瀘州地區(qū)苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態(tài)性分析Δ

胡功利，王國(guó)俊，楊　婷，陳　竹，葉　云（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州　646000）

瀘州地區(qū)苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態(tài)性分析Δ

胡功利＊，王國(guó)俊#，楊婷，陳竹，葉云（西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

目的：研究瀘州地區(qū)苗族人群細(xì)胞色素P450（CYP）2C19、三磷酸腺苷結(jié)合盒亞家族B成員1（ABCB1）、CYP3A4和CYP3A5的基因型和基因型頻率。方法：采用拋擲硬幣法選擇四川省瀘州地區(qū)無(wú)直接血緣關(guān)系的健康苗族受試者54例，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法對(duì)其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、測(cè)序后，采用Chromas 2軟件對(duì)其基因型進(jìn)行比對(duì)分析，并對(duì)不同性別受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率進(jìn)行比較。結(jié)果：54例苗族受試者CYP2C19快代謝型（HomEM，*1*1基因型）、中代謝型（HetEM，*1*2或*1*3基因型）和慢代謝型（PM，*2*2、*2*3或*3*3基因型）頻率分別為20.37%、61.11%和18.52%；ABCB1 CC、CT和TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%和18.52%；CYP3A4 GG、GA和AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%和7.41%；CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%和1.85%；不同性別苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：苗族受試者中CYP2C19 HetEM型和CYP3A4 G等位基因攜帶者的比例較高，ABCB1多態(tài)性位點(diǎn)的實(shí)變率較高，CYP3A5多態(tài)性位點(diǎn)的突變率較低；性別對(duì)瀘州地區(qū)苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態(tài)性的分布并無(wú)明顯影響。

基因多態(tài)性；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法；苗族人群；瀘州地區(qū)；CYP2C19；ABCB1；CYP3A4；CYP3A5

藥物代謝與療效密切相關(guān)，影響藥物代謝的因素較多，主要包括基因多態(tài)性（Gene polymorphism）、藥物相互作用和飲食習(xí)慣等，其中基因多態(tài)性是其中非常重要的影響因素[1]。細(xì)胞色素P450（CYP）酶系是肝臟中的主要代謝酶之一，包括CYP2C19、CYP3A等藥物代謝酶。遺傳學(xué)的改變使CYP酶表現(xiàn)出多態(tài)性，且具有明顯的個(gè)體、種族或地域差異[2]。CYP2C19存在多種突變等位基因，*2、*3是其主要突變體，這2種突變等位基因均可導(dǎo)致CYP2C19酶活性的降低或完全喪失[3]。三磷酸腺苷結(jié)合盒亞家族B成員1（ATP-binding cassette subfamily B member 1；ABCB1）rs1045642（C3435T）多態(tài)性位點(diǎn)T等位基因可直接影響P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，進(jìn)而影響藥物的藥動(dòng)學(xué)特征[4]。CYP3A主要由CYP3A4和CYP3A5同工酶組成，CYP3A4（rs2242480）易感單核多肽位點(diǎn)ⅣS10+12G＞A可影響纖維蛋白原受體GPⅡb/Ⅲa的活性，攜帶ⅣS10+ 12G＞A者該受體活性下降，對(duì)血小板聚集的抑制作用增強(qiáng)[5]；CYP3A5（rs3800959）多態(tài)性位點(diǎn)是調(diào)控CYP3A5表達(dá)水平的主要方式，同時(shí)也可影響其代謝酶的活性，最終導(dǎo)致其代謝底物的能力和速率發(fā)生不同程度的改變，是造成個(gè)體、種族差異的重要原因[6]。

