天津某豬場沙門氏菌的分離鑒定

楊曉偉，蒙曉雷，郭戀，王健春

（1.天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津北辰300402；2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津北辰300402）

天津某豬場沙門氏菌的分離鑒定

楊曉偉1，蒙曉雷2，郭戀2，王健春2

（1.天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津北辰300402；2.天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，天津北辰300402）

利用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）、科瑪嘉（ECC）沙門氏菌顯色培養(yǎng)基和分子生物學(xué)方法對豬場疑似沙門氏菌感染的仔豬腹瀉糞樣進(jìn)行沙門氏菌的分離鑒定。根據(jù)SS選擇性培養(yǎng)基上菌落形態(tài)選取疑似沙門氏菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色，確定是否符合沙門氏菌的革蘭氏染色形態(tài)，并將疑似菌落涂布于科瑪嘉（ECC）沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，當(dāng)長出紫色菌落時(shí)可初步確定為沙門氏菌，最后進(jìn)行PCR鑒定。將分離出的陽性沙門氏菌進(jìn)行玻片凝集試驗(yàn)鑒定血清型。經(jīng)鑒定，分離株的血清型主要有鼠傷寒沙門氏菌與德爾卑沙門氏菌兩種。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，沙門氏菌對青霉素類的氨芐西林、阿莫西林及第1代喹諾酮類藥物萘啶酸表現(xiàn)出明顯的耐藥性，對磷霉素、頭孢類藥物敏感。

沙門氏菌；分離鑒定；血清型；藥敏試驗(yàn)

沙門氏菌屬（Salmonella）屬致病能力強(qiáng)的革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，絕大部分無莢膜，主要寄生于人等動(dòng)物腸道內(nèi)，其生化特性和抗原結(jié)構(gòu)相似，兼性厭氧，在三糖鐵瓊脂上培養(yǎng)常產(chǎn)生硫化氫（H2S）。根據(jù)新近的沙門氏菌的分類方案，該屬細(xì)菌包括邦戈?duì)柹抽T氏菌（S.bongori）與腸道沙門氏菌（S.enterica，或稱其為豬霍亂沙門氏菌S.choleraesuis）兩個(gè)種。而腸道沙門氏菌又可以再分成6個(gè)亞種：腸道亞種（enterica）、豪頓亞種（houtenae）、亞利桑那亞種（arizonae）、薩拉姆亞種（salamae）、英迪加亞種（indica）和雙相亞利桑那亞種（diarizonae）。這些種和亞種均屬于對應(yīng)的DNA同源群。沙門氏菌有O、H、K和纖毛4種抗原，其中O和H是主要抗原，沙門氏菌屬根據(jù)不同的H（鞭毛）抗原、O（菌體）抗原和Vi（莢膜）抗原可以分成多種血清型。至今，沙門氏菌已發(fā)現(xiàn)有A～Z與O51～O67共51個(gè)O群，共58種O抗原和63種H抗原[1]。

本病一年四季都可發(fā)生，一般呈散發(fā)性，如果有惡劣因素的嚴(yán)重刺激，也能呈地方性流行。傳染源主要是發(fā)病者和帶菌者。有兩種傳播途徑：一種是由于生病畜禽及帶菌者排出的病原體污染了土壤、水源或飼料，健康畜禽食用了被病原菌污染的飼料而感染發(fā)病；另一種是該菌平時(shí)即已存在于健康畜禽體內(nèi)但不表現(xiàn)臨床癥狀，只有當(dāng)不良外界因素導(dǎo)致動(dòng)物體的抵抗力下降，病原體大量增殖，毒力也得到加強(qiáng)而導(dǎo)致畜禽疾病。另據(jù)資料表明，健康畜禽的帶菌現(xiàn)象現(xiàn)已非常普遍，病原菌往往潛藏于淋巴組織、膽囊與消化道內(nèi)，可連續(xù)經(jīng)過多只易感畜禽，毒力有時(shí)即可增強(qiáng)而擴(kuò)大感染[2]。

豬感染沙門氏菌后出現(xiàn)急性和慢性兩種類型。急性型在發(fā)病初期體溫升至41℃，病豬食欲不振，精神萎靡，初便秘后腹瀉，排出淡黃色惡臭糞便，在鼻端、耳、頸、腹及四肢內(nèi)側(cè)出現(xiàn)紫色斑，病豬最后會(huì)呼吸困難，衰竭而亡，病期3～5 d。慢性型最為常見，表現(xiàn)為下痢，糞便呈粥狀或水樣，灰白、黃綠等顏色，有時(shí)混有血液；嚴(yán)重時(shí)肛門失禁；有的病豬發(fā)生肺炎，有的病豬出現(xiàn)濕疹樣變化。由于持續(xù)下痢，病豬消瘦、行走搖晃，最后衰竭死亡，病期達(dá)半個(gè)月以上，有的甚至2個(gè)月才死亡[3]。

