表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)人尿液、糞便中馬來(lái)酸依那普利的濃度及其臨床應(yīng)用Δ

甘　盛，賴青鳥，韓　婷，吳超權(quán)（.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧　5300；.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，唐山　053009）

表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)人尿液、糞便中馬來(lái)酸依那普利的濃度及其臨床應(yīng)用Δ

甘盛1＊，賴青鳥1，韓婷2，吳超權(quán)1（1.廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，南寧530021；2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，唐山053009）

目的：建立檢測(cè)人尿液和糞便中馬來(lái)酸依那普利濃度的方法，并將其應(yīng)用于臨床。方法：尿液和糞便樣品經(jīng)前處理后，與表面信號(hào)增強(qiáng)劑膠體銀溶膠按1∶1（V/V）的比例混合，采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)。激發(fā)功率為400 mW，激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，分辨率為4.5 cm－1，用于定性的拉曼位移為（800±2）、（1 050±2）、（1 330±2）、（1 450±2）和（1 630±2）cm－1，用于定量的拉曼位移為（1 050±2）cm－1。結(jié)果：馬來(lái)酸依那普利尿藥、糞藥濃度分別在0.50～100.00 μg/ml和2.00～100.00 μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r分別為0.989 3和0.978 0，n＝6），定量下限分別為0.50 μg/ml和2.00 μg/g，檢測(cè)限分別為0.10 μg/ml和1.30 μg/g；日內(nèi)、日間RSD＜5%，方法回收率分別為95.24%～99.38%、86.73%～94.57%，提取回收率分別為84.29%～90.43%（RSD＝0.84%）、82.36%～87.70%（RSD＝1.84%）。采用該法檢測(cè)15例高血壓患者馬來(lái)酸依那普利的尿藥濃度為15.31～33.46 μg/ml，糞藥濃度為5.08～41.79 μg/g；療效判定為“有效”的患者平均尿藥、糞藥濃度與“未見(jiàn)好轉(zhuǎn)”的患者比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：表面增強(qiáng)拉曼光譜法用于人尿液和糞便中馬來(lái)酸依那普利濃度的檢測(cè)簡(jiǎn)便、快速。

馬來(lái)酸依那普利；尿液；糞便；表面增強(qiáng)劑；表面增強(qiáng)拉曼光譜法

依那普利為強(qiáng)效血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑，其抑制作用是卡托普利的8倍，臨床上一般應(yīng)用其馬來(lái)酸鹽，其適用于各種程度的高血壓、腎血管性高血壓和糖尿病合并高血壓患者的臨床治療（單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合使用）[1]，尤其適用于常規(guī)應(yīng)用洋地黃或利尿藥難于控制者，并可延緩充血性心力衰竭的臨床進(jìn)展[2]。目前，對(duì)該藥體內(nèi)消除情況的監(jiān)測(cè)一般采用高效液相（HPLC）法或液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法，但這類方法操作煩瑣、成本較高，且需采集患者血樣。拉曼光譜法具有操作簡(jiǎn)便、測(cè)定時(shí)間短、無(wú)需采血等優(yōu)點(diǎn)[3-5]，但由于其靈敏度低、檢測(cè)限難以達(dá)到體內(nèi)微量分析的要求，故在實(shí)際應(yīng)用中需加入拉曼信號(hào)表面增強(qiáng)劑（一般為粒徑較大的等金屬離子溶膠）吸附待測(cè)物分子，以增強(qiáng)其拉曼散射信號(hào)[4-5]。相對(duì)于傳統(tǒng)的血藥濃度監(jiān)測(cè)方法，表面增強(qiáng)拉曼光譜法僅以患者的排泄物作為檢測(cè)對(duì)象，大大簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，減輕了患者的痛苦。因此，本試驗(yàn)以人尿液和糞便樣品作為研究對(duì)象，采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)其中馬來(lái)酸依那普利的質(zhì)量濃度，探索體內(nèi)藥物濃度測(cè)定的新方法，為臨床治療藥物監(jiān)測(cè)和合理用藥提供參考。