我國(guó)是一個(gè)多民族國(guó)家，苗族人口逐年上升[7-8]。目前，關(guān)于漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性的研究報(bào)道較多，也有關(guān)于其ABCB1、CYP3A5基因多態(tài)性的相關(guān)報(bào)道[9-11]，但尚未見(jiàn)以苗族人群為研究對(duì)象的基因多態(tài)性研究。由于瀘州地區(qū)苗族人口眾多，分析該地區(qū)苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態(tài)性的分布情況具有較大的臨床意義。本試驗(yàn)以瀘州地區(qū)苗族人群為研究對(duì)象，探討其CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5的基因多態(tài)性，為基因?qū)蛩幬锏慕o藥方案提供參考。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

采用拋擲硬幣法，選擇四川省瀘州地區(qū)無(wú)直接血緣關(guān)系的健康苗族人群，硬幣正面朝上者則納入研究，如有受試者拒絕參與應(yīng)盡量說(shuō)服。最終納入苗族受試者54例，其中男性32例，女性22例，平均年齡（49.8±16.5）歲。本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，各受試者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2材料

PTC2150型聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國(guó)MJ Research Inc公司）；JM2250型電泳儀（北京宏康公司）。

基因組DNA提取試劑盒（批號(hào)：DP130227）、DNA Marker（批號(hào)：B1101A）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限生物公司；2× Taq PCR MasterMix（批號(hào)：715676BD）、ddH2O（批號(hào)：706767XD）均購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；2%瓊脂糖凝膠購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號(hào)：142060。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成

參照文獻(xiàn)[9-11]中CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因的特異性引物序列（見(jiàn)表1），由大連寶生物公司合成。

1.4基因組DNA提取

表1　CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因引物序列Tab 1Primer Sequences of CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4and CYP3A5

于空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取各受試者肘部靜脈血3 ml，按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取受試者的DNA，將產(chǎn)物放置于－20℃冰箱中冷凍保存，備用。

1.5基因型檢測(cè)

采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）法分別擴(kuò)增血液樣本中CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因。反應(yīng)體系共50 μl，包括DNA產(chǎn)物6 μl，上、下游引物各1.5 μl，2×Taq PCR MasterMix 25 μl，ddH2O 16 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，72℃再延伸5 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，陽(yáng)性產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，并利用Chromas 2軟件（http：//www.seekbio.com/DownloadShow.asp?id=284）對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定其基因型。

1.6代謝表型的定義[12]

根據(jù)不同CYP2C19基因型將其代謝類型分為3類：*1*1基因型為681GG和636GG，屬于快代謝型（HomEM）；*1*2基因型為681GA和636GG，*1*3基因型為681GG和636GA，屬于中代謝型（HetEM）；*2*2基因型為681AA和636GG，*2*3基因型為681GA和636GA，*3*3基因型為681GG和636AA，屬于慢代謝型（PM）。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析。采用χ2檢驗(yàn)判斷多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻是否符合Hardy-Weinberg平衡（HWE），P＞0.05為符合HWE；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s檢驗(yàn)比較不同性別受試者各基因型頻率的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

以各受試者基因組DNA為模板，對(duì)其CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，均顯示出清晰條帶（見(jiàn)圖1），提示擴(kuò)增和測(cè)序的成功率均為100%。

圖1　CYP2C19*2、CYP2C19*3、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果M.DNA Marker；1.CYP2C19*2擴(kuò)增產(chǎn)物（321 bp）；2.CYP2C19*3擴(kuò)增產(chǎn)物（271 bp）；3.ABCB1擴(kuò)增產(chǎn)物（452 bp）；4.CYP3A4擴(kuò)增產(chǎn)物（420 bp）；5.CYP3A5擴(kuò)增產(chǎn)物（493 bp）Fig 1　Electrophoresis for PCR products of CYP2C19*2，CYP2C19*3，ABCB1，CYP3A4and CYP3A5M.DNA marker；1.the product of CYP2C19*2（321 bp）；2.the product of CYP2C19*3（271 bp）；3.the product of ABCB1（452 bp）；4.the product of CYP3A4（420 bp）；5.the product of CYP3A5（493 bp）

