一例多種病毒混合感染的實驗室診斷及綜合防制措施

楊凡，李萍，樊毅，趙軍，陳盼，朱玲，2，徐志文，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

一例多種病毒混合感染的實驗室診斷及綜合防制措施

楊凡1，李萍1，樊毅1，趙軍1，陳盼1，朱玲1，2，徐志文1，2

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

2016年3月，彭州某豬場出現(xiàn)疑似豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）混合感染嚴(yán)重疫情，豬群發(fā)病率和死亡率較高。為進(jìn)一步確診和提供科學(xué)的防控依據(jù)，采集10頭繁殖障礙母豬（未曾注射PRRSV疫苗）血樣，用IDEXX試劑盒進(jìn)行豬瘟病毒（CSFV）、PRRSV和PRV gE抗體檢測。同時采集2頭流產(chǎn)胎兒（對應(yīng)2頭流產(chǎn)母豬）組織分別進(jìn)行CSFV、PRRSV的RT-PCR檢測和PRV gE的PCR檢測，采集2頭腹瀉同時伴隨神經(jīng)癥狀的仔豬組織進(jìn)行TGEV、PEDV、豬輪狀病毒（RV）的RT-PCR檢測和PRV gE的PCR檢測。結(jié)果顯示，母豬CSFV抗體陽性率達(dá)90%，對應(yīng)流產(chǎn)胎兒未檢出CSFV，表明無CSFV感染，免疫合格；PRRSV和PRV gE抗體陽性率達(dá)100%，對應(yīng)流產(chǎn)胎兒均測出PRRSV和PRV，表明這兩種病毒感染情況嚴(yán)重；2頭仔豬PCR和RT-PCR結(jié)果提示均有PRV、PEDV和TGEV野毒感染，并根據(jù)以上檢測結(jié)果提出緊急防控措施。

PRRSV；PRV gE；TGEV；PEDV；混合感染

2016年3月，彭州某豬場大量母豬（未曾注射豬藍(lán)耳病疫苗）發(fā)生繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)，產(chǎn)死胎和木乃伊胎；2周齡以內(nèi)仔豬突發(fā)嘔吐、拉灰白色或黃綠色稀糞，腥臭味嚴(yán)重，且部分仔豬出現(xiàn)臥地不起、四肢如“劃水狀”神經(jīng)癥狀，死亡率達(dá)95%以上。仔豬剖檢發(fā)現(xiàn)肺淤血、水腫、肉變；脾腫大；小腸腸壁變薄、透明，腸內(nèi)有灰綠色或黃白色黏稠液體；胃內(nèi)含大量凝乳塊；腎臟散在針尖大小出血點；全身淋巴結(jié)不同程度腫大、出血，尤其是肺門淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)；腦充血、出血。初步診斷為豬藍(lán)耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）混合感染[1-4]，可能還有豬輪狀病毒（Rotavirus,RV）感染[5]，為進(jìn)一步確診并為豬場擬定緊急防控措施，特采集樣品進(jìn)行實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3—4月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心實驗室進(jìn)行。

1.2 試驗試劑

Trizol細(xì)胞裂解液、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2× Taq PCR Master Mix、Taq HS酶、2×GC buffer和dNTP Mixture均購自寶生物工程（大連）有限公司；美國愛德士（IDEXX）豬瘟病毒（CSFV）、PRRSV和PRV gE抗體檢測試劑盒，均購自四川佑策農(nóng)業(yè)技術(shù)咨詢有限公司；飽和酚、氯仿（氯仿和異戊醇體積比24∶1）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。

1.3 試驗器材

美國Thermo Micro21R微量離心機(jī)購自賽默飛成都分公司；美國BIO-RAD酶標(biāo)儀、PCR儀均購自成都百樂科技有限公司；Eppendorf（EP）管、10 mL注射器。

1.4 樣品采集及處理

選取10頭繁殖障礙母豬（編號1～10），耳緣靜脈采血2～3 mL，室溫靜置1 h后自然析出血清[6]，轉(zhuǎn)移至無菌EP管中，帶回實驗室檢測CSFV、PRRSV和PRV gE抗體。