1　材料

1.1儀器

OPAL-3000型便攜式拉曼光譜儀，包括HRP-8型高光通量光線探頭、熱電制冷低溫電荷耦合陣列檢測(cè)器（CCD，可在－60℃下穩(wěn)定工作，檢測(cè)靈敏度為15～50 ppm）（英國(guó)Metage公司）；HLA-1024型超聲波清洗機(jī)（深圳華龍超聲機(jī)電設(shè)備有限公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（美國(guó)Scientific Industries公司）；R201BV型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申勝生物技術(shù)有限公司）；X85-2型可控溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；TDL-5-A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2藥品與試劑

馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100705-201203，純度：98.87%）；馬來(lái)酸依那普利片（上海現(xiàn)代制藥股份有限公司，批號(hào)：20140953，規(guī)格：5 mg）；玻璃纖維濾膜、聚四氟乙烯濾膜（湖北津華量化環(huán)境檢測(cè)科技有限公司）；WAX固相萃取柱（美國(guó)Phenomenex公司）；甲醇為色譜純，水為去離子水，其余試劑為分析純?？瞻啄蛞汉图S便由華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

2　方法與結(jié)果

取馬來(lái)酸依那普利對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置10 ml量瓶中，加水5 ml，渦旋振蕩5 min，超聲（功率為1 200 W）10 min，加水至刻度，搖勻，配制成相當(dāng)于馬來(lái)酸依那普利質(zhì)量濃度為1 mg/ml的對(duì)照品貯備液，密封、避光保存。取上述對(duì)照品貯備液適量，用水稀釋得相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

2.2尿液和糞便樣品的處理

2.2.1尿液樣品取新鮮尿液200 ml，以離心半徑6.75 cm、轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取上清液5 ml，加入硼酸鹽緩沖液（pH＝10.3）0.5 ml，混勻，加入乙酸乙酯15 ml，渦旋混合1 min，以離心半徑6.75 cm、轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min，收集上清液于圓底燒瓶中，用乙酸乙酯提取2次，合并提取液，于42℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)?0%甲醇1 ml復(fù)溶，即得尿液樣品的待測(cè)溶液，備用。

2.2.2糞便樣品將新鮮糞便冷凍干燥24 h后，研磨均勻，去除較大的粗纖維。精密稱取1.0 g置于50 ml具塞玻璃離心管中，加入甲醇20 ml，超聲（功率為1 200 W）提取10 min，重復(fù)提取3次，合并提取液，于4℃下以離心半徑13.5 cm、轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心20 min，取上清液于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將其濃縮至1 ml，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，濾液用水稀釋至50 ml。將上述溶液上樣至已活化的WAX固相萃取柱中，用丙酮-0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液（40∶60，V/V）6 ml以5 ml/min的速度洗脫，待無(wú)液體流出后抽真空5 min；再用乙酸乙酯8 ml以1 ml/min的速度洗脫，合并2次洗脫液，常溫下以氮?dú)饬鞔祾?，將其濃縮至1 ml。將此濃縮液轉(zhuǎn)移至硅膠柱中，用丙酮-甲醇（1∶1，V/V）以1 ml/min的速度洗脫，洗脫液于常溫下以氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?0%甲醇1 ml復(fù)溶，即得糞便樣品的待測(cè)溶液，備用。

2.3表面增強(qiáng)劑和上機(jī)液的制備

應(yīng)用檸檬酸鈉還原法[7]合成膠體銀溶膠。取水99 ml置于三口圓底燒瓶中，加入1%硝酸銀水溶液1 ml，加熱至微沸（92～93℃），快速加入1%檸檬酸三鈉水溶液4 ml，冷凝回流，采用可控溫磁力攪拌器使之保持沸騰。于95℃時(shí)停止加熱，冷卻并保持均勻攪拌，靜置25 min，得粒徑為30～40 nm的膠體銀溶膠。取上述膠體銀溶膠和“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下的待測(cè)溶液各0.5 ml，分別渦旋混勻，即得尿液和糞便樣品的上機(jī)液。

