遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中的Hardy-Weinberg平衡

翁鴻，江梅，仇成鳳，曾憲濤

· 循證理論與實踐 ·

遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中的Hardy-Weinberg平衡

翁鴻1,2，江梅3，仇成鳳4，曾憲濤1,2

Hardy-Weinberg平衡（HWE）在科學領域是一個常用的假設，其在遺傳關(guān)聯(lián)性研究中的重要性被日益重視。HWE與基因型分型質(zhì)量密切相關(guān)，因此，制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時，需要檢驗對照組人群基因型分布是否符合HWE。本文從HWE定律的產(chǎn)生背景出發(fā)，介紹其檢驗方法，以及在制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時如何處理對照組不符合HWE的研究。

遺傳關(guān)聯(lián)性研究；基因多態(tài)性；Hardy-Weinberg平衡；Meta分析

在理想狀態(tài)下（如隨機交配，沒有選擇、突變或遷徙），人群若符合Hardy-Weinberg平衡（HWE），某一特征基因比例在遺傳中將保持不變。當前HWE在科學研究領域是一個常用假設，涵蓋植物學[1]、法醫(yī)學[2]及遺傳流行病學[3]。在遺傳關(guān)聯(lián)性研究中HWE的重要性也逐漸被研究者發(fā)現(xiàn)。Trikalinos等[4]對42篇遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析的591個研究再次進行Meta分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組中不符合HWE校正后，33篇Meta分析文獻總的比值比在10%以內(nèi)變化，另外9篇在10%～31%變化，其中3篇校正后統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)性消失。因此，在制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時，進行對照組HWE檢驗是重要的步驟。本文全面闡述HWE的產(chǎn)生、檢驗方法以及在遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中如何處理。

1 群體遺傳與進化

1.1 進化 達爾文進化理論有三條原則：①變異原則；②遺傳原則；③選擇原則。變異原則是指在任何一個群體中，不同個體之間都存在一定程度的差異，包括形態(tài)、生理及行為；遺傳原則是指后代與其雜交親本的相似性多于與無關(guān)個體的相似性；選擇原則是指在特定的環(huán)境中，某些個體總比其他個體有更強的生存能力。群體遺傳學將上述三條原則轉(zhuǎn)變成精準的遺傳學概念的科學，從研究群體的遺傳結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律來探討進化的機制。

1.2 孟德爾群體 進化的單位是群體，并不是個人，這是由于個體生命的長短是有限的，且其遺傳結(jié)構(gòu)除發(fā)生突變之外，一生中均是固定的。而群體分布廣泛，世代相傳，具有時間上的連續(xù)性，在遺傳結(jié)構(gòu)上也能發(fā)生改變。群體遺傳學研究群體是一種特定的孟德爾群體，是一群相互交配的個體集合，該群體中所有個體共有的全部基因即為基因庫。Dobzhansky[5]定義其為一群能夠相互繁殖的個體，并享有一個共同的基因庫。

1.3 群體的遺傳結(jié)構(gòu) 群體遺傳學主要是研究群體遺傳組成變化的機制。遺傳結(jié)構(gòu)是指群體中各基因的頻率及各基因型的數(shù)量分布。因此，群體遺傳學采用等位基因頻率和基因型頻率兩個概念來表達群體遺傳結(jié)構(gòu)。等位基因頻率是指某種基因在某個群體中出現(xiàn)的比例；基因型頻率是指某種特定基因型的個體占群體內(nèi)全部個體的比例。

