7月，正值酷暑蚊蟲肆虐季節(jié)，為乙型腦炎的傳播提供了條件。

從臨床癥狀分析不難得出，兩種病原一起發(fā)病勢(shì)必會(huì)對(duì)仔豬造成快速的病理損傷。在剖檢病理觀察時(shí)，病變部位幾乎遍布大部分器官組織，并且多為急性出血、充血。總結(jié)分析以往多例偽狂犬病發(fā)病臨床癥狀，此次偽狂犬病極有可能存在很大的抗原表位漂移導(dǎo)致其組織嗜性發(fā)生變化，從而導(dǎo)致豬發(fā)病后所表現(xiàn)的臨床癥狀發(fā)生改變。

基因序列分析表明，本次獲得的乙型腦炎病毒基因序列在基因分型上屬于基因Ⅲ型，并未測(cè)毒力基因，所以不再做過多分析。本次獲得的偽狂犬病病毒gE基因序列從遺傳距離圖譜可以得出，其與從NCBI收錄的PRV gE序列的同源性在98.3%～98.7%之間，與福建分離株的同源性最高，從遺傳進(jìn)化樹分析可以得出眉山株的變異情況明顯。

當(dāng)前，規(guī)?；i場(chǎng)雖然在疾病的防控和治療上都相對(duì)規(guī)范，但是各種病毒病和細(xì)菌病卻時(shí)有發(fā)生，多維多病原混合感染，加之豬只免疫力低下，因此，臨床上治療疾病的難度很大。豬場(chǎng)要貫徹“養(yǎng)重于防，防重于治，預(yù)防為主，養(yǎng)防結(jié)合”的方針，認(rèn)真落實(shí)各項(xiàng)生物安全措施，防止病原侵入豬場(chǎng)。針對(duì)豬病要做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早用藥、早治療；用藥對(duì)路、方法科學(xué)、方案可行，藥量足，療程夠的方針。堅(jiān)持消毒制度，豬舍周圍要填平洼地，鏟除雜草，清理雜物，殺滅各種吸血昆蟲及鼠等，并用2%火堿水溶液進(jìn)行消毒。養(yǎng)豬場(chǎng)要少用或不用抗生素，尤其是不要濫用或長(zhǎng)期使用劣質(zhì)的抗生素，因?yàn)檫@些藥物不僅對(duì)機(jī)體具有免疫抑制作用，影響疫苗的免疫效果，而且易產(chǎn)生耐藥性與藥物殘留，影響預(yù)防與治療疫病的效果，威脅公共衛(wèi)生的安全。搞好免疫預(yù)防，提高豬群的特異性免疫力，制定合理的免疫程序，不要盲目接種疫苗，只有科學(xué)有效地管理豬場(chǎng)的日常生產(chǎn)生活才能使效益最大化。

[1]趙以云，王強(qiáng)，左瑞華.豬乙型腦炎的診斷與科學(xué)防治[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009（Z1）：8-11.

[2]胡仲達(dá).豬乙型腦炎病的診斷與防制[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（1）：329-330.

[3]曹俊衛(wèi).淺談豬乙型腦炎的防治措施[J].農(nóng)民致富之友，2014（6）：233-234.

[4]高群，馮琦璞，王宇.豬乙型腦炎診斷技術(shù)[J].北京農(nóng)業(yè)，2011（12）：92-93.

[5]陳葉，付新亮，粟碩，等.豬偽狂犬的防控策略和凈化[J].廣東飼料，2014（6）：46-48.

[6]景廣宇.豬偽狂犬的診斷方法及防治措施[J].畜禽業(yè)，2014（11）：78-80.

[7]朱秀高.豬場(chǎng)病原檢驗(yàn)方法的應(yīng)用分析與建議[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2013（2）：14-17.

[8]袁磊.四川地區(qū)乙型腦炎病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查研究[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9]劉濤，趙京媛，孫曉成.豬偽狂犬疫苗研究進(jìn)展[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊，2012（12）：72-74.

[10]巢偉，張桂紅，徐雷.豬乙型腦炎病毒SA14-14-2疫苗株基礎(chǔ)種子的鑒定[J].中國(guó)獸藥雜志，2014（7）：15-18.

（編輯：富春妮）

S858.28

A

1002-1957(2016)01-0108-03

2015-11-23

長(zhǎng)江學(xué)者發(fā)展計(jì)劃（IRT13083）

趙軍（1991-），男，四川瀘州人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病病原分子生物學(xué).E-mail：zhaojun＠126.com

朱玲，教授，博士.E-mail：abtczl72＠126.com