2.2HWE檢驗(yàn)

χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型頻率的觀察值和理論值吻合度良好，其分布均符合HWE（P＞0.05），表明所選受試者具有良好的群體代表性。54例苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYA3A4和CYP3A5基因型分布見(jiàn)表2。

表254　例苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CPY3A5基因型分布[例（%%）]Tab 2　Distribution of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 genotype in 54 Miao population volunteers [case（%%）]

由表2可見(jiàn)，54例苗族受試者中CYP2C19、HetEM型和CYP3AG等經(jīng)基因攜帶者的比例較高，ABCB1為態(tài)性位點(diǎn)的突變率較高，CYP3A4多態(tài)性位點(diǎn)的突變率較低。

2.3不同性別苗族受試者CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型比較

54位苗族受試者CYP2C19 HomEM、HetEM、PM型頻率分別為20.37%、61.11%、18.52%；ABCB1 CC、CT、TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%、18.52%；CYP3A4 GG、GA、AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%、7.41%；CYP3A5 TT、TC、CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%、1.85%，各基因型的男性和女性各基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同性別苗族受試者基因型頻率比較見(jiàn)表3。

表3　不同性別苗族受試者基因型頻率比較[例（%%）]Tab 3　Comparison of genetic frequency among Miao population volunteers with different gender[case（%%）]

3　討論

我國(guó)是一個(gè)多民族國(guó)家，6次人口普查結(jié)果顯示，我國(guó)苗族人口分別為215萬(wàn)（1953年）、278萬(wàn)（1964年）、503萬(wàn)（1982年）、739萬(wàn)（1990年）、894萬(wàn)人（2000年）和942萬(wàn)（2010年），呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)；至2010年，苗族人口總數(shù)已躍居中國(guó)少數(shù)民族人口總數(shù)的第6位[7-8]。瀘州是一個(gè)多民族散雜居地區(qū)，全市共有46個(gè)少數(shù)民族，少數(shù)民族人口7.22萬(wàn)人，其中苗族人口最多，為5.57萬(wàn)人，占瀘州地區(qū)少數(shù)民族的絕大部分。各民族在遺傳背景大致相似的情況下又各有民族特色，特殊的地理環(huán)境和生活習(xí)慣可能會(huì)導(dǎo)致苗族人群某些基因代謝類型發(fā)生改變[13]。因此，研究其基因多態(tài)性分布情況，可為初步了解苗族人群藥動(dòng)學(xué)特征、開(kāi)展個(gè)體化給藥提供參考。

CYP2C19含490個(gè)氨基酸殘基，CYP2C19*2（rs4244285，681G＞A）變異，會(huì)導(dǎo)致翻譯過(guò)程中產(chǎn)生1個(gè)異常的剪接位點(diǎn)，從而生成1個(gè)簡(jiǎn)短的無(wú)功能蛋白質(zhì)；CYP2C19*3（rs4986893，636G＞A）變異，會(huì)導(dǎo)致在此位置產(chǎn)生1個(gè)異常的終止密碼子，最終合成無(wú)功能蛋白質(zhì)[9]。這2種無(wú)功能的蛋白質(zhì)均可使經(jīng)該酶代謝的藥物在體內(nèi)代謝受阻。因此，CYP2C19基因多態(tài)性的改變，使其呈現(xiàn)為HomEM、HetEM和PM等3種代謝型，最終影響藥物在體內(nèi)的代謝速率。本研究結(jié)果顯示，CYP2C19 HomEM、HetEM和PM型頻率分別為20.37%、61.11%和18.52%，表明在苗族受試者中，大部分為CYP2C19 HetEM型，存在少數(shù)HomEM型和PM型，這與我國(guó)漢族人群CYP2C19基因多態(tài)性分布的差異較大（漢族人群CYP2C19 HomEM、Het-EM和PM型頻率分別為46.67%、36.67%和16.67%）[9]。提示當(dāng)苗族患者使用經(jīng)CYP2C19酶代謝的藥物時(shí)，臨床應(yīng)重視個(gè)體化用藥。