2 HWE定律的概念和要點

2.1 HWE定律的概念 群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化引起遺傳水平上的變化，即進化。突變和重組是可遺傳變異的源泉，是進化所需的原料。在有性繁殖過程中，通過遺傳漂變和自然選擇將變異體有區(qū)別地傳遞到后代中去。但遺傳本身并不改變基因頻率，即HWE定律的原理。該定律指出：當一個大的孟德爾群體中的個體間進行隨機交配，并同時無選擇、無突變、無遷徙和遺傳漂變發(fā)生時，下一代基因型的頻率和前一代一樣，這個群體被稱為處于隨機交配系統(tǒng)的平衡中[6-10]。該定律是在1908年由英國數(shù)學家Hardy和德國醫(yī)生Weinberg分別獨立發(fā)現(xiàn)的，故稱HWE定律，又稱基因型頻率的平衡定律，它是群體遺傳學的第一理論基石[6,9,11,12]。假設一對等位基因A和B的頻率分別為p和q，且p+q=1，在該群體中有三種基因型AA、AB和BB，其基因型頻率分別為p2、2pq和q2，根據(jù)HWE定律，則（p+q）2= p2+2pq+q2=1（表1）。因此HWE定律也被稱為二項式平方定律。

2.2 HWE定律的要點 HWE定律的要點主要有三條[6]：①在以隨機交配為前提的孟德爾群體中，如果沒有基因突變、選擇或遷移的干擾，則基因頻率在遺傳過程中不發(fā)生變化；②群體的基因型頻率的平衡建立在二項式定律之中[（p+q）2= p2+2pq+q2=1]，孟德爾群體的基因型頻率取決于其等位基因頻率；③隨機交配是保持平衡狀態(tài)的重要保障。

2.3 HWE定律的推廣 HWE定律不僅適用于二等位基因的情況，也適用于復等位基因和伴性基因。如有三個等位基因A、B、C，其頻率分別為p、q、r，且p+q+r=1，那么在孟德爾群體中，這三個等位基因及其六種基因型滿足的平衡為：（p+q+r）2=p2+2pq+2pr+q2+2qr+r2（表2）。

表1 等位基因A和B的HWE

表2 復等位基因的HWE

表3 Pearson卡方檢驗計算方法

3 影響HWE的因素

3.1 基因分型錯誤 這是引起HWE偏離的重要因素[13,14]。在很多基因分型平臺中，鑒定雜合子個體比純合子個體更具有挑戰(zhàn)性，難度更大，因此，該基因型的個體缺失引起數(shù)據(jù)偏離HWE；基因分型質(zhì)量差的另一個原因是可分型率低，即大量單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點或個體無法進行基因分型，這一問題在全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）中更為顯著，在候選基因研究中也會產(chǎn)生，基因型的隨機缺失對試驗結(jié)果的影響較小，但基因分型錯誤率太高就意味著非隨機缺失，對結(jié)果會產(chǎn)生偏倚；此外，病例組和對照組中遺失率的不同也會對試驗結(jié)果產(chǎn)生偏倚，如兩組DNA提取或儲存的差異所引起的丟失[15,16]。

3.2 選擇性配對 即非隨機配對。HWE檢驗要求所分析的SNP是隨機配對的，但由于其他因素的干擾，如擇偶中女性對男性身高的選擇，以及在聾啞人群中也可能發(fā)生[16,17]。

3.3 選擇偏倚 由于死胎或早期死亡等因素導致某些基因型的流失，這些流失的基因型可能被忽略，因此可能會受到選擇偏倚的影響。

3.4 人群分層 在研究中混合了遺傳學隔離的人群，可能會引起基因型頻數(shù)偏離HWE。人群分層是遺傳關(guān)聯(lián)性研究中較為重要的一個因素。

3.5 偶然因素 有的研究分析了多個SNP，增加了I型錯誤的發(fā)生，因此其HWE檢驗的P值也需要進行多重檢驗校正，以得到校正后的P值。

3.6 其他因素 小群體中可能由于遺傳漂變、始祖效應、空間限制及雜合子優(yōu)勢而導致偏離HWE[17,18]，如囊性纖維化病，雜合子個體比正常的純合子個體有生殖優(yōu)勢。

