RNAi技術(shù)研究現(xiàn)狀及其在柞蠶基礎(chǔ)應(yīng)用研究的前景

諶苗苗　鐘　亮　趙春山　王鳳成　冀萬(wàn)杰　張　博　李喜升

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

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RNAi技術(shù)研究現(xiàn)狀及其在柞蠶基礎(chǔ)應(yīng)用研究的前景

諶苗苗鐘亮趙春山王鳳成冀萬(wàn)杰張博李喜升*

(遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所,遼寧鳳城 118100)

RNAi 技術(shù)目前已在昆蟲基因研究中得到廣泛應(yīng)用，它是由雙鏈 RNA誘發(fā)并最終導(dǎo)致同源 mRNA特異性沉默的過(guò)程。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外dsRNA 的設(shè)計(jì)、導(dǎo)入方法及 RNAi 技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)行了綜述，對(duì) RNAi技術(shù)在柞蠶基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用作一展望。

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RNAi (RNA interference) 主要指的是由dsRNA(或siRNA)誘導(dǎo)的對(duì)靶標(biāo)基因mRNA降解，從而導(dǎo)致相應(yīng)蛋白表達(dá)量減少甚至停止的基因沉默現(xiàn)象。它廣泛存在于真菌、植物和動(dòng)物等真核生物中，即參與細(xì)胞防御與分化調(diào)控，還可以抵御病毒和其他外來(lái)核酸的入侵，使生物體自身處于遺傳穩(wěn)定的狀態(tài)。

RNAi除了具有高特異性及抑制基因表達(dá)的高效性，還具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)較低的特點(diǎn)。此外，Bellés發(fā)現(xiàn)在昆蟲中，特別是遺傳操作較難的非模式昆蟲的功能基因研究中可以采用這一技術(shù)輔助研究[1]。 近年來(lái)諸多科學(xué)研究人員采用 RNAi 技術(shù)在昆蟲的基因功能研究、RNAi介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因抗蟲植物以及益蟲疾病控制等方面取得了較顯著的成果[2-5]。

2001年《Science》雜志將RNAi技術(shù)列為年度科學(xué)十大突破之一?？梢?jiàn)作為基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，RNAi已得到科學(xué)界的認(rèn)同和高度重視。最近科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)了許多參與RNAi的基因和蛋白質(zhì)，這表明RNAi 與細(xì)胞分化及生物發(fā)育密切相關(guān)，并且在基因表達(dá)調(diào)控和基因功能研究中發(fā)揮重要的作用[6]。

1　RNA干擾可能的分子機(jī)制

目前已知RNAi的作用機(jī)制由siRNA、miRNA、piRNA等small RNA引發(fā)，其作用機(jī)制也有所不同[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)RNAi作用機(jī)理的研究也取得了一定的進(jìn)展。研究人員發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象在基因轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個(gè)不同的水平都存在。RNAi可以用兩種分子機(jī)制進(jìn)行解釋，一種機(jī)制是抑制靶mRNA的翻譯，使靶蛋白表達(dá)受阻；另一種機(jī)制是通過(guò)誘導(dǎo)靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，使靶基因的轉(zhuǎn)錄受阻[6]。RNAi作用過(guò)程大致可以分為起始、效應(yīng)、擴(kuò)增三個(gè)階段，這三個(gè)階段都需要一系列中間物質(zhì)的參與[8]。

1.1起始階段

起始階段主要包括dsRNA 的形成和siRNA的產(chǎn)生關(guān)鍵步驟。

1.1.1dsRNA 的形成

在RNAi研究中誘導(dǎo)靶標(biāo)基因mRNA沉默的關(guān)鍵分子是相對(duì)于小片段siRNA的長(zhǎng)dsRNA[9]，外源DNA、RNA序列均可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的dsRNA，但產(chǎn)生的方式有所不同[6]。細(xì)胞可以通過(guò)特定轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)序列產(chǎn)生dsRNA，細(xì)胞中正義和反義RNA的同時(shí)轉(zhuǎn)錄也可產(chǎn)生dsRNA。而RNA病毒需要在RNA聚合酶(RNAdependent RNApolymerases，RdRP)的幫助下，與合成的病毒RNA序列互補(bǔ)鏈結(jié)合形成dsRNA[10]。線蟲可以通過(guò)直接注射或浸泡溶液中等方式引入外源dsRNA[6]。對(duì)某一基因進(jìn)行研究前提是獲得相應(yīng)的mRNA序列信息，因?yàn)楫?dāng)dsRNA進(jìn)入昆蟲細(xì)胞內(nèi)會(huì)被 Dicer 酶切割成siRNA，而作用靶標(biāo)分子必須為mRNA的形式[9]。