無菌采集2頭流產(chǎn)胎兒（編號A和B，對應(yīng)1號和2號母豬）肺、脾臟和小腦，以檢測CSFV、PRRSV、PRV gE；無菌采集2頭腹瀉同時伴隨神經(jīng)癥狀的仔豬（編號C和D）肺、脾臟、小腸及腸系膜淋巴結(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)，以檢測PEDV、TGEV、RV。將組織剪碎、研缽研磨，加PBS制成1∶5組織懸液，置-20℃和37℃反復(fù)凍融3次，4℃3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.5 抗體檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）方法，運用IDEXX公司抗體檢測試劑盒，對分離的10頭繁殖障礙母豬血清進(jìn)行CSFV、PRRSV和PRV gE抗體檢測。試驗設(shè)置陰、陽性對照各2孔，并嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 引物設(shè)計

CSFV、PRRSV和PRV gE引物均由動物生物技術(shù)中心實驗室設(shè)計，參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計PEDV、TGEV和RV引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 樣品檢測所用引物

1.7 病料總RNA抽提及RT-PCR擴(kuò)增

取適量A、B胎兒和C、D仔豬病料的上清液，用Trizol法抽提病料總RNA，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[8]。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書制備cDNA，RT-PCR反應(yīng)體系10.0 μL：ddH2O 3.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1.0 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53～57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃總延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 病料總DNA抽提及PCR擴(kuò)增

取適量A、B胎兒和C、D仔豬病料制備的上清液，用飽和酚、氯仿法抽提病料總DNA，具體操作步驟參照文獻(xiàn)[8]。PRV gE的PCR反應(yīng)體系10.0 μL：2× GC buffer 4.5 μL，ddH2O 1.0 μL，dNTP 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，PRV上游引物0.5 μL，PRV下游引物0.5 μL，Taq HS酶0.5 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次；72℃總延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測結(jié)果

10頭繁殖障礙母豬血清檢測結(jié)果顯示，CSFV陽性率達(dá)90%，PRRSV和PRV gE陽性率達(dá)100%，詳見表2。

表2 母豬抗體檢測結(jié)果

2.2 流產(chǎn)胎兒鑒定結(jié)果

2頭流產(chǎn)胎兒經(jīng)RT-PCR和PCR鑒定，提示均為CSFV陰性，高致病性藍(lán)耳病病毒和PRV gE陽性（圖1—圖3）。

圖1 CSFV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖2 PRRSV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖3 PRV gE PCR鑒定結(jié)果

2.3 仔豬鑒定結(jié)果

檢測結(jié)果提示，2頭仔豬均為PEDV和TGEV陽性，RV陰性，PRV gE陽性（圖4—圖7）。

圖4 PEDV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖5 TGEV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖6 RV RT-PCR鑒定結(jié)果

圖7 PRV gE PCR鑒定結(jié)果

3 討論

CSFV、PRRSV和PRV一直以來都是危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病，幾種病毒均可引起種公豬、母豬繁殖障礙。病毒可垂直傳播給子代，導(dǎo)致母豬流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱胎等，仔豬發(fā)病率和死亡率較高，感染豬耐過后一般發(fā)育狀態(tài)不佳[1-2]。目前，CSFV和PRV一般通過注射疫苗來進(jìn)行防控，但關(guān)于是否給豬群注射弱毒疫苗以預(yù)防PRRSV野毒感染，一直都是學(xué)術(shù)界討論的熱點。市售的CSFV疫苗一般包括脾淋苗和細(xì)胞苗[9]，前者是經(jīng)CSFV感染兔之后，經(jīng)非適宜宿主弱化后，采集兔脾臟和淋巴結(jié)等制作而成，產(chǎn)生抗體所需劑量較大，成本高；后者是經(jīng)細(xì)胞傳代獲得，抗原含量高，成本低廉，目前臨床上一般將兩種疫苗混合使用。如今所用的PRV疫苗，均缺失過gE毒力基因[10]，因此通過ELISA技術(shù)即可診斷豬群是否感染野毒。本文采集的10頭未曾注射過PRRSV疫苗的繁殖障礙母豬血樣，采用IDEXX公司抗體檢測試劑盒，進(jìn)行CSFV、PRRSV和PRV gE檢測，同時對1、2號母豬的流產(chǎn)胎兒采樣檢測CSFV、PRRSV和PRV gE，抗體檢測結(jié)果顯示，CSFV陽性率達(dá)90%，PRRSV和PRV gE陽性率達(dá)100%，PCR和RT-PCR結(jié)果顯示CSFV陰性，PRRSV和PRV gE陽性，綜合結(jié)果表明豬群可能未感染CSFV野毒，其抗體合格率也達(dá)到我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定以上（群體合格率≥70%），但母豬已感染PRRSV和PRV gE，并經(jīng)胎盤屏障傳播給胎兒，由此才能在胎兒組織中檢測出這兩種病毒。