ABCB1基因位于人類7號(hào)染色體q21.1，包含28個(gè)外顯子，片段大小在49～209個(gè)堿基對(duì)之間，轉(zhuǎn)錄得到的mRNA大小為4.5 kb[14]。ABCB1基因C3435T基因多態(tài)性位點(diǎn)可通過(guò)改變密碼子的選擇和使用進(jìn)而影響蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)，該位點(diǎn)可通過(guò)密碼子的替換調(diào)節(jié)翻譯速度或節(jié)奏，最終導(dǎo)致P-gp局部的細(xì)微結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而影響其對(duì)各種調(diào)節(jié)分子或底物的親和力[10]。如：在使用氯沙坦治療高血壓時(shí)，攜帶ABCB1（C3435T）T等位基因的患者對(duì)氯沙坦有更好的應(yīng)答效果[15]。本研究結(jié)果顯示，ABCB1基因CC、CT和TT基因型頻率分別為29.63%、51.85%和18.52%，表明在苗族受試者中，ABCB1 C3435T多態(tài)位點(diǎn)存在較高的突變率，其代謝頻率分布與漢族人群分布大致相同（漢族人群ABCB1 CC、CT和TT基因型頻率分別為33.4%、44.8%和21.8%）[10]。

CYP3A是CYP的主要亞家族，其重要成員有CYP3A4和CYP3A5。改變CYP3A表達(dá)水平的主要調(diào)控方式是基因多態(tài)性，通過(guò)影響其代謝酶活性，最終改變對(duì)底物的代謝能力和速率，是導(dǎo)致臨床用藥出現(xiàn)個(gè)體差異的重要因素[16]。CYP3A4基因位于染色體7q21.3～22.1，全長(zhǎng)27 kb，包含了13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，且其活性受基因表達(dá)水平的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，CYP3A4（ⅣSl0+12G＞A）A等位基因可增加相關(guān)酶的活性，并增強(qiáng)相關(guān)藥物代謝的敏感性[11]。本研究結(jié)果顯示，CYP3A4 GG、GA和AA基因型頻率分別為38.89%、53.70%和7.41%，表明在苗族受試者中，CYP3A4基因大多屬于GA基因型，與漢族人群CYP3A4的基因型分布存在較大差異（漢族人群CYP3A4 GG、GA和AA型的頻率分別為58.00%、37.88%和4.12%）[17]。提示當(dāng)苗族患者使用以CYP3A4基因?yàn)閷?dǎo)向的藥物時(shí)，臨床應(yīng)特別注意藥物代謝的差異，及時(shí)調(diào)整用藥劑量。CYP3A5基因位于人類第7號(hào)染色體，全長(zhǎng)31.8 kb，共編碼502個(gè)氨基酸。該基因在10%～97%的人群中表達(dá)，其活性占體內(nèi)CYP3A總活性2%～60%，表達(dá)呈多態(tài)性，被認(rèn)為是個(gè)體間CYP3A活性差異的最主要因素[10]。本研究結(jié)果顯示，CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為81.48%、16.67%和1.85%，表明絕大部分苗族受試者攜帶CYP3A5 T等位基因，與漢族人群CYP3A5基因型分布相似（漢族人群CYP3A5 TT、TC和CC基因型頻率分別為73.38%、24.75%和1.87%）[11]。