2.4檢測(cè)條件

2.4.1定性檢測(cè)采用拉曼光譜儀對(duì)上述上機(jī)液進(jìn)行掃描。激發(fā)功率：400 mW；激發(fā)波長(zhǎng)：785 nm；分辨率：4.5 cm－l；馬來(lái)酸依那普利特征峰的定性拉曼位移：（800±2）、（1 050±2）、（1 330±2）、（1 450±2）和（1 630±2）cm－l。

模塊是模塊化設(shè)計(jì)的基本元素,是一種實(shí)體的概念,如把模塊定義為一組同時(shí)具有相同功能和相同結(jié)合要素,具有不同性能或用途甚至不同結(jié)構(gòu)特征,但能互換的單元[2-5].模塊化一般是指使用模塊的概念對(duì)設(shè)備或系統(tǒng)進(jìn)行規(guī)劃設(shè)計(jì)、生產(chǎn)組織.設(shè)備的模塊化設(shè)計(jì)是在對(duì)一定范圍內(nèi)的不同功能或相同功能不同性能、不同規(guī)格的設(shè)備進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上,劃分并設(shè)計(jì)出一系列模塊,通過(guò)模塊的選擇和組合可以構(gòu)成不同的設(shè)備,以滿足發(fā)射場(chǎng)不同需求的設(shè)計(jì)方法.

2.4.2定量檢測(cè)[8]以（1 050±2）cm－l對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行譜圖歸一化。以（1 050±2）cm－l對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度與已知貯備液對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度相比，計(jì)算馬來(lái)酸依那普利的質(zhì)量濃度。c/c貯＝Iv/I貯（式中，c為待測(cè)物質(zhì)量濃度，c貯為貯備液質(zhì)量濃度，Iv為待測(cè)物特征峰強(qiáng)度，I貯為貯備液特征峰強(qiáng)度）。

2.5方法學(xué)考察

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取空白尿液和對(duì)照品貯備液各適量，分別配制成馬來(lái)酸依那普利質(zhì)量濃度為0.50、1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/ml的尿液樣品，按“2.2.1”“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄拉曼光譜圖，見(jiàn)圖1B、1C。以拉曼光譜強(qiáng)度（I尿）為縱坐標(biāo)、待測(cè)物質(zhì)量濃度（c尿）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為I尿＝6 265.24c尿－217.70（r尿＝0.989 3，n＝6）。結(jié)果表明，馬來(lái)酸依那普利的尿藥濃度在0.50～100.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為0.50 μg/ml，檢測(cè)限為0.10 μg/ml。

取空白糞便和對(duì)照品貯備液各適量，分別配制成馬來(lái)酸依那普利質(zhì)量濃度為2.00、5.00、10.00、25.00、50.00、100.00 μg/g的糞便樣品，按“2.2.2”“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣分析，記錄拉曼光譜圖，見(jiàn)圖1D、1E。以拉曼光譜強(qiáng)度（I糞）為縱坐標(biāo)、待測(cè)物質(zhì)量濃度（c糞）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為I糞＝4 872.31c糞+659.01（r糞＝0.978 0，n＝6）。結(jié)果表明，馬來(lái)酸依那普利的糞藥濃度在2.00～100.00 μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下限為2.00 μg/g，檢測(cè)限為1.30 μg/g。

