藏豬和杜洛克豬IGF-2基因表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析

陶璇，顧以韌，梁艷，楊雪梅，鐘志君，陳曉暉，楊躍奎，曾凱，呂學(xué)斌

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610066）

藏豬和杜洛克豬IGF-2基因表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀相關(guān)性分析

陶璇1，2，顧以韌1，2，梁艷1，2，楊雪梅1，2，鐘志君1，2，陳曉暉1，2，楊躍奎1，2，曾凱1，2，呂學(xué)斌1，2

（1.四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2.動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610066）

為了揭示脂肪型的藏豬和瘦肉型的杜洛克豬胰島素樣生長因子2（IGF-2）基因的表達(dá)差異，采用QRT-PCR方法檢測了兩豬種背最長肌中IGF-2基因在180日齡的表達(dá)差異，并分析其與肌纖維面積、肌內(nèi)脂肪（IMF）含量的相關(guān)性。結(jié)果表明，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達(dá)量顯著低于杜洛克豬（P<0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IGF-2 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。以上結(jié)果初步揭示了兩豬種在180日齡IGF-2基因表達(dá)的品種差異，為深入研究肌纖維生長及IMF沉積的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

豬；背最長肌；熒光定量PCR；IGF-2基因；肌纖維面積；肌內(nèi)脂肪含量

胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF-2）作為胰島素樣生長因子家族成員之一，在胎兒生長發(fā)育、腫瘤細(xì)胞增殖、肌肉生長和基因組印跡等方面具有重要的調(diào)控作用，是影響豬胴體瘦肉率和背膘厚度的重要候選基因之一[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，向背膘更厚的遺傳選擇會(huì)提高血漿IGF-2濃度[4-5]。公豬在15～23周齡之間時(shí)，IGF-2濃度與背膘厚呈負(fù)相關(guān)[6]，預(yù)示IGF-2可能是調(diào)節(jié)脂肪沉積的主要因子之一。

本研究以選育程度低、瘦肉率低的藏豬和選育程度高、瘦肉率高的杜洛克豬為研究對(duì)象，采用熒光定量PCR（QRT-PCR）方法研究兩豬種180日齡時(shí)背最長肌中IGF-2 mRNA的表達(dá)差異及其與肉質(zhì)性狀肌纖維面積（Cross sectional area of muscle fiber, CSA）和肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量的關(guān)系，為研究IGF-2基因影響肌纖維面積、IMF含量的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及采樣

試驗(yàn)采用的藏豬、杜洛克豬均由四川省畜牧科學(xué)研究院科研試驗(yàn)豬場提供。于2014年5月隨機(jī)挑選35日齡斷奶的藏豬、杜洛克豬各4頭，共計(jì)8頭組建群體，采用相同營養(yǎng)水平和飼喂方式，到180日齡時(shí)進(jìn)行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。采集倒數(shù)3～4肋骨間對(duì)應(yīng)處的背最長肌樣品，一部分用于IMF含量測定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，隨后投入液氮中保存。

1.2 肉質(zhì)性狀測定

1.2.1 肌纖維面積測定采用KD-2508型切片機(jī)（Kedee公司）按照冰凍切片標(biāo)準(zhǔn)制作流程制作背最長肌樣品的冰凍切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK5000型顯微成相系統(tǒng)（Optec公司）采集代表性區(qū)域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件計(jì)算每個(gè)樣品中100根肌纖維的面積。

1.2.2 肌內(nèi)脂肪含量測定屠宰后采集倒數(shù)3～4肋骨間背最長肌樣品10 g左右，樣品處理和操作嚴(yán)格按照豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范（NY/T 821—2004）進(jìn)行，采用全自動(dòng)快速索氏抽提儀（瑞士，Buchi）進(jìn)行抽提。

1.3 QRT-PCR測定IGF-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄肌肉樣品的總RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）試劑盒的操作說明書完成，并通過Agilent Bioanalyzer 2100對(duì)抽提的RNA進(jìn)行質(zhì)檢，然后使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）進(jìn)行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的設(shè)計(jì)與合成引物由Primer premier 5.0程序設(shè)計(jì)，深圳華大基因科技有限公司合成，信息見表1。

表1 熒光定量RT-PCR目的基因引物的相關(guān)信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad,USA）儀器上進(jìn)行mRNA熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用兩步法進(jìn)行熒光定量PCR的擴(kuò)增。PCR循環(huán)參數(shù)為：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循環(huán)40次，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 s的速率從55.0℃緩慢遞增到95.0℃。試驗(yàn)樣本和陰性對(duì)照每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析

