湖南省部分地區(qū)屠宰豬豬肺炎支原體感染率調(diào)查

施琴，周珊，李君佩，王貴平，朱琳

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

湖南省部分地區(qū)屠宰豬豬肺炎支原體感染率調(diào)查

施琴，周珊，李君佩，王貴平，朱琳

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南長沙410128）

用PCR方法對來源于湖南省株洲市、益陽市、長沙市、岳陽市、邵陽市、衡陽市等6個地區(qū)部分規(guī)模豬場的322份屠宰豬肺樣品進行豬肺炎支原體檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體在該地普遍存在，檢出率分別為：株洲市19.2%（11/57），益陽市18.1%（8/44），長沙市20.0%（13/65），岳陽市17.5%（7/40），邵陽市23.2%（13/56），衡陽市25.0%（15/60）。序列分析表明，試驗的PCR產(chǎn)物與國內(nèi)已出版的相關(guān)序列分別有98%～100%的同源性。試驗結(jié)果證實了豬肺炎支原體在湖南省規(guī)模化豬場不同程度存在，對湖南省防控豬支原體肺炎提供了數(shù)據(jù)參考。

湖南??；屠宰豬；豬肺炎支原體；感染率

豬支原體肺炎（MPS）是一種接觸性的慢性呼吸道傳染病。該病發(fā)率高但死亡率低，在我國常被稱為豬喘氣病。該病主要臨床癥狀是病豬咳嗽、氣喘；病理變化主要是病豬肺部尖葉出現(xiàn)“胰樣”或者“蝦肉樣”病變。豬支原體肺炎的流行與飼養(yǎng)管理水平高低、營養(yǎng)水平高低、疫苗接種與否有密切的關(guān)聯(lián)。

豬肺炎支原體（Mhp）廣泛分布于世界各地，給養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟收益帶來巨大的損失[1-2]；邢福珊等通過臨床觀察、X射線胸透、病理剖檢和病原分離鑒定等方法確診陜西省寶雞、楊凌地區(qū)發(fā)病的3個大型豬場患MPS，發(fā)現(xiàn)不同年齡、性別和品種的豬都能感染MPS[3]。李培峰對疑似病豬病原進行檢測發(fā)現(xiàn)，血清陽性率為1%（2/205），鼻咽拭子陽性率為26.7%（52/195），肺組織病料陽性率為43.7%（31/71）。通過試驗發(fā)現(xiàn)在血清中基本上檢測不出豬肺炎支原體病原，鼻咽拭子和肺組織病料中可以檢測出豬肺炎支原體，且肺組織病料中病原體最高[4]。有學者按不同生長階段對豬群進行分類統(tǒng)計，在368份血清樣品中發(fā)現(xiàn)，仔豬肺炎支原體抗體陽性率為3.1%，抗體呈陰性的占96.9%；成年豬肺炎支原體感染率為31%，抗體呈陰性的占69%[5]。王貴平等用PCR方法在湖南省長沙市5個縣（市、區(qū)）205頭豬中收集326份病料，其中豬肺205份，豬鼻拭子121份，發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體檢出率為24.4%（50/205），豬鼻支原體檢出率為22.3%（27/121）[6]。

綜上所述，豬支原體肺炎廣泛流行于各地，不同性別、年齡、品種的豬均能感染豬肺炎支原體，且發(fā)病率高、死亡率低，給養(yǎng)豬戶、養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失，對Mhp的感染率情況調(diào)查是進行檢疫檢驗的前提和基礎(chǔ)。本試驗擬通過對湖南部分地區(qū)規(guī)模豬場采集的322份豬肺樣本，用PCR進行Mhp檢測，對試驗數(shù)據(jù)進行分析，初步討論導致豬支原體肺炎感染產(chǎn)生可能的原因，為防控MPS提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

322份屠宰豬豬肺樣品，2013年1—2月采集于湖南省某屠宰場。屠宰豬來源于湖南省株洲市、益陽市、岳陽市、長沙市、邵陽市和衡陽市等6個地區(qū)的規(guī)模豬場。豬肺樣品全部低溫運送至實驗室，-20℃冰箱低溫凍存。