2.5.2精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)取空白尿液、空白糞便和對(duì)照品貯備液各適量，分別配制成馬來(lái)酸依那普利低、中、高質(zhì)量濃度（1.00、10.00和50.00 μg/ml）的尿液樣品和低、中、高質(zhì)量濃度（5.00、10.00和50.00 μg/g）的糞便樣品，分別按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定。每質(zhì)量濃度取9樣本分析，連續(xù)測(cè)定7 d，根據(jù)當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品的測(cè)得質(zhì)量濃度，考察方法的精密度與準(zhǔn)確度。結(jié)果顯示，各尿液樣品的日內(nèi)、日間RSD＜3%，方法回收率為95.24%～99.38%；各糞便樣品的日內(nèi)、日間RSD＜5%，方法回收率為86.73%～94.57%。精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab 1　Results of precision and accuracy tests（±s）

表1　精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（±s）Tab 1　Results of precision and accuracy tests（±s）

樣品　加入質(zhì)量濃度，μg/ml或μg/g尿液樣品糞便樣品1．00 10．00 50．00 5．00 10．00 50．00日內(nèi)（n＝9）測(cè)得質(zhì)量濃度，μg/ml或μg/g 0．99±0．02 9．71±0．33 49．89±0．12 4．43±0．26 8．95±0．41 48．76±0．38 RSD，% 1．56 2．17 1．63 2．31 3．68 4．72方法回收率，% 98．79±1．86 97．08±3．32 99．78±0．26 88．12±4．71 89．46±4．09 97．52±7．93日間（n＝7）測(cè)得質(zhì)量濃度，μg/ml或μg/g 0．97±0．08 9．80±0．27 49．92±0．09 4．54±0．31 8．89±0．53 47．54±0．65 RSD，% 1．92 1．95 1．47 3．05 4．20 4．69方法回收率，% 97．02±3．90 98．05±2．67 99．84±0．05 91．27±3．19 88．94±5．32 95．08±1．30

圖1　馬來(lái)酸依那普利的拉曼光譜圖A.標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.00 μg/ml）；B.空白尿液；C.空白尿液+馬來(lái)酸依那普利；D.空白糞便；E.空白糞便+馬來(lái)酸依那普利Fig 1　Raman spectrum of enalapril maleateA.standard solution（10.00 μg/ml）；B.blank urine；C.blank urine+enalapril maleate；D.blank faeces；E.blank faeces+enalapril maleate

2.5.3提取回收率試驗(yàn)取空白尿液、空白糞便和對(duì)照品貯備液各適量，分別配制成馬來(lái)酸依那普利低、中、高質(zhì)量濃度（1.00、10.00和50.00 μg/ml）的尿液樣品和低、中、高質(zhì)量濃度（5.00、10.00和50.00 μg/g）的糞便樣品，分別按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法處理后，進(jìn)樣測(cè)定；另取空白尿液和空白糞便各適量，分別按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入對(duì)照品貯備液適量，使最終質(zhì)量濃度與前者對(duì)應(yīng)，進(jìn)樣測(cè)定。每質(zhì)量濃度取6樣本分析，考察方法的提取回收率。結(jié)果顯示，尿液樣品的提取回收率為84.29%～90.43%（RSD＝0.84%），糞便樣品的提取回收率為82.36%～87.70%（RSD＝1.84%）。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取空白尿液、空白糞便和對(duì)照品貯備液各適量，分別配制成馬來(lái)酸依那普利低、高質(zhì)量濃度（1.00和50.00 μg/ml）的尿液樣品和低、高質(zhì)量濃度（5.00和50.00 μg/g）的糞便樣品，分別于0、2、4、6、9、12、15和24 h進(jìn)樣測(cè)定，考察方法的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD＜5%。

2.6臨床應(yīng)用

2.6.1樣品來(lái)源選擇華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院初入院的高血壓患者15例，年齡43.1～67.8歲，體質(zhì)量46.9～71.5 kg，血尿常規(guī)、心電圖、肝功能正常，胃腸功能良好。入院前3天及住院期間未服用過(guò)任何血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑，并禁煙、酒、茶[9]。本研究方案經(jīng)華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

