蠶蛹蟲草及大米蟲草培育技術(shù)研究

盧建珍　王建偉　劉有志　李淑芳

(山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院,山西運(yùn)城 044000)

?

蠶蛹蟲草及大米蟲草培育技術(shù)研究

盧建珍王建偉劉有志李淑芳

(山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院,山西運(yùn)城 044000)

通過選取、引進(jìn)優(yōu)質(zhì)母種、經(jīng)過轉(zhuǎn)管培養(yǎng)獲得優(yōu)質(zhì)原種，再繁育成液體菌種，接種在蠶蛹及大米添加蛹粉的培養(yǎng)基上，研究與總結(jié)菌絲培養(yǎng)期、轉(zhuǎn)色催蕾期、子實(shí)體管理期三個(gè)主要階段的培養(yǎng)條件及關(guān)鍵技術(shù)。

蛹蟲草大米蟲草液體菌種大米培養(yǎng)基栽培技術(shù)

蛹蟲草又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草、蟲草等，為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬真菌，是蟲草屬的模式種。其有效成分及功效與天然冬蟲夏草極為相近，二者可相互代替入藥，具有益腎壯陽，補(bǔ)肺平喘，止血化痰的功效。近幾年來，由于生態(tài)環(huán)境的惡化，及人工過度采挖，天然冬蟲夏草資源逐漸減少，且價(jià)格高昂，而以大米、蠶蛹等為培養(yǎng)基或寄主，采用液體菌種栽培蠶蛹蟲草，其生長周期短，作為冬蟲夏草的替代品，越來越受到人們的青睞。

蛹蟲草中含有豐富的營養(yǎng)成份，如蟲草素、蟲草酸、多糖、超氧化物岐化酶、多種人體必須氨基酸、微量元素及維生素等。 經(jīng)檢測蛹蟲草中蟲草素的含量高于天然冬蟲夏草；活體蛹蟲草中腺苷的含量最高，大米蟲草中腺苷含量稍低；蟲草多糖、超氧化物岐化酶也明顯高于冬蟲夏草；只有蟲草酸的含量略低于冬蟲夏草；蛹蟲草對人體具有普遍的醫(yī)療保健作用，其中所含的微量元素是治療某些疾病時(shí)的主要成份。實(shí)驗(yàn)檢測中發(fā)現(xiàn)蛹蟲草中鎂、磷、鈣、鉀、鈉含量較豐富，其中活體蠶蛹栽培的蟲草中磷、鉀的含量最高，大米培養(yǎng)基蟲草中鈣的含量最高，菌絲體中鈉的含量最高[1]。

近幾年來，山西省蠶業(yè)科學(xué)研究院科研人員進(jìn)行了蛹蟲草培育技術(shù)的研究，主要模式有蠶蛹活體培育、大米培育、大米添加蛹粉培育蟲草3種，均取得了成功?，F(xiàn)將我院這幾年的種植模式、方法、經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下。

1　材料和方法

1.1菌種來源

優(yōu)良菌種一般是從國內(nèi)科具有資質(zhì)的科研院所或生產(chǎn)單位直接引進(jìn)純正母種，或從野外通過采挖、選擇、分離、轉(zhuǎn)管培養(yǎng)獲得。我們單位是從大連生物所引進(jìn)的母種，通過轉(zhuǎn)管繁育獲得優(yōu)良的固體原種，最終獲得優(yōu)良的液體菌種。

1.2固體菌種的制備

1.2.1培養(yǎng)基制備

土豆200 g,葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，磷酸二氫鉀1.5 g，硫酸鎂0.5 g,鹽酸硫銨素20 mg，瓊脂20 g,水1000 mL[2]，先將馬鈴薯冼凈刮去外皮切成小塊，用水煮沸25 min，用紗布過濾后取其澄清液，然后將瓊脂放入用文火煮化，依次放入磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖和蛋白胨，溶化后趁熱裝入試管，我們采用的是18mm×180mm規(guī)格的試管，每支裝液體10 mL，然后用棉塞塞緊管口后用高壓鍋進(jìn)行滅菌消毒。保持溫度121℃，壓力0.1-0.11 MPa，維持30 min，晾涼出鍋后趁熱放成斜面待用。

1.2.2斜面菌種培養(yǎng)

將母種在超凈工作臺無菌條件下接入斜面培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，4天后菌絲萌動，此后每天見光10 h培養(yǎng)20 d左右，待菌絲布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3液體菌種的制備

1.3.1蛹體注射用液體菌種

在超凈工作臺內(nèi)無菌條件下，用無菌鏟刮下事先培養(yǎng)好的試管菌種斜面上的菌苔，然后加入10 mL左右的無菌水，研磨均勻后獲得菌種懸浮液，可直接注入蛹體。