4 HWE的檢驗

4.1 Pearson卡方檢驗 檢驗某個群體是否符合HWE最常用的方法是Pearson卡方檢驗（表3）。假設有100個人，AA、AB、BB的基因型頻數(shù)（O）分別為：O（AA）=70、O（AB）=20、O（BB）=10，計算出A、B等位基因的頻率分別為：f（A）=（70×2+20）/（2×100）=0.8、f（B）=（10×2+20）/（2×100）=0.2，然后分別計算出各基因型頻率的期望值（E）：E（AA）=100×0.82=64，E（AB）=2×100×0.8×0.2=32，E（BB）=100×0.22=4。Pearson卡方擬合優(yōu)度檢驗是通過求和（O-E）2/E來給定卡方值，該例的卡方值為：χ2=（70-64）2/64+（20-32）2/32+（10-4）2/4=14.06。此外，值得注意的是，此處卡方分布的自由度為3-1-1=1，不是3-1=2，因為等位基因頻率p已經(jīng)在觀測值中進行了估算，因此卡方分布的自由度又減少一個。因此，該卡方值對應的P值為0.0002，提示該基因型頻數(shù)偏離HWE，可能會存在雜合子數(shù)目的部分丟失。最后一步也可以在EXCEL中輸入“=CHIDIST（卡方值，自由度）”然后得出相應的P值。此外，也有多種軟件可以實現(xiàn)HWE檢驗，如Stata軟件中的genhwi命令（命令格式genhwi AA AB BB）、網(wǎng)頁版檢驗HWE（http://www.oege.org./software/hwe-mr-calc.shtml）及研究者自行在EXCEL中編輯計算公式。

4.2 其他檢驗方法 Pearson卡方檢驗是最常用的檢驗HWE的方法，但當突變基因頻率較為罕見時，Pearson卡方檢驗的統(tǒng)計效能難以滿足，此時應使用確切檢驗[7,8,10]。Li等[19]提出了一種似然比檢驗（LRT），并指出LRT比常用的Pearson卡方檢驗具有更強的統(tǒng)計效能。但Zang等[20]指出當標志物不依賴疾病時，LRT的檢驗效能也不足，需要數(shù)據(jù)最優(yōu)化來計算檢驗統(tǒng)計量，因此他們提出了一種收縮檢驗，比LRT更具有統(tǒng)計效能，也易于用在全基因組關(guān)聯(lián)研究的數(shù)據(jù)中。此外，Ward等[21]還提出了一種簡單均方根統(tǒng)計量來檢驗HWE，以及X連鎖的單核苷酸多態(tài)性的HWE檢驗[22]、近親系數(shù)檢驗[23]、不完全列舉法[24]及繪圖法[25]?？傊?，檢驗基因型頻數(shù)是否偏離HWE的方法有多種，讀者可根據(jù)情況選擇合適的方法，比如Stata軟件的genhwi命令同時提供了Pearson卡方檢驗、LRT檢驗以及確切檢驗的結(jié)果。

5 遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中對HWE的處理

5.1 檢測對照組基因型是否符合HWE 研究者普遍認為遺傳關(guān)聯(lián)性研究的可靠性和有效性在較大程度上依賴對照組的正確選擇[26]。病例組中的群體可能由于受到疾病壓力（選擇壓力的一種）的作用，使得其基因型分布偏離HWE；而未患病的對照組基因型分布應該符合HWE，因此，在進行遺傳關(guān)聯(lián)性研究的Meta分析時，應該檢測病例-對照研究的對照組基因型分布是否符合HWE。但由于檢驗HWE的效能較低，特別是對于中等效應值的檢測，因此，HuGENet推薦評估的主要目的是評價偏離HWE程度的大小，而不是檢驗是否具有統(tǒng)計學意義[27]。因此，推薦研究者在制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中，報告納入研究對照組基因型的HWE情況時應報告檢驗結(jié)果的P值，而不是僅報告該研究的對照組是否符合HWE。