通過對疑似沙門氏菌感染的仔豬腹瀉糞樣進(jìn)行培養(yǎng)和分離鑒定，革蘭氏染色鏡檢，PCR檢測和血清學(xué)診斷，確定病原菌為沙門氏菌，利用藥敏試驗(yàn)分析各分離株對抗生素的敏感性，以了解臨床分離株的培養(yǎng)特性、耐藥性、致病機(jī)制和沙門氏菌病的癥狀特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2015年7—9月在天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 儀器設(shè)備

超聲波清洗器、多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)、立式高壓蒸汽滅菌器、生物顯微鏡、PCR儀、電泳儀等。

1.3 試劑

沙門氏菌屬診斷血清試劑盒、藥敏紙片、亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)液（SC）、SS瓊脂、LB肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、PCR混合體系等。

1.4 試驗(yàn)對象

疑似沙門氏菌感染的仔豬腹瀉糞樣來自于天津某家豬場中6棟豬舍。

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）標(biāo)準(zhǔn)株購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（China Center of Industrial Culture Collection,CICC）；CICC編號：22956（微生物菌種應(yīng)保存于低溫、干燥和清潔的地方，室溫時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致菌種衰退）。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 沙門氏菌的分離與純化

（1）取疑似沙門氏菌感染的仔豬腹瀉糞樣2 g（糞樣多時(shí)最好多取）于離心管中，隨后加入14 mL SC增菌液，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)24 h。

（2）用接種環(huán)蘸取增菌液劃線接種于SS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。

（3）用接種環(huán)蘸取上述可疑菌落于含5 mL LB湯培養(yǎng)基的離心管中，置于恒溫培養(yǎng)箱37℃，培養(yǎng)24 h。

（4）同樣選取上述SS培養(yǎng)基上沙門氏菌可疑菌落涂布于科瑪嘉（ECC）沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)一步確認(rèn)是否為沙門氏菌。當(dāng)科瑪嘉沙門氏菌選擇性培養(yǎng)基上生長紫色菌落時(shí)即可確定上述疑似菌落為沙門氏菌。

（5）挑取科瑪嘉（ECC）培養(yǎng)基上生長的紫色菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.5.2 革蘭氏染色鏡檢依據(jù)常規(guī)染色法進(jìn)行染色鏡檢[4]。

1.5.3 PCR檢測

（1）PCR擴(kuò)增使用通用引物invA，引物序列長度為605 bp，上游引物F序列：invAF 5′-AAACCTA AAACCAGCAAAGG-3′，下游引物R序列：invAR 5′-TGTACCGTGGCATGTCTGAG-3′。

（2）PCR反應(yīng)體系（使用博邁德反應(yīng)試劑）：2× Master Mix 12.5 μL；ddH2O 8.5 μL；模板2 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL。

（3）PCR反應(yīng)循環(huán)設(shè)置：94℃3 min；94℃30 s；55℃30 s；72℃1 min；72℃5 min；30個(gè)循環(huán)。

（4）取PCR產(chǎn)物5 μL放入有Goldvlew的2%瓊脂糖凝膠，并同時(shí)加PCR Marker和陰陽性對照，140 V，跑膠30 min。

（5）將跑好的瓊脂糖凝膠放于凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.5.4 沙門氏菌的血清型鑒定根據(jù)沙門氏菌血清學(xué)鑒定國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.4—2010）進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，鑒定沙門氏菌血清型的O抗原與H抗原，劃分血清型。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離鑒定及PCR檢測結(jié)果

分離得到的6株菌，編號分別為1、2、3、4、5、6。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果可見紅色的革蘭氏陰性、大小均勻、無芽孢和莢膜、多散在排列的兩端鈍圓短桿狀菌。PCR檢測結(jié)果見圖1。

2.2 血清型鑒定

1、2、3、4、5號菌株血清型為1，4，[5]，12:i:1，2，經(jīng)查閱資料可知其為鼠傷寒沙門氏菌（S.typhimurium）[1]；6號菌株血清型為1，4，[5]，12:f:g:[1，2]，經(jīng)查閱資料可知其為德爾卑沙門氏菌（S.derby）[1]。

圖1 PCR檢測結(jié)果

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由圖2—圖10可知，6株沙門氏菌對抗生素的敏感程度由高到低依次為磷霉素、頭孢哌酮、加替沙星、頭孢拉定、卡那霉素、新霉素、萘啶酸、氨芐西林、阿莫西林。