1.2 試驗試劑

PCR引物：根據(jù)相關(guān)文獻[6]的相關(guān)內(nèi)容，由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物（Mhp 16s rRNA F）序列：GAGCCTTCAAGCTTCACCAAGA；下游引物（Mhp 16s rRNA R）序列：TGTGTTAGTGACTTTTGCC ACC。退火溫度60℃，預計PCR產(chǎn)物大小為649 bp。

Taq DNA聚合酶、dNTPs：購自寶生物（大連）生物技術(shù)有限公司。

DNA Marker：購自北京天恩澤基因科技公司（Cat：70701-50）。

瓊脂糖凝膠：稱取0.8 g瓊脂糖，溶于1 000 mL 1×TAE電泳緩沖液中，加熱沸騰，瓊脂糖充分溶解后，待自然降溫至60℃加入5 μL 10 mg/mL的EB溶液（溴化乙錠溶液）。置于密封錐形瓶中待用。

溴化乙錠溶液（10 mg/mL）：稱取10 mg溴化乙錠溶于10 mL蒸餾水中，劇烈攪拌，加熱溶解，充分溶解自然冷卻后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

50×TAE緩沖液：稱取Tris 242 g、冰醋酸57.1 g（均為新購入，新開封試劑），EDTA（500 mmol/L pH 8.0）100 mL，加滅菌超純水定容至1 000 mL，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

6×上樣液：購于天根生物工程有限公司。

EP管、PCR管、一次性槍頭：均購自天根生物工程有限公司。經(jīng)121℃、20 min蒸汽高壓鍋滅菌，烘干備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理將自然且完全解凍至室溫（25℃左右）的豬肺樣品，用鑷子選取尖葉、心葉或中間葉部分，用消毒滅菌的手術(shù)剪剪取大小約為1.5 cm× 1.5 cm的樣本材料，置于研缽中充分剪碎，加入2 mL預冷的無菌生理鹽水混合研磨。研磨后用無菌紗布過濾，過濾后取500 μL液體置于1.5 mL EP管中。該液即為豬肺研磨液。

1.3.2 DNA模板的制備將制備的豬肺研磨液10 000 r/min離心5 min，小心吸去上清液，在沉淀中加入50 μL無菌超純水，用槍頭吹打數(shù)次混勻。100℃水浴10 min，立即置于冰水混合物中冰浴10 min。10 000 r/min離心3 min后取上清液，上清液即為DNA模板。

1.3.3 PCR

（1）PCR反應(yīng)體系。Taq酶0.15 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，模板1.0 μL，超純補至25.0 μL。

（2）PCR反應(yīng)體系程序。94℃預變性5 min，按下列3個步驟進行30個循環(huán)：94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s；最后72℃延伸7 min。PCR反應(yīng)完畢即將產(chǎn)物進行電泳或4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 電泳用0.8%瓊脂凝膠在電壓100 V，電流200 mA環(huán)境下電泳27 min。之后在凝膠成像系統(tǒng)中照相。

1.3.5 序列分析和呈送GenBank將兩份Mhp 16S rRNA基因擴增的產(chǎn)物送華大基因武漢中心測序，并用BLAST軟件（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi PAGET YPE）和國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)表的序列進行進行同源性比較。將測得的序列用Bankit方法呈送至NCBI基因庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

在豬肺炎支原體陽性樣本中成功擴增出大小為649 bp的目的條帶（圖1）。與預期結(jié)果相符。

2.2 測序與同源性分析

測序結(jié)果已經(jīng)成功呈送至GenBank，序列號分別是GU569850、GU569851（Mhp 16S rRNA基因）。同源性分析表明與國內(nèi)外相關(guān)序列有98%～100%的同源性。

圖1 Mhp 16S rRNA-PCR檢測照片

2.3 豬肺炎支原體檢出率結(jié)果

檢測樣品總數(shù)為322份，其中陽性樣品數(shù)67份，陰性樣品數(shù)255份?？倷z出率為20.80%（表1）。

表1 豬肺炎支原體感染情況

3 討論

豬支原體肺炎是一種發(fā)病率高但死亡率不高的傳染性疾病，氣溫氣候、飼養(yǎng)管理、免疫機制、疾病防控等都是導致該病發(fā)生的原因。Mhp是一種原發(fā)性病原體，極易使患病豬受到繼發(fā)性感染，也可通過空氣中的飛沫經(jīng)呼吸道傳播感染健康豬，一旦傳播廣泛、迅速，將會給養(yǎng)殖戶帶來巨大的經(jīng)濟損失[7]。