2.6.2樣品測(cè)定和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有患者每日口服馬來(lái)酸依那普利片20 mg，每日2次，分別于用藥的第1～7天收集其尿液和糞便，分別按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下方法處理后，將所得待測(cè)溶液與表面增強(qiáng)劑膠體銀溶膠按1∶1（V/V）的比例均勻混合采用表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測(cè)其尿液和糞便中馬來(lái)酸依那普利的質(zhì)量濃度。采用SPSS 13.0軟件處理所有數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以x ±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6.3樣品測(cè)定結(jié)果檢測(cè)結(jié)果顯示，患者尿藥濃度為15.31～33.46 μg/ml，糞藥濃度為5.08～41.79 μg/g。大部分患者服藥3 d后，尿藥和糞藥濃度不再大幅上升或下降，此時(shí)尿藥和糞藥濃度已趨于穩(wěn)定。15例高血壓患者馬來(lái)酸依那普利尿藥、糞藥濃度的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　15例高血壓患者馬來(lái)酸依那普利尿藥、糞藥濃度的檢測(cè)結(jié)果（±s ，n＝15）Tab 2　Urinal and fecal concentrations of enalapril maleatein 15hypertensive patients（±s， n＝15）

表2　15例高血壓患者馬來(lái)酸依那普利尿藥、糞藥濃度的檢測(cè)結(jié)果（±s ，n＝15）Tab 2　Urinal and fecal concentrations of enalapril maleatein 15hypertensive patients（±s， n＝15）

測(cè)定時(shí)間，d 1234567尿藥濃度，μg/ml 17．67±2．12 19．29±9．63 28．54±9．11 27．97±4．57 29．76±3．29 28．75±5．10 29．15±3．34糞藥濃度，μg/g 6．52±0．77 22．24±1．68 37．42±4．81 36．50±2．34 38．85±5．53 37．81±3．60 36．43±5．47

以收縮壓≤140 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）、舒張壓≤90 mm Hg為標(biāo)準(zhǔn)（非同日連續(xù)3次測(cè)量）[10]，對(duì)患者的治療效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。15例患者入院3 d后，11例患者的血壓符合上述標(biāo)準(zhǔn)，判定為“有效”；4例患者的血壓仍較高，判定為“未見(jiàn)好轉(zhuǎn)”。療效判定為“有效”的患者平均尿藥濃度為（28.14± 4.76）μg/ml，“未見(jiàn)好轉(zhuǎn)”的患者平均尿藥濃度為（26.77±5.91）μg/ml，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；療效判定為“有效”的患者平均糞藥濃度為（37.65±4.20）μg/g，“未見(jiàn)好轉(zhuǎn)”的患者平均糞藥濃度為（35.09±5.65）μg/g，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

3.1定量拉曼位移的篩選

在拉曼光譜圖上，血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)換酶抑制劑的分子特征峰位于1 448～1 452 cm－1[苯環(huán)（C＝C）伸縮振動(dòng)]和1 627～1 633 cm－1[乙氧基（CH3-CH2-O-）彎曲振動(dòng)]處。但由于各藥物分子吡咯烷上的取代基不同，其特征峰的拉曼位移有所差異。馬來(lái)酸依那普利的特征峰位于（800±2）cm－1和（1 330± 2）cm－1處，分別為吡咯烷上C-N伸縮振動(dòng)和N-H伸縮振動(dòng)。雖然尿素分子中的鍵譜峰覆蓋了依那普利在相同拉曼位移處由C-OH非對(duì)稱伸縮引起的振動(dòng)峰，但對(duì)馬來(lái)酸依那普利在（1 050±2）cm－1處特征峰的辨認(rèn)不會(huì)造成大的干擾。隨著待測(cè)物質(zhì)量濃度的升高，此處峰強(qiáng)不斷增加。因此，將定量拉曼位移確定為（1 050±2）cm－1，并以此處對(duì)應(yīng)峰強(qiáng)度進(jìn)行譜圖歸一化，計(jì)算尿液和糞便樣品中馬來(lái)酸依那普利的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，馬來(lái)酸依那普利的尿藥和糞藥濃度分別在0.50～100.00 μg/ml和2.00～100.00 μg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r分別為0.989 3和0.978 0）。