選用肌肉組織中穩(wěn)定表達(dá)的ACTB、TBP和TOP2B為看家基因，運(yùn)用GeNorm軟件計(jì)算出看家基因的歸一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷貝數(shù)（最大拷貝數(shù)設(shè)為1）與對(duì)應(yīng)樣品的NF值的比值表示基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量[7]。采用SigmaPlot 12.5軟件對(duì)性狀指標(biāo)和基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌纖維面積、IMF含量測定

由表2可知，180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積分別為2 221.52、6 351.41 μm2，IMF含量分別為3.08%、2.46%。藏豬肌纖維面積極顯著小于杜洛克豬4 129.89 μm2（P<0.01），IMF含量極顯著高于杜洛克豬0.62個(gè)百分點(diǎn)（P<0.01）。

表2 180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積、IMF含量（n=4）

2.2 IGF-2 mRNA表達(dá)量及其與肌纖維面積、IMF含量相關(guān)性分析

由圖1可知，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達(dá)量顯著低于杜洛克豬（P<0.05）。對(duì)IGF-2 mRNA表達(dá)量與肉質(zhì)性狀肌纖維面積、IMF含量的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。IGF-2 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）。

圖1 6月齡藏豬與杜洛克豬IGF-2基因相對(duì)表達(dá)量

表3 IGF-2 mRNA表達(dá)量與肌纖維面積、IMF含量相關(guān)性分析

3 討論

藏豬是國家級(jí)畜禽資源保護(hù)品種，IMF含量較高，肉質(zhì)優(yōu)良，但生長速度慢，胴體瘦肉率低，屬脂肪型豬種；而杜洛克豬IMF含量較低，肉質(zhì)較差，但生長發(fā)育快，飼料利用率高，胴體瘦肉率高，是典型的瘦肉型豬種。本研究結(jié)果顯示，180日齡藏豬IMF含量極顯著高于杜洛克豬（P<0.01），而肌纖維面積極顯著低于杜洛克豬（P<0.01），這與藏豬和杜洛克豬的種質(zhì)特性相一致。

IGF-2具有提高蛋白質(zhì)合成中氨基酸的利用率并抑制蛋白質(zhì)降解，從而促進(jìn)骨細(xì)胞和肌肉細(xì)胞增殖的作用。研究證明，IGF-2基因?qū)ωi肌纖維發(fā)育、生長及脂肪的沉積有重要影響，進(jìn)而影響生長速度、瘦肉率、背膘厚、背最長肌面積[8-12]。本研究結(jié)果顯示，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達(dá)量顯著低于杜洛克豬（P<0.05），與肌纖維面積呈顯著正相關(guān)（P< 0.05），與IMF含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），說明IGF-2基因能促進(jìn)肌纖維生長、降低肌內(nèi)脂肪沉積，與之前報(bào)道基本一致。

[1]Florini J R,Magri K A,Ewton D Z,et al."Spontaneous"differentiation of skeletal myoblast is dependent upon autocrine secretion of insulin-like growth factor-II[J].Journal of Biological Chemistry,1991,266:15917-15923.

[2]劉桂蘭，蔣思文，熊遠(yuǎn)著，等.胰島素樣生長因子2的遺傳學(xué)特征與生物學(xué)作用[J].遺傳，2002，24（2）：211-213.

[3]吳嫦麗，許繼國，吳同山，等.長白和藍(lán)塘豬印記基因IGF2和H19的時(shí)空表達(dá)研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（3）：388-392.

[4]Lamberson W R,Sterle J A,Matteri R L.Relationships of serum insulin-like growth f actor-II concent rations to growth, compositional,and reproductive traits of swine[J].Journal of Animal Science,1996,74:1753-1756.

[5]Sterle J A,Cantley T C,Lamberson W R,et al.Effects of recombinant porcine somatotropin on placental size,fetal growth, and IGF-I and IGF-II concentrations in pigs[J].Journal of Animal Science,1995,73:2980-2985.

[6]Owens P C,Gatford K L,Walton P E,et al.The relationship between endogenous insulin-like growth factors and growth in pigs[J].Journal of Animal Science,1999,77(8):2098-2103.

[7]Erkens T,Poucke M V,Vandesompele J,et al.Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RTPCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle,and evaluation with PPARGC1A[J].Bmc Biotechnology,2006,6(1): 41.