2頭腹瀉并伴有神經(jīng)癥狀仔豬的PCR和RTPCR檢測結(jié)果提示，2頭豬均有PEDV、TGEV和PRV野毒感染，與根據(jù)臨床癥狀和病理解剖推論的初步診斷結(jié)果大致相符（RV陰性）。PEDV和TGEV是引起仔豬腹瀉的主要病毒，各年齡豬均可發(fā)病，患病豬突發(fā)嘔吐、嚴(yán)重腹瀉，最終脫水死亡。PEDV主要感染10 d以內(nèi)仔豬，死亡率高達(dá)100%，在群體中傳播速度很快，尤其是在密閉、豬只集中的豬場，病理剖檢主要是腸壁變薄、透明，黏膜出血，腸系膜淋巴結(jié)高度充血、腫大；對于TGEV，哺乳仔豬感染后死亡率相對較低，且傳播速度也相對較慢，病理解剖可見胃底部出血嚴(yán)重，且胃內(nèi)含有大量乳白色凝乳塊[3-4]。臨床調(diào)查結(jié)果表明，二者混合感染情況嚴(yán)重，且多發(fā)于寒冷季節(jié)，本次豬場發(fā)病即在3月份。RV感染癥狀與前兩者相似，但發(fā)病情況相對較輕，致病性較強的主要為A群[5]。PRV野毒感染后，母豬和公豬均可出現(xiàn)繁殖障礙，成年豬一般呈隱性感染，可長期向外排毒，但仔豬感染率和死亡率較高，且出現(xiàn)諸如本試驗中2頭患病仔豬所表現(xiàn)出的四肢如劃水樣神經(jīng)癥狀（PRV具強噬神經(jīng)性）[2]。這幾種病毒對仔豬危害巨大，一旦發(fā)病將造成豬場的嚴(yán)重?fù)p失，因此豬場平時采取的防控措施起著舉足輕重的作用。

綜合所有檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該豬場為PRRSV、PRV、PEDV和TGEV多種病毒混合感染，建議立即展開緊急防御措施，避免造成更大損失。方案如下：第一，立即隔離飼養(yǎng)未發(fā)病豬群，對病死豬依照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行撲殺或焚燒掩埋，同時做好整個養(yǎng)殖場的消毒、防疫工作，以切斷傳染源和傳播途徑，且可以防止細(xì)菌繼發(fā)感染。第二，采集未發(fā)病豬只的血液樣品，運用ELISA技術(shù)監(jiān)測豬群的PRV gE和gB抗體，立即淘汰gE抗體陽性豬，對可疑豬只隔離飼養(yǎng)，并采集血樣進(jìn)行重測，同時對PRV gB抗體陰性豬立即補免PRV疫苗，以刺激產(chǎn)生抗PRV抗體。第三，合理調(diào)節(jié)飼料配方和日喂量，可適當(dāng)加入諸如黃芪多糖等可提升機(jī)體免疫力的藥物，以增強機(jī)體抵抗力。

[1]劉國信.豬偽狂犬病、豬瘟、藍(lán)耳病混合感染的診治[J].畜牧市場，2010（12）：55-56.

[2]許立華，王玲，蘆銀華，等.三種豬繁殖障礙性病毒混合感染的分子生物學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技，2004，34（7）：40-43.

[3]顏其貴.豬腹瀉病毒病概述[J].飼料與畜牧·規(guī)模養(yǎng)豬，2013（4）：1-2.

[4]任玉鵬，陳弟詩，蘇生禹，等.三種豬腹瀉病毒性病原多重RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013（10）：1047-1051.

[5]龐昕，紫家前，趙宏坤，等.豬輪狀病毒感染研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2000（4）：43-45.

[6]張麗娟，張桂芳，于憲倉，等.動物的血樣采集和血清分離技術(shù)[J].中國動物保健，2011（7）：33-34.

[7]Song D S,Kang B K,Oh J S,et al.Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus,transmissible gastroenteritis virus,and porcine group A rotavirus[J].J Vet Diagn Invest,2006,18(3): 278-281.

[8]趙軍，朱玲，徐志文.一例嚴(yán)重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷[J].養(yǎng)豬，2016（1）：108-110.

[9]文崇利，蘭家暖，楊厚德，等.豬瘟細(xì)胞苗和脾淋苗免疫效果的對比試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2015（4）：107-108.