（1）本試驗中發(fā)現(xiàn)Mhp感染比較普遍。本試驗從湖南省株洲醴陵、益陽赫山、瀏陽葛家鄉(xiāng)、岳陽湘陰、邵陽新寧、衡陽耒陽6個地區(qū)共檢樣本數(shù)322份，其中陽性樣本數(shù)67份，總檢出率為20.8%。6個地區(qū)中岳陽市最低（17.5%）；衡陽耒陽最高（25.0%）。6個地區(qū)檢出率都在17%以上，說明這些地區(qū)Mhp感染比較普遍。本試驗用PCR方法可以迅速可靠地檢測Mhp感染，且耗費的人力物力低，可了解湖南地區(qū)規(guī)?；i場Mhp感染的情況，為進一步防控豬支原體肺炎提供參考。本試驗中發(fā)現(xiàn)湖南省部分地區(qū)Mhp感染比較普遍可能與當?shù)氐臍夂驕囟扔幸欢P(guān)系，據(jù)相關(guān)氣象報道，2013年冬季湖南省平均氣溫僅為6.2℃，較常年同期偏低2.0℃，為1951年至今第7低值，為28年來新低。寒冷、雨水、低溫等情況都可能引起豬只感染Mhp。本試驗數(shù)據(jù)為養(yǎng)殖戶提供了加強飼養(yǎng)管理方面的參考依據(jù)。

（2）豬支原體肺炎的防治建議。保溫：減少晝夜溫差，在溫度驟降的天氣盡快及時的為豬舍增加墊褥。尤其在寒冷的冬季，特別應(yīng)注意豬舍的保暖和防寒工作，創(chuàng)設(shè)一個溫暖、適宜、干凈的豬舍環(huán)境，適當調(diào)整飼養(yǎng)密度。通風：應(yīng)加強豬舍的通風，保持空氣的流通，確保豬舍里新鮮空氣的持續(xù)流通，能夠有效減少呼吸道疾病。消毒：定期為豬舍消毒，堅持每周1～2次的消毒頻率，選擇價格合理、毒力低、消毒范圍廣、副作用小的消毒藥。加強對免疫方面工作的重視，對健康豬以及乳豬接種疫苗，切斷傳播途徑，提高豬自身免疫力。定期進行豬場檢疫檢驗工作，隔離病豬和健康豬，對病豬給予敏感藥物治療，病死豬采取填埋的措施，堅決不流向市場。

4 小結(jié)

本試驗分別檢測了湖南省6個地區(qū)（株洲市、益陽市、長沙市、岳陽市、邵陽市和衡陽市）的Mhp感染情況，發(fā)現(xiàn)Mhp檢出率17.5%～25.0%，與國內(nèi)外Mhp感染率相當。檢出的Mhp 16S rRNA部分序列與國內(nèi)外相關(guān)序列同源性為98%～100%。本試驗結(jié)果為MPS防控工作提供了一定參考依據(jù)。

[1]畢丁仁，王桂枝.動物霉形體及研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：9.

[2]陸承平.獸醫(yī)微生物學[M].第3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：254-257.

[3]邢福珊，王韋華，張彥明，等.豬支原體肺炎的流行病學調(diào)查及病理學診斷[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2009，18（5）：67，70.

[4]李培峰.山西省部分地區(qū)豬肺炎支原體流行病學調(diào)查及免疫對比試驗[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學，2013.

[5]俞潔.某區(qū)肺炎支原體感染的血清流行病學調(diào)查及綜合防控技術(shù)的研究[D].上海：上海交通大學，2010.

[6]王貴平，戴瑋，賈小雅，等.用PCR檢測長沙市豬肺炎支原體和豬鼻支原體的感染情況[J].養(yǎng)豬，2011（3）：81-82.