1.3.2大米培養(yǎng)基上采用的液體菌種：將水1000 mL，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g ,硫酸鎂1.5 g，維生素B210 mg，蛋白胨3 g,牛肉膏5 g，以上藥品攪拌均勻裝入錐形瓶中，用高壓滅菌進(jìn)行消毒，溫度要求達(dá)到120℃，壓力達(dá)到0.1～0.11 MPa后，維持30 min，出鍋?zhàn)匀焕鋮s后備用。在接種前首先要將接種室、接種器具和手進(jìn)行消毒，然后在超凈工作臺內(nèi)無菌條件下，將菌種從試管刮出同時(shí)放入錐形瓶中。接好的液體菌種在25℃恒溫、避光環(huán)境下培養(yǎng)3 d，然后在轉(zhuǎn)速為130～140 r/min的搖床上培養(yǎng)5 d，等到液體培養(yǎng)基中充滿淡黃色菌球且液體清澈透明，說明此時(shí)的液體菌種成熟且沒有遭受污染。然后用無菌水稀釋5倍備用。

1.4大米培養(yǎng)基的制備

1.4.1普通大米培養(yǎng)基

將200 g土豆刮去表皮切成1 cm見方的小塊，加入適量的水，煮沸，并用小火熬制25 min，過濾殘?jiān)笕∩厦娉吻宓闹簜溆茫艣龊笠来畏湃肫咸烟?0 g，蛋白胨10 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，檸檬酸銨1 g，維生素B11片及水1000 mL，同時(shí)攪拌均勻，測量其溶液pH值達(dá) 7～8后放置備用。

將30 g大米，40 mL營養(yǎng)液分裝入500 mL培養(yǎng)瓶中，大米與混合營養(yǎng)液培養(yǎng)基的比例約為1∶1.2～1.3，如果所用培養(yǎng)基水分的過大，則蟲草菌絲僅在培養(yǎng)基表面生長，后期極易造成雜菌污染；反之，如果培養(yǎng)基水分太少，則蟲草菌絲纖弱細(xì)小，后期難以轉(zhuǎn)色出草。經(jīng)過測試，這種比例的大米培養(yǎng)基，滅菌后培養(yǎng)基松軟不爛，米粒之間稍微有點(diǎn)空隙，然后用耐高溫橡皮圈、舊報(bào)紙封實(shí)封口，置于高壓滅菌鍋中保持溫度121℃，滅菌時(shí)間達(dá)到30 min或者溫度達(dá)到100℃滅菌時(shí)間超過8 h均可，自然冷卻到30℃以下備用。

1.4.2加蠶蛹粉的大米培養(yǎng)基

水1000 mL，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，維生素B13～4片，雞蛋2個(gè)，準(zhǔn)確稱量以上物質(zhì)并攪拌均勻，測得pH 7～8后放置備用，將30 g大米，蠶蛹細(xì)粉3 g， 40 mL營養(yǎng)液分裝入500 mL培養(yǎng)瓶中，再用耐高溫橡皮圈、舊報(bào)紙封實(shí)瓶口，置于高壓滅菌鍋中保持121℃滅菌30 min，冷卻到30℃以下備用。

1.5蠶蛹準(zhǔn)備

春蠶或秋蠶期，在25℃保護(hù)下的家蠶蛹，在化蛹后第二天開始削繭，同時(shí)挑選新鮮健康的鮮活家蠶蛹準(zhǔn)備接種，需要接種的蠶蛹盡量不要超過化蛹7 d。在接種前先用75%的酒精噴灑蛹體表面進(jìn)行消毒，再用無菌水洗去殘留的酒精，就可以進(jìn)行接種了。

2　接種方法

2.1蠶蛹接種

目前，對蠶蛹接種方法主要有3種，注射法、浸漬法和穿刺法。我們采用的是液體菌種蛹體注射法。在超凈工作臺內(nèi)，用酒精擦拭工作臺面先進(jìn)行消毒，在酒精燈旁用5～10 μL微量移液器吸取6 μL的液體菌種，在蛹的腹面倒數(shù)第二腹節(jié)間膜處平行扎入蛹體，接種量根據(jù)菌濃度大小確定，一般為5～6 μL，針頭拔出時(shí)在蛹體內(nèi)旋轉(zhuǎn)后拔出，接好種的蠶蛹用75%酒精消毒后放入培養(yǎng)器中蓋好蓋子送入暗室進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2大米及大米復(fù)合培養(yǎng)基接種