[8]Annemieke P,Rattink D J,De K,et al.Fine mapping and imprinting analysis for fatness trait QTLs in pigs[J].Mammalian Genome,2000,11(8):656-661.

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[10]Vykoukalova Z,Knoll A,Dvorak J,et al.New SNPs in the IGF2 gene and association between this gene and backfat thickness and lean meat content in Large White pigs[J].Journal of animal breeding and genetics,2006,123(3):204-207.

[11]虞德兵，何宗亮，張偉峰，等.豬IGF-2基因內(nèi)含子3變異的遺傳效應(yīng)分析[J].遺傳，2008，30（1）：87-93.

[12]虞德兵，熊鍇，張宇霞，等.豬IGF2 Intron3 G3072A突變及其在背最長肌中差異表達(dá)[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33（6）：105-109.

（編輯：郭玉翠）

吃素未必有利于環(huán)境

【英國《每日郵報(bào)》網(wǎng)站12月15日?qǐng)?bào)道】堅(jiān)持素食未必像你以為的那么有利于環(huán)境，事實(shí)上，它也許對(duì)環(huán)境有破壞。

卡內(nèi)基-梅隆大學(xué)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與某些肉類相比，許多常見蔬菜每卡路里熱量需要消耗更多資源，還造成更多的溫室氣體排放。

雖然研究證實(shí)降低體重對(duì)環(huán)境有積極影響，但研究人員發(fā)現(xiàn)，健康的飲食會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生更大影響。

他們研究了食品在從種植、加工和運(yùn)輸?shù)戒N售、服務(wù)和家庭存儲(chǔ)的過程中所產(chǎn)生的影響。

研究人員還測量了能源消耗量、藍(lán)色水足跡（水足跡指的是國家、地區(qū)或個(gè)人在一定時(shí)間內(nèi)消費(fèi)的產(chǎn)品和服務(wù)耗費(fèi)的水資源，藍(lán)色水足跡指耗費(fèi)的藍(lán)水資源，藍(lán)水指河流、湖泊、水庫、池塘等地表或地下水資源—本報(bào)注）和溫室氣體排放量。

“吃生菜的溫室氣體排放量是吃培根的三倍，”社會(huì)和決策學(xué)與工程和公共政策教授保羅·菲什貝克說，“許多常見蔬菜每卡路里熱量所需要的資源超過你的想象。與豬肉或雞肉相比，茄子、芹菜和黃瓜顯得特別糟糕?！?/p>

研究人員研究了食品供應(yīng)鏈，以了解美國的肥胖癥與環(huán)境的關(guān)系。

攝入較少熱量和降低體重能減少能源使用量，并使淡水消耗量和溫室氣體排放量下降9%。

然而，吃得更健康反而加大了對(duì)環(huán)境的影響。水果、蔬菜、乳制品和海產(chǎn)品造成能源使用量增加38%，同時(shí)導(dǎo)致用水量增加10%、溫室氣體排放量增加6%。

湯姆說：“飲食和環(huán)境之間關(guān)系復(fù)雜，對(duì)健康有利的未必有利于環(huán)境。政府官員認(rèn)識(shí)到這點(diǎn)很重要，他們將來擬訂膳食指南時(shí)應(yīng)牢記這些相互關(guān)系?！?/p>

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2015-12-18）

Expression Differences of IGF-2 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAOXuan1，2,GUYiren1，2,LIANGYan1，2,YANGXuemei1，2,ZHONGZhijun1，2, CHENXiaohui1，2,YANGYuekui1，2,ZENGKai1，2,LVXuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Insulin-like growth factor 2(IGF-2)gene between Tibet (a fatty,indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations with cross sectional area of muscle fiber(CSA)and intramuscular fat(IMF)content were also analyzed.The results showed that the expression level of IGF-2 mRNA in Tibet pigs was significantly lower than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P<0.05).The correlation analysis results showed that the expression level of IGF-2 mRNA had significant positive correlation with CSA(P<0.05)and significant negative correlation with IMF content(P<0.05).These results suggested that the mRNA level of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and IMF deposition.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;IGF-2 gene;cross sectional area of muscle fiber;IMF content

S828

A

1002-1957(2016)03-0062-03

2016-04-28

四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SASA2014A04）；國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-綜合試驗(yàn)站（CARS-36）；四川省科技支撐計(jì)劃（2014NZ0092）；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（sccxtd-001）；四川省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究.E-mail：taoxuan0106@163.com

呂學(xué)斌（1965-），男，研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究.E-mail：lvxuebin@21cn.com