[7]Vangroenweghe F A,Labarque G G,Piepers S,et al.Mycoplasma hyopneumoniae infections in peri-weaned and post-weaned pigs in Belgium and The Netherlands:Prevalence and associations with climatic conditions[J].Vet J,2015,205(1):93-97.

（編輯：郭玉翠）

病毒性肝炎成全球“頭號殺手”

【法新社巴黎7月7日電】今天發(fā)表的一份報告說，病毒造成的肝炎已成為世界上造成死亡和殘疾的“頭號殺手”，它每年造成的死亡人數(shù)超過了艾滋病、肺結(jié)核或瘧疾。

研究者審查了從183個國家收集的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，因病毒性肝炎引發(fā)的感染、肝臟疾病和癌癥而死亡的人數(shù)，從1990年的89萬增加到了2013年的145萬，增加了63%。

該報告說，相比之下，2013年有130萬人死于艾滋病，140萬人死于肺結(jié)核，85.5萬人死于瘧疾。該報告發(fā)表在英國《柳葉刀》周刊上。

領(lǐng)導這項研究的英國帝國理工學院醫(yī)學專家格雷厄姆·庫克說：“1990年以來，雖然肺結(jié)核與瘧疾等傳染病造成的死亡已經(jīng)減少，病毒性肝炎造成的死亡卻在增加?！?/p>

肝炎是一種肝臟炎癥，往往由病毒造成，但有時也會由吸毒、酗酒、其他傳染病或自身免疫性疾病造成。

肝炎有甲肝、乙肝、丙肝、丁肝和戊肝5種主要類型。

世界衛(wèi)生組織說，甲肝和戊肝通常經(jīng)由受污染的食品或水傳播，而乙肝、丙肝和丁肝通常在接觸了受感染病的體液后出現(xiàn)。

研究人員說，本研究中96%的肝炎死亡病例是由乙肝和丙肝造成的。大部分肝炎死亡病例出現(xiàn)在東亞和南亞。

庫克說：“我們有辦法治療這一疾病，我們有疫苗來對付甲肝和乙肝，我們有新的手段來治療丙肝?！睂τ诒?，目前還沒有疫苗。

他說：“然而，新藥的價格超出了所有國家—無論貧富—的承受能力?！?/p>

該研究報告還呼吁改變籌資結(jié)構(gòu)，以“讓低收入和低中收入國家能作出有效反應(yīng)?！?/p>

【法新社巴黎7月6日電】據(jù)周四在英國醫(yī)學雜志《柳葉刀》周刊上刊登的一份研究報告說，病毒性肝炎屬于越來越致命的疾病，召集每年致死的人數(shù)與艾滋病和結(jié)核病相當。

以世界衛(wèi)生組織的《全球疾病負擔研究報告》為基礎(chǔ)，英國帝國理工學院和美國華盛頓大學的研究人員評估出2013年共有145萬人死于某種病毒性肝炎的并發(fā)癥。

目前共有5種病毒性肝炎可通過血液或其他被感染的體液如精子（乙肝病毒、丙肝病毒）、或通過攝入被污染的水或食物（甲肝病毒和戊肝病毒）被傳染。丁型肝炎因子是一種有缺陷的病毒，只會影響到患有慢性乙肝的病人。

最致命的是乙肝和丙肝，近96%的死亡與它們有關(guān)，主要表現(xiàn)為肝癌和肝硬化。

它們最初往往沒有任何癥狀，悄然發(fā)展，直至突然出現(xiàn)嚴重的肝部問題或癌癥。

大部分死亡出現(xiàn)在高收入和中等收入國家，東亞的發(fā)病率很高，盡管那里有乙肝疫苗且可對丙肝實行有效治療。

至于接種乙肝疫苗，相關(guān)國家做得依然很不夠，英國帝國理工學院的庫克說，因為“有相當多的人”始終沒有接種過疫苗。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2016-07-08）

S858.28

A

1002-1957(2016)04-0113-03

2016-06-07

湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金科研項目（13B050）；2014年湖南農(nóng)業(yè)大學“大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目”（XCX14025）

施琴（1994-），女，湖南常德人，在讀碩士研究生，研究方向為畜禽抗病毒動物模型與新獸藥研制.E-mail：1045139989@qq.com

王貴平，副教授，碩士生導師.E-mail：wanggp003@163.com