5.2 對照組基因型分布偏離HWE研究的處理 制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時，有研究者提出將對照組基因型分布偏離HWE的研究進行排除，也有研究者認為應該將其納入，然后進行敏感性分析或Meta回歸分析，來比較結(jié)果的穩(wěn)定性或檢驗組間是否有差異[17,28-31]。目前普遍較為推薦的為后者，先將所有研究納入進行合并分析，然后進行敏感性分析，排除對照組偏離HWE的研究，將敏感性分析的結(jié)果與總的合并結(jié)果進行比較，驗證匯總結(jié)果的穩(wěn)健性。

6 小結(jié)

本文概述了HWE定律產(chǎn)生的背景及歷史，并闡明了其在遺傳學中的地位，因此，HWE定律在遺傳關(guān)聯(lián)性研究中也不可忽視，在進行遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時要進行HWE的檢驗。詳述了群體偏離HWE的原因，主要是基因分型質(zhì)量的原因以及檢驗HWE的目的。并展示了檢驗HWE的方法，其中Pearson卡方檢驗最為常用，軟件操作也較為簡單。最后，闡述了遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析中如何處理對照組不符合HWE的研究，即先進行匯總分析后，再進行敏感性分析，對比研究結(jié)果，考察匯總結(jié)果的穩(wěn)健性。此外，提倡研究者在制作遺傳關(guān)聯(lián)性研究Meta分析時，應報告對照組基因型分布偏離HWE的程度（即P值），而不僅僅是報告是否符合HWE。

[1] Anastassopoulos E. DNA Fingerprinting in Plants: Principles, Methods and Applications[J]. Economic Botany,2009,14(14):129-31.

[2] Council BN. The evaluation of forensic DNA evidence[M]. Washington DC: National Academy Press,2010.

[3] Sham P. Statistics in Human Genetics[M]. London: Arnold Publishers,2001.

[4] Trikalinos TA,Salanti G,Khoury MJ,et al. Impact of violations and deviations in Hardy-Weinberg equilibrium on postulated genedisease associations[J]. Am J Epidemiol,2006,163(4):300-9.

[5] DOBZHANSKY T. Mendelian populations as genetic systems[J]. Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1957,22(7):385-93.

[6] 王亞馥,戴灼華. 遺傳學[M]. 第二版,北京:高等教育出版社,2008.

[7] Wigginton JE,Cutler DJ,Abecasis GR. A note on exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Am J Hum Genet,2005,76(5):887-93.

[8] Schaid DJ,Batzler AJ,Jenkins GD,et al. Exact tests of Hardy-Weinberg equilibrium and homogeneity of disequilibrium across strata[J]. Am J Hum Genet,2006,79(6):1071-80.

[9] Mayo O. A century of Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Twin Res Hum Genet,2008,11(3):249-56.

[10] Shan G. A note on exact conditional and unconditional tests for Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Hum Hered,2013,76(1):10-7.

[11] James V Neel. Hardy-Weinberg Equilibrium and Primitive Populations[J]. Am J Hum Genet,1965,17(1):91-2.

[12] Hardy GH. MENDELIAN PROPORTIONS IN A MIXED POPULATION[J]. Science,1908,28(706):49-50.

[13] Gomes I,Collins A,Lonjou C,et al. Hardy-Weinberg quality control[J]. Ann Hum Genet,1999,63(Pt 6):535-8.

[14] Hosking L,Lumsden S,Lewis K,et al. Detection of genotyping errors by Hardy-Weinberg equilibrium testing[J]. Eur J Hum Genet,2004,12(5):395-9.

[15] Clayton DG,Walker NM,Smyth DJ,et al. Population structure, differential bias and genomic control in a large-scale, case-control association study[J]. Nat Genet,2005,37(11):1243-6.

[16] Al-Chalabi A,Almasy L. Genetics of Complex Human Diseases: A Laboratory Manual[M]. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2009.

[17] Salanti G,Sanderson S,Higgins JP. Obstacles and opportunities in meta-analysis of genetic association studies[J]. Genet Med,2005,7(1):13-20.