[10]楊毅，李文剛，饒寶，等.豬偽狂犬病疫苗的研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22（3）：154-157.

（編輯：富春妮）

飲食對腸道細(xì)菌有重大影響

【美國每日科學(xué)網(wǎng)站4月28日報道】題：生活方式對腸道細(xì)菌有重大影響，腸道細(xì)菌又對健康有重大影響

吃吃喝喝影響著腸道細(xì)菌，可能對健康產(chǎn)生影響。荷蘭格羅寧根大學(xué)/格羅寧根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心遺傳學(xué)家西絲卡·韋門加在研究了食物和藥物對人體腸道內(nèi)細(xì)菌多樣性的影響后得出了這個結(jié)論。該研究刊登在美國《科學(xué)》周刊上。

在這項研究中，研究人員采集了1 100余名“生命線”項目參與者的大便樣本。該項目旨在監(jiān)控荷蘭北部16.5萬名居民的健康狀況。這些樣本被用來分析腸道中細(xì)菌和其他微生物的DNA。除大便外，該研究還收集了參與者的飲食、用藥和健康狀況等信息。

這項研究的獨特之處在于它著眼于普通人群，而以前的研究往往著眼于特定疾病的患者。此外，該研究涵蓋的人群特別大并詳細(xì)研究了他們的腸道DNA。

韋門加表示：“研究人員通常只剖析DNA中能區(qū)分不同菌種的一個特定區(qū)域。我們則繪制了完整的細(xì)菌DNA，以獲得有關(guān)細(xì)菌類型的更詳細(xì)信息?！?/p>

這種DNA分析有可能探究是哪些因素影響著微生物組（我們每個人的腸道細(xì)菌群落都是與眾不同的）的多樣性。

影響因素似乎很多。韋門加說：“比如，飲食會在腸道起作用?！?/p>

經(jīng)常喝酸奶或脫脂乳的人擁有更加多樣的腸道細(xì)菌?？Х群推咸丫埔材茉黾佣鄻有裕Ｄ毯透邿崃匡嬍硠t會使之減輕。

格羅寧根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究員、該研究論文第一作者亞歷山德拉·熱爾納科娃說：“我們共發(fā)現(xiàn)了60個對多樣性有影響的飲食因素，它們的確切影響還很難說。但多樣性和健康之間確有相關(guān)性：越多樣越好?！?/p>

此外，至少有19種藥物—其中有些是廣泛使用的—對微生物組的多樣性有影響。該校研究人員先前的研究已經(jīng)證明抗酸劑會減少多樣性，而抗生素和糖尿病藥物二甲雙胍也有影響。

韋門加強調(diào)，這些都是重大發(fā)現(xiàn)，“疾病往往由多種因素引起，其中大部分因素是無法改變的，比如基因和年齡。但你可以通過調(diào)整飲食和用藥來改變微生物組的多樣性。一旦我們明白了其中的道理，那就會帶來新的可能性?！?/p>

近來的研究證實了這一點的重要性?，F(xiàn)在已經(jīng)可以通過“糞菌移植”來治療肥胖癥，也就是把瘦人的腸道細(xì)菌植入肥胖患者的腸道。適當(dāng)?shù)娘嬍郴蛱囟ǖ乃幬镆苍S可以產(chǎn)生相同的效果。

目前，有關(guān)微生物組的研究很多，但這些研究往往看起來很難復(fù)制。因此，令人驚嘆的是，同一期《科學(xué)》周刊刊登的比利時研究團(tuán)隊的研究結(jié)果與格羅寧根研究團(tuán)隊的結(jié)論有大約80%的一致率。

韋門加表示：“關(guān)鍵在于進(jìn)行研究的方式?！焙苤匾囊稽c是，大便樣本由參與者自己速凍，并且研究人員收集時仍處于冷凍狀態(tài)?！皹颖就ㄟ^郵寄方式送達(dá)。如果那樣的話，就會接觸氧氣和高溫，而細(xì)菌在這些條件下是無法存活的。因此，《科學(xué)》周刊上這兩篇論文為這個領(lǐng)域今后的研究確立了一個新標(biāo)準(zhǔn)?！?/p>

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2016-05-03）

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0113-04

2016-04-12

長江學(xué)者發(fā)展計劃（IRT13083）；四川省科技成果轉(zhuǎn)化項目（2013NC0014）

楊凡（1992-），男，四川南充人，在讀碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究.E-mail:abtcyf@126.com

徐志文，教授，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)研究.E-mail:abtcxzw@126.com