少數(shù)基因多態(tài)性分布與性別具有相關(guān)性，如：多巴胺D3受體（DRD3）基因Ser9Gly多態(tài)性與精神分裂癥患者工作記憶障礙具有相關(guān)性，具體表現(xiàn)為：攜帶Ser純合子者工作記憶較差，且女性人群中Ser純合子的頻率高于男性，是女性人群患精神分裂癥的重要因素之一[18]。本研究初步探討了CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因在不同性別苗族受試者中分布的差異。研究結(jié)果顯示，性別對(duì)于瀘州地區(qū)苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型分布均無(wú)顯著影響（P＞0.05），與劉杰等[19]的研究結(jié)果相似。提示當(dāng)苗族患者在使用以上述基因?yàn)閷?dǎo)向的藥物時(shí)，臨床無(wú)需特別注意不同性別間的差異。

目前尚無(wú)苗族人群CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因型和基因型頻率的相關(guān)研究報(bào)道。本研究以無(wú)血緣關(guān)系的54例健康苗族受試者為對(duì)象，采用RT-PCR法對(duì)其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、測(cè)序后，應(yīng)用Chromas 2軟件對(duì)其基因型進(jìn)行比對(duì)分析，初步探討苗族人群各基因型的分布情況。結(jié)果顯示，瀘州地區(qū)苗族受試者中CYP2C19 HetEM型和CYP3A4 G等位基攜帶者的比例較高，ABCB1多態(tài)性位點(diǎn)的突變率較高，CYP3A5多態(tài)性位點(diǎn)的突變率較低；性別對(duì)其CYP2C19、ABCB1、CYP3A4和CYP3A5基因多態(tài)性的分布無(wú)明顯影響。但本研究受試驗(yàn)條件的限制，研究樣本量有限，因此以上研究結(jié)果尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（編輯：張?jiān)拢?/p>

Genetic Polymorphism Analysis of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 in Miao Population from Luzhou

HU Gongli，WANG Guojun，YANG Ting，CHEN Zhu，YE Yun（Dept.of Pharmacy，the Affiliated Hospital of Southwest Medical University，Sichuan Luzhou 646000，China）

OBJECTIVE：To study the genotype and genetic frequency of cytochrome P450（CYP）2C19，ATP-binding cassette subfamily B member 1（ABCB1），CYP3A4 and CYP3A5 in Miao population from Luzhou.METHODS：A total of 54 Miao population healthy volunteers without direct sibship were randomly selected from Luzhou area in Sichuan province by coins toss.RTPCR was used to amplify CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5.PCR products were detected and sequenced.Chromas 2 software was used to analyze the genotypes，and compare genetic frequency of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5.RESULTS：For CYP2C19，the frequencies of HomEM（*1*1 genotype），HetEM（*1*2 or*1*3 genotype）and PM（*2*2，*2*3 or* 3*3 genotype）were 20.37%，61.11%and 18.52%in 54 Miao population volunteers.For ABCB1，the frequencies of CC，CT and TT genotype were 29.63%，51.85%and 18.52%，respectively.For CYP3A4，the frequencies of GG，GA and AA genotype were 38.89%，53.70%and 7.41%，respectively.For CYP3A5，the frequencies of TT，TC and CC genotype were 81.48%，16.67%and 1.85%，respectively.There was no significant differences in genetic frequency of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 among Miao population volunteers with different gender（P＞0.05）.CONCLUSIONS：There are high percent about CYP2C19 Het-EM and CYP3A5 G allele in Miao population，high mutation rate of ABCB1 polymorphic site，and low mutation rate of CYP3A5 polymorphic site.Gender have no significant effect on the polymorphism of CYP2C19，ABCB1，CYP3A4 and CYP3A5 in Miao population from Luzhou area.

Genetic polymorphisms；RT-PCR；Miao population；Luzhou area；CYP2C19；ABCB1；CYP3A4；CYP3A5

R969.1；R968

A

1001-0408（2016）32-4473-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.32.03

瀘州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2013-S-48）

＊碩士研究生。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0830-3165750。E-mail：807080229@qq.com

主任藥師，碩士。研究方向：臨床藥學(xué)。電話：0830-3165750。E-mail：wanggj7532@163.com

（2016-07-22

2016-08-29）