[18] Chen YS,Su YC,Pan W. Effect of spatial constraints on Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Sci Rep,2016,6:19297.

[19] Li M,Li C. Assessing departure from Hardy-Weinberg equilibrium in the presence of disease association[J]. Genet Epidemiol,2008,32(7): 589-99.

[20] Zang Y,Yuan Y. A shrinkage method for testing the Hardy-Weinberg equilibrium in case-control studies[J]. Genet Epidemiol,2013,37(7): 743-50.

[21] Ward R,Carroll RJ. Testing Hardy-Weinberg equilibrium with a simple root-mean-square statistic[J]. Biostatistics,2014,15(1):74-86.

[22] Zheng G,Joo J,Zhang C,et al. Testing association for markers on the X chromosome[J]. Genet Epidemiol,2007,31(8):834-43.

[23] Salanti G,Amountza G,Ntzani EE,et al. Hardy-Weinberg equilibrium in genetic association studies: an empirical evaluation of reporting, deviations, and power[J]. Eur J Hum Genet,2005,13(7):840-8.

[24] Maurer HP,Melchinger AE,Frisch M. An incomplete enumeration algorithm for an exact test of Hardy-Weinberg proportions with multiple alleles[J]. Theor Appl Genet,2007, 115(3):393-8.

[25] Graffelman J,Camarena JM. Graphical tests for Hardy-Weinberg equilibrium based on the ternary plot[J]. Hum Hered,2008,65(2):77-84.

[26] 劉紅,胡永華. 遺傳流行病學研究中的H-W平衡檢驗[J]. 中南大學學報(醫(yī)學版),2010,35(1):90-3.

[27] Little J,Higgins JPT (editors). The HuGENet? HuGE Review Handbook, version 1.0. http://www.hugenet.ca (accessed 28 February 2006).

[28] Nakaoka H,Inoue I. Meta-analysis of genetic association studies: methodologies, between-study heterogeneity and winner's curse[J]. J Hum Genet,2009,54(11):615-23.

[29] Sagoo GS,Little J,Higgins JP. Systematic reviews of genetic association studies. Human Genome Epidemiology Network[J]. PLoS Med,2009,6(3):e28.

[30] Minelli C,Thompson JR,Abrams KR,et al. How should we use information about HWE in the meta-analyses of genetic association studies?[J]. Int J Epidemiol,2008,37(1):136-46.

[31] Salanti G,Higgins JP,Trikalinos TA,et al. Bayesian meta-analysis and meta-regression for gene-disease associations and deviations from Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Stat Med,2007,26(3):553-67.

本文編輯：姚雪莉

Hardy-Weinberg equilibrium in Meta-analysis of genetic association study

WENG Hong*, JIANG Mei, QIU Cheng-feng, ZENG Xian-tao.*Center for Evidence-Based and Translational Medicine, Zhongnan Hospital, Wuhan University, Wuhan 430071, China.

To Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) is a common hypothesis in field of science and its importance is more and more predominant in genetic association study. HWE is closely correlated with quality of genotyping. Therefore, the coincidence between genotype distribution in controls and HWE should be tested when a Meta-analysis of genetic association study was conducted. The test method, and how to deal with the studies that were not coincided with HWE during performing Meta-analysis of genetic association study were introduced in the paper based on the emerging background of HWE.

Genetic association study; Gene polymorphism; Hardy-Weinberg equilibrium; Meta-analysis

R4

A

1674-4055(2016)11-1281-03

國家重點研發(fā)計劃專項基金(2016YFC0106300)

1430071 武漢,武漢大學中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心;2430071 武漢,武漢大學循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心；3510120 廣州,廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院·呼吸疾病國家重點實驗室·呼吸疾病國家臨床研究中心·廣州呼吸疾病研究所；4418000 懷化,懷化市第一民醫(yī)院臨床藥學研究室·循證醫(yī)學中心

曾憲濤,E-mail:zengxiantao1128@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.11.01