整個(gè)接種工作要在超凈工作臺無菌條件下進(jìn)行。首先用75%的酒精擦拭超凈工作臺內(nèi)部進(jìn)行全面消毒，然后點(diǎn)亮酒精燈，并在靠近酒精燈的區(qū)域打開蟲草培養(yǎng)瓶封口膜的一個(gè)小邊角，迅速用無菌注射器吸取7～8 mL的液體菌種，均勻噴灑在培養(yǎng)瓶中，同時(shí)立即更換已經(jīng)消過毒的塑料封口膜。整個(gè)接種動作要求迅速快捷，盡量減少雜菌污染。完成后，及時(shí)拿到已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)箱或培養(yǎng)室進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。

3　栽培管理

3.1菌絲培養(yǎng)期

栽培管理是決定蟲草產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵，蛹蟲草在后期的各個(gè)發(fā)育階段主要是受溫度、濕度和光線三大因素的影響。蛹蟲草喜中低溫，在菌絲培養(yǎng)階段，溫度最好控制在19℃，這樣可抑制雜菌發(fā)育。待蛹體周圍、培養(yǎng)基料面布滿白色絨毛狀菌絲時(shí)將室溫調(diào)到20～22℃繼續(xù)培養(yǎng)。發(fā)菌階段，室內(nèi)濕度應(yīng)該控制在65%～70%左右。蟲草菌絲在黑暗中發(fā)育較快，因此蟲草室的門窗必須進(jìn)行遮光處理，保持黑暗。

在以上溫濕度及光線條件下，蠶蛹經(jīng)7～10 d感染菌液后硬化，約15 d左右在蠶蛹體側(cè)的氣門處可見白色菌絲出現(xiàn)，待白色菌絲布滿蠶蛹表面時(shí)即可進(jìn)入第二個(gè)培養(yǎng)階段—轉(zhuǎn)色催蕾期。大米培養(yǎng)基經(jīng)過15 d培養(yǎng)，白色菌絲也會長滿培養(yǎng)基即進(jìn)入下一個(gè)培養(yǎng)階段。

3.2轉(zhuǎn)色催蕾期

白色菌絲體成熟后，要進(jìn)行適當(dāng)?shù)墓庹蘸蜏夭畲碳げ拍苄纬膳囵B(yǎng)原基。此時(shí)每天要進(jìn)行感光，約12 h左右，白天可利用自然光，陰天或傍晚補(bǔ)充日光燈照射，光照強(qiáng)度為100～200 lx，晚上要盡量保持黑暗；白天室內(nèi)溫度控制在21℃左右，夜晚16℃左右；室內(nèi)相對濕度控制在75%左右；這樣經(jīng)過3 d，菌絲體開始由白色變成淡黃色，7～10 d后，菌絲體逐漸變成桔黃色。轉(zhuǎn)色后再培養(yǎng)1～3 d，待培養(yǎng)基表面長出許多圓丘狀隆起—菌蕾，此時(shí)原基形成。

3.3出草管理期

這個(gè)階段除了要控制好溫度、濕度和光照，還要及時(shí)做好氧氣補(bǔ)充工作。

1)溫度:此時(shí)要形成子座，溫度必須控制在20～23℃，超過25℃時(shí)則不能形成子座，這在用大米培養(yǎng)時(shí)表現(xiàn)更為明顯。

2)濕度：子座生長階段需要更多的水份，為了減少瓶內(nèi)水分蒸發(fā)，培養(yǎng)室內(nèi)要及時(shí)補(bǔ)充水分，以提高空氣的相對濕度，室內(nèi)相對溫度要控制在80%～90%之間，但是濕度也不宜過大，超過95%時(shí)，霉菌等雜菌則容易繁殖。

3)光照：光照時(shí)間每天不能少于12 h。光照強(qiáng)度要在200 lx以上。由于蛹蟲草具有較強(qiáng)的趨光性，在子實(shí)體形成后，要根據(jù)生長發(fā)育狀況，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)瓶與光的方向，以保證子實(shí)體的良好形態(tài)，同時(shí)提高產(chǎn)量。

4)氧氣補(bǔ)充：此期可通過在封口膜上扎孔透氣給子實(shí)體補(bǔ)充氧氣。在封口膜上扎上數(shù)個(gè)小孔及時(shí)給蟲草補(bǔ)充氧氣，這樣培養(yǎng)7～10 d后，子實(shí)體就不再增粗增長，其頂端開始膨大，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)延長光照時(shí)間，再經(jīng)過2～5 d，蛹蟲草頂端出現(xiàn)淡黃色的粉末狀物體時(shí)，標(biāo)志著蟲草培養(yǎng)成熟，此時(shí)應(yīng)及時(shí)采收。