3.2增強(qiáng)劑的選擇[7]

表面增強(qiáng)劑的種類、質(zhì)量濃度和混合比例均可影響拉曼光譜的信號(hào)增強(qiáng)效果及其檢測(cè)限。筆者曾嘗試使用金溶膠作為拉曼光譜信號(hào)增強(qiáng)劑，但并無(wú)明顯的信號(hào)增強(qiáng)效果，在尿液與糞便樣品中無(wú)法檢測(cè)到待測(cè)物。而銀溶膠則可明顯增強(qiáng)待測(cè)物的信號(hào)。金屬離子的空間密度與吸附分子的能力直接相關(guān)，過(guò)密則對(duì)吸附目標(biāo)形成阻擋，過(guò)于分散則大量待測(cè)分子無(wú)法得到吸附。在可見(jiàn)光區(qū)域內(nèi)，金的表面增強(qiáng)因子比銀小，銀溶膠與目標(biāo)分子結(jié)合后可產(chǎn)生更為強(qiáng)烈的共振現(xiàn)象，即銀溶膠與金溶膠相比，具有更強(qiáng)的表面增強(qiáng)活性。通過(guò)多次預(yù)試驗(yàn)，最終確定銀溶膠與待測(cè)物溶液按1∶1等體積混合的效果最佳。

3.3銀溶膠的穩(wěn)定性

在試驗(yàn)過(guò)程發(fā)現(xiàn)，銀溶膠在－4℃下保存3周后會(huì)出現(xiàn)沉淀。銀溶膠的穩(wěn)定性可能受以下因素影響：（1）在制備金屬溶膠的過(guò)程中，使用了檸檬酸三鈉，檸檬酸根離子不僅可作為還原劑，同時(shí)還具備穩(wěn)定劑的效果，可提高金屬溶膠的穩(wěn)定性。檸檬酸三鈉有3個(gè)羧基基團(tuán)，其中2個(gè)吸附在銀粒子的表面，余下的1個(gè)則通過(guò)其所帶負(fù)電荷相互排斥的作用力起著穩(wěn)定的作用。（2）溫度對(duì)銀溶膠的穩(wěn)定性也有重要的影響。在室溫下，納米顆粒間的相互碰撞幾率高于低溫環(huán)境，易發(fā)生聚集、沉淀現(xiàn)象，不利于膠體的分散。（3）時(shí)間也是影響銀溶膠穩(wěn)定性的重要因素之一。長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)使溶膠的穩(wěn)定性下降，產(chǎn)生自凝聚現(xiàn)象。銀溶膠在室溫條件下，5～10 d內(nèi)即會(huì)沉降失活。因此，銀溶膠不宜長(zhǎng)時(shí)間保存，建議低溫保存，且配制后應(yīng)盡快使用。

3.4尿液、糞便樣品的檢測(cè)限

馬來(lái)酸依那普利在尿液樣品中的檢測(cè)限為0.50 μg/ml，糞便樣品中的檢測(cè)限為1.30 μg/g。尿液樣品的檢測(cè)限主要受其中尿素C-N π鍵對(duì)吡咯烷特征峰的影響；而糞便樣品的檢測(cè)限和線性關(guān)系則與其中雜質(zhì)較多、影響待測(cè)物的辨認(rèn)有關(guān)。

3.5與色譜法的比較[11]