圖2 阿莫西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖3 氨芐西林藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖4 加替沙星藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖5 卡那霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖6 頭孢拉定藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖7 萘啶酸藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖8 新霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖9 磷霉素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖10 頭孢哌酮藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 分離鑒定

在臨床導(dǎo)致仔豬副傷寒的沙門氏菌主要有腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌、豬傷寒沙門氏菌Voldagsen變型、豬霍亂沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌Kunzendorf變型、德爾卑沙門氏菌等。在仔豬腹瀉糞樣中分離得到了6株菌，其中5株為鼠傷寒沙門氏菌，1株為德爾卑沙門氏菌，佐證了鼠傷寒沙門氏菌的高分離率，德爾卑沙門氏菌較罕見，表明了沙門氏菌所導(dǎo)致的腹瀉中鼠傷寒沙門氏菌占較大比重而德爾卑沙門氏菌占的比重少，也說明了沙門氏菌對仔豬有較強(qiáng)致腹瀉作用。

3.2 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在豬場中青霉素類的氨芐西林、阿莫西林以及第1代喹諾酮類藥物萘啶酸表現(xiàn)出明顯的耐藥性，這與臨床用藥有很大關(guān)系，青霉素類由于其應(yīng)用較早，在臨床上形成了很多的耐藥菌株。喹諾酮類成為青霉素類治療腹瀉的替代品，逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用，耐藥菌株也在增多，對于沙門氏菌病青霉素類、部分喹諾酮類作用已經(jīng)不大。要根據(jù)藥敏試驗(yàn)的結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥，切不可盲目用藥，導(dǎo)致耐藥菌譜擴(kuò)大，并達(dá)到以盡可能少的藥物達(dá)到最佳治療效果，避免出現(xiàn)無藥可醫(yī)的局面。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從仔豬腹瀉糞樣中分離出鼠傷寒沙門氏菌（S.Typhimurium）與德爾卑沙門氏菌（S.Derby）這兩種血清型的沙門氏菌，不僅說明了沙門氏菌是導(dǎo)致仔豬腹瀉的重要病原菌，而且鼠傷寒沙門氏菌是其中較常見的病原菌，對于沙門氏菌導(dǎo)致的仔豬腹瀉的治療宜選用像磷霉素、頭孢類藥物，此類藥物目前仍能起到良好的治療效果，沙門氏菌的侵染途徑是先侵入小腸上皮進(jìn)入血液，引起菌血癥甚至敗血癥，隨后隨血液侵入其他組織，引起較嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病。

[1]黃嬙，劉衛(wèi)國，馬飛，等.沙門氏菌病的防控[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（11-12）：163-165.

[2]黃偉，湯德元，楊澤平，等.豬沙門氏菌病的診斷方法及防制研究進(jìn)展[J].豬業(yè)科學(xué)，2010（4）：76-77.

[3]王連純，王楚端，齊志明.養(yǎng)豬與豬病防治[M].第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2003：339-350.

[4]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：15-17.

（編輯：富春妮）

Isolation and Identification of Salmonella in a Pig Farm in Tianjin

YNAG Xiaowei1,MENG Xiaolei2,GUO Lian2,WANG Jianchun2
（1.Tianjin Institute of Veterinary Drug and Feed Control,Tianjin 300402,China; 2.Tianjin Center of Animal Disease Prevention and Control,Tianjin 300402,China)

The Salmonella from faeces of the same pig farm that suspectedly had undergone Salmonella infection were isolated and identified by use of selenite cysteineenrichment broth(SC),Salmonella-shigella agar(SS)and molecular biological method.Based on the morphology on SS culture medium,the suspected single colony was picked up and performed the Gram staining to ensure whether it is consistent with the morphology of gram-negative bacteria.In addition,the suspected single colony was inoculated to CHROM agar Salmonella colored medium where Salmonella would grow to purple colonies.Those highly suspected Salmonella colonies would be confirmed by PCR method.The serotype of isolated Salmonella strains were assayed by slide agglutination test.The results showed those positive Salmonella strains mainly contained two serotypes,Salmonella typhimurium and Salmonella derby.Six clinical strains respectively isolated from the pig farm were compared through the drug resistance test. The drug sensitive test indicated that:Salmonella showed obvious resistance to Ampicillin and Amoxicillin of Penicillins,Naphthalene acid of the first generation of Quinolones,but Salmonella is sensitive to Fosfomycin and Cephalosporins.

Salmonella;isolation and identification;serotype;drug sensitive test

S858.282.61+2

A

1002-1957(2016)03-0105-04

2016-04-14

楊曉偉（1982-），男，天津人，獸醫(yī)師，碩士，主要從事獸藥、飼料和動(dòng)物疫病的監(jiān)測工作.E-mail:tgmonia@163.com