1.1.2siRNA的產(chǎn)生

siRNA(short interfering RNA, siRNA)也被稱為向?qū)NA(guide RNA)，RNAi反應(yīng)由siRNA啟動(dòng)。當(dāng)dsRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，長(zhǎng)dsRNA會(huì)被核酸酶RNaseⅢ家族中的Dicer酶，逐步切割成約21-23 nt的由正、反義鏈組成的雙鏈小分子干擾RNA片斷[6]。使靶標(biāo)基因沉默的siRNA長(zhǎng)度一般為19～25 nt，而在這個(gè)階段中RNaseⅢ起著核心作用[10]。作為切割工具的Dicer參與RNaseⅢ的作用必須要結(jié)合dsRNA 的末端才能發(fā)揮作用，一旦這種末端結(jié)合被阻斷，Dicer 的核酸內(nèi)切酶作用將大大削弱。

1.2效應(yīng)階段

效應(yīng)階段是指siRNA雙鏈解開(kāi)變成單鏈，反義siRNA和相應(yīng)的蛋白結(jié)合形成具有活性的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex, RISC)。RISC能夠識(shí)別與siRNA具有完全互補(bǔ)序列的mRNA，特異地降解mRNA。因此RISC的形成與作用是這一階段的關(guān)鍵。

1.3擴(kuò)增階段

從線蟲和植物細(xì)胞RNAi研究得到的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在 RNA聚合酶的參與下，以第1次dsRNA的降解得到的siRNA的反義鏈為引物，靶mRNA作模板，形成新的dsRNA，再次被內(nèi)切酶Dicer識(shí)別并切斷，形成新的siRNA再作用于另外的靶向mRNA。這樣依次循環(huán)進(jìn)行使RNAi作用信號(hào)在生物體中可以不斷放大。

2　昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法

柞蠶基礎(chǔ)應(yīng)用研究起步相對(duì)滯后，各種基因功能研究工作開(kāi)展難度較大，現(xiàn)階段RNAi技術(shù)在柞蠶上的應(yīng)用實(shí)例少之又少。但是放眼昆蟲綱，RNAi技術(shù)已經(jīng)取得了顯著的成績(jī)。尤其是對(duì)昆蟲RNAi的導(dǎo)入方法的探索已經(jīng)相對(duì)明朗。

要利用 RNAi技術(shù)對(duì)昆蟲靶標(biāo)基因進(jìn)行功能分析，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵技術(shù)就是將dsRNA或siRNA 導(dǎo)入昆蟲體內(nèi)。目前可以通過(guò)傳統(tǒng)微注射磷酸鈣法、電穿孔轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染等方法將獲得的dsRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，也可以通過(guò)顯微注射法、壓力滲透導(dǎo)入等方法對(duì)靶基因沉默[6]?，F(xiàn)在昆蟲RNAi導(dǎo)入的環(huán)節(jié)廣泛采用注射和飼喂兩種途徑。

2.1注射法

在大部分昆蟲 RNAi研究之中，利用注射法導(dǎo)入dsRNA是常用且有效的方法之一。大多數(shù)人認(rèn)為，只要將dsRNA或siRNA注入到靶標(biāo)細(xì)胞內(nèi)，干擾的效果就會(huì)發(fā)生。但事實(shí)上，干涉效率僅取決于可用性的核心干涉RNA[11-12]。