與本方法相比，傳統(tǒng)的色譜法耗時(shí)較長(zhǎng)，單個(gè)樣品從前處理到最后得出結(jié)果，色譜法至少需要1 h，而光譜法只需20 min左右。如果是對(duì)大批量樣品進(jìn)行檢測(cè)，拉曼光譜法單個(gè)樣品的掃描時(shí)間僅需幾十秒，相對(duì)于色譜法而言，大大地節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，因此能達(dá)到快速分析、檢測(cè)的目的。在方法檢測(cè)限方面，雖然較色譜法尚有一定的差距，但由于排泄物中的藥物含量往往大大高于檢測(cè)限，故仍可滿足臨床監(jiān)測(cè)的需求。在方法準(zhǔn)確度上，色譜法屬于半確證性方法，通常需要與質(zhì)譜串聯(lián)以進(jìn)一步確證結(jié)構(gòu)。而拉曼光譜屬于振動(dòng)光譜，提供的是待測(cè)物分子的“指紋”信息，具有較高的準(zhǔn)確性，但須在儀器的激發(fā)光強(qiáng)度、信噪比處理、檢測(cè)器靈敏度上進(jìn)行提高，同時(shí)對(duì)前處理進(jìn)行優(yōu)化，使檢測(cè)方法更加完善[12]。

綜上所述，與已有HPLC、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法等比較[11，13-14]，本研究所建立的表面增強(qiáng)拉曼光譜法，以患者的尿液和糞便樣品為監(jiān)測(cè)對(duì)象，大大簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程，縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低了檢測(cè)成本，并提高了患者的診療舒適度，為體內(nèi)藥物濃度的監(jiān)測(cè)提供了新的方法。

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（編輯：張?jiān)拢?/p>

Concentration Determination of Enalapril Maleate in Human Urine and Feces by Surface-enhanced Raman Scattering Spectrometry and Its ClinicalApplication

GAN Sheng1，LAI Qingniao1，HAN Ting2，WU Chaoquan1（1.Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute for Food and Drug Control，Nanning 530021，China；2.Pharmacology Teaching and Research Section，Preclinical College，North China University of Science and Technology，Hebei Tangshan 053009，China）

OBJECTIVE：To establish the method for concentration determination of enalapril maleate in human urine and feces，and apply it in the clinic.METHODS：The urine and feces samples were collected and pre-processed，then tested by surfaceenhanced Raman scattering spectrometry with ratio of sample to surface signal enhancer silver sol 1∶1（V/V）.The assay was carried out with the following parameters：excitation power 400 mW，excitation wavelength 785 nm，resolution 4.5 cm－1.The characteristic shift of enalapril maleate were（800±2），（1 050±2），（1 330±2），（1 450±2），（1 630±2）cm－1.The quantitation shift was（1 050±2）cm－1.RESULTS：The linear range of enalapril maleate were 0.50-100.00 μg/ml in urine and 2.00-100.00 μg/g in feces（r＝0.989 3，0.978 0，n＝6）；the limits of quantitation were 0.50 μg/ml and 2.00 μg/g，and the limits of detection were 0.10 μg/ ml and 1.30 μg/g.RSDs of intra-day and inter-day were both lower than 5%.The method recoveries were 95.24%-99.38%and 86.73%-94.57%；the extraction recoveries were 84.29%-90.43%（RSD＝0.84%）and 82.36%-87.70%（RSD＝1.84%），respectively.The urinal concentration of enalapril maleate in 15 hypertensive patients ranged 15.31-33.46 μg/ml，while the fecal concentration ranged 5.08-41.79 μg/g.There was no statistical significance in average urinal concentration and fecal concentration between“effective”patients and“no response”patients.CONCLUSIONS：Surface enhanced Raman scttering spectrometry can be used for the concentration determination of enalapril maleate in human urine and feces.It is simple and rapid.

Enalapril maleate；Urine；Feces；Surface signal enhancer；Surface-enhanced Raman scattering spectrometry

R917

A

1001-0408（2016）32-4504-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.32.13

廣西自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目（No.2014GXNSF BA118059）；中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金項(xiàng)目（No.2013WC3）

＊副主任藥師，博士，碩士生導(dǎo)師。研究方向：食品藥品檢驗(yàn)及質(zhì)量安全。電話：0771-5827256。E-mail：gansheng@hotmail.com

（2015-12-04

2016-06-16）