3.4采收

蛹蟲草成熟時(shí)顏色呈桔黃色，子實(shí)體頭部膨大，表面有許多黃色粉狀的子囊孢子出現(xiàn)時(shí)即為培養(yǎng)成熟。在采收時(shí)要戴上消毒好的無菌手套，用無菌鑷子將蟲草從培養(yǎng)器內(nèi)小心的取出子實(shí)體，然后加少許營養(yǎng)液，重新包扎好瓶口，繼續(xù)培養(yǎng)20 d左右，又可長出第二批子座。如果是用蠶蛹培養(yǎng)的子實(shí)體，則連同蠶蛹一同取出，保留子實(shí)體形狀完好無損。

蛹蟲草采收后，在通風(fēng)陰涼處自然晾干，避免陽光直射，或用40℃以下低溫烘干的方式進(jìn)行干制。烘干后，蛹蟲草的含水量一般在10%左右，按照質(zhì)量等級進(jìn)行分級包裝即可。

4　小結(jié)與討論

4.1蟲草要獲得高產(chǎn)收益，首先取決于菌種的選育。一是要早熟、高產(chǎn)，以降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。二是要求菌種對昆蟲的感染力強(qiáng)，能快速感染昆蟲與培養(yǎng)基，提高成活率。三是對環(huán)境溫度變化和其他雜菌感染要有一定的抵抗力。此外，如果長期采用無性繁殖或者多次轉(zhuǎn)管獲得的蟲草菌種，它的母本優(yōu)良特性很容易發(fā)生變異，在生產(chǎn)中培育的蟲草子實(shí)體易畸形，產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)量都會有很大程度的下降。因此在生產(chǎn)中要定期對選留的蟲草菌種進(jìn)行一次有性繁殖，以獲得高質(zhì)量的蟲草菌種。

4.2近幾年的培養(yǎng)對比試驗(yàn)表明，新鮮健康的鮮活蠶蛹是蛹蟲草的理想培養(yǎng)基，但由于蠶蛹受養(yǎng)蠶季節(jié)、運(yùn)輸、家蠶蛹發(fā)育期短等因素的影響，再加上接種過程單一緩慢，要想實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)難度很大；而用大米作培養(yǎng)基栽培蛹蟲草效果好，添加了蠶蛹粉的大米培養(yǎng)基其菌絲生長迅速，子實(shí)體產(chǎn)生的時(shí)間早，生長周期短，成熟較快，生物轉(zhuǎn)化率高，具有良好的發(fā)展前景。

4.3蠶蛹蟲草大米蟲草的人工栽培雖然已經(jīng)獲得成功，但在培養(yǎng)的過程中需要注意以下幾個(gè)方面: ①蟲草菌種的優(yōu)良性狀，存在著極大的遺傳不穩(wěn)定性，在多次轉(zhuǎn)管繁殖后會出現(xiàn)不同程度的菌種退化，因此要定期進(jìn)行一次有性繁殖，保持其優(yōu)良性狀，提高菌種質(zhì)量；②接種完成后在發(fā)菌期，要保持低溫18℃左右，以減少雜菌污染，提高接種成活率；③在培養(yǎng)原基形成時(shí)，一定要有適當(dāng)?shù)臏夭?5℃)刺激，只有經(jīng)過溫差刺激，原基才能正常分化；④在原基形成后，要采取補(bǔ)氧措施，及時(shí)在封口膜上扎孔，促使子實(shí)體正常生長；⑤子實(shí)體生長過程中，注意補(bǔ)濕，達(dá)到90%左右；⑥適時(shí)采收，否則子實(shí)體萎蔫影響蟲草質(zhì)量。

[1]朱雅紅 桂仲爭.蛹蟲草液體菌種通氣發(fā)酵培養(yǎng)及其營養(yǎng)成份分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009(9):699.

[2]孟楠,李亞潔,李學(xué)軍,等.人工培育柞蠶蟲草的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):63-64.

Breeding Technology of Cordyceps Militaris and Rice Caterpillar Fungus

LU Jianzhen，WANG Jianwei，LIU Youzhi，LI Shufang

(Shanxi Provincial Sericultural Institute, 044000,Yuncheng ,Shanxi, China)

The superior mother seed was acquired through selection, introduction of high quality mother seed, and roll tube culture.Then it was produced into liquid spawn and inoculated into the cultures of chrysalis and rice plus pupa powder.The three major periods, namely, mycelium culture, veraison and bud pressing, and fruit body management, were studied and summarized on the culture conditions and key technologies.

Cordyceps Militaris; Rice Caterpillar Fungus; liquid spawn; rice culture; breeding technology

盧建珍(1970—)，女，農(nóng)藝師，從事家蠶繁育及蛹蟲草培育研究。

* 資助項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-22)；山西省商務(wù)廳繭絲綢風(fēng)險(xiǎn)基金項(xiàng)目(2015)