注射法屬于系統(tǒng)性RNA干擾。首先選取適當(dāng)發(fā)育時(shí)期的研究昆蟲，對(duì)于活動(dòng)能力強(qiáng)的昆蟲進(jìn)行適當(dāng)?shù)氖`。根據(jù)昆蟲血液循環(huán)規(guī)律選取合適注射部位。通過(guò)對(duì)一般昆蟲中進(jìn)行的RNAi試驗(yàn)比較發(fā)現(xiàn)，相同dsRNA濃度下齡期相對(duì)小的蟲子誘導(dǎo)RNAi效果更佳一些。但不是對(duì)所有昆蟲的所有基因都是這樣，必須要根據(jù)自己的研究進(jìn)行試驗(yàn)才能明確[9]。不同的昆蟲對(duì)于系統(tǒng)RNA的沉默所需dsRNA或siRNA的劑量存在很大的差異。在大多數(shù)的報(bào)道中，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)范圍一般都在1～100 μg之間[11]。但這種是多數(shù)情況，有些昆蟲對(duì)雙鏈 RNA有著很強(qiáng)的抵抗力，即使加大劑量，也起不到沉默效果。例如Tabunoki等[13]對(duì)家蠶腸道注射dsRNA發(fā)現(xiàn)，但標(biāo)靶蛻皮基因受體沒(méi)有任何的系統(tǒng)沉默效果。此外，注射壓力和注射造成的傷口不可避免的會(huì)激發(fā)昆蟲的免疫反應(yīng)，因此研究昆蟲免疫反應(yīng)不宜采取注射方式進(jìn)行RNAi[14]。

2.2飼喂法

飼喂法屬于非系統(tǒng)性 RNAi，對(duì)于一些難以采用注射導(dǎo)入dsRNA的昆蟲而言是一種有效的RNAi研究方法，通過(guò)喂食的途徑可以達(dá)到沉默的效果。與直接注射的方法相比，采用喂食的方法使機(jī)體不受損傷，在未來(lái)試驗(yàn)中將得到更好的利用，尤其在轉(zhuǎn)基因植物研究中能夠起到相當(dāng)大的幫助。同時(shí)飼喂法也是一種快速的篩選靶基因的途徑。飼喂法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但是由于研究昆蟲的個(gè)體大小、個(gè)體習(xí)性，以及食下后作用部位、時(shí)間等原因?qū)ξ故车牧?、喂食時(shí)間、喂食次數(shù)的確定還是一個(gè)有待于亟需解決的難題。因此相對(duì)于注射法的直接作用，飼喂法在RNAi研究的的早期的相對(duì)成功率較低，但是現(xiàn)已在多個(gè)昆蟲上取得了明顯的成功。Tian等[15]采用飼喂法再甜菜夜蛾上獲得了很好的試驗(yàn)效果。同時(shí)也有試驗(yàn)證明，對(duì)昆蟲喂食dsRNA后24 h內(nèi)不再喂食，最后取得的干擾效果會(huì)大大加強(qiáng)，原因可能是昆蟲處于饑餓狀態(tài)時(shí)，吸收的效率會(huì)大大提高[11]。

3　昆蟲 RNAi的研究現(xiàn)狀

RNAi作為基因功能的一個(gè)研究手段從問(wèn)世以來(lái)受到多方關(guān)注。隨著RNAi技術(shù)可行性的提高以及操作的簡(jiǎn)單化，RNAi技術(shù)得到廣泛的應(yīng)用。目前在昆蟲上的RNAi技術(shù)也相對(duì)成熟，但是在鱗翅目大蠶蛾科的柞蠶的基礎(chǔ)研究中該技術(shù)應(yīng)用相對(duì)較少，也正因?yàn)槿绱俗跣Q的功能基因的研究還處于起步階段，已知功能的基因數(shù)量較少。所以可以借鑒RNAi技術(shù)在其他昆蟲綱物種取得的經(jīng)驗(yàn)結(jié)合自身特點(diǎn)加以應(yīng)用。

3.1在基因功能研究上的應(yīng)用

之前研究人員采用RNAi技術(shù)通過(guò)注射法將類鈣粘蛋白基因?qū)?yīng)的dsRNA導(dǎo)入到小菜蛾幼蟲體內(nèi)，48 h后試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量顯著下降，但到72 h后表達(dá)量逐漸恢復(fù)。 采用免疫印跡法進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，注射dsRNA 48 h后幼蟲刷狀緣膜囊泡中的類鈣粘蛋白含量明顯下降。此試驗(yàn)結(jié)果為RNAi分析技術(shù)在小菜蛾乃至其他鱗翅目昆蟲基因的功能的研究上提供了參考依據(jù)[14]。Benencourt等在對(duì)天蠶蛾和家蠶研究發(fā)現(xiàn)，將dsRNA注射蛹到中發(fā)現(xiàn)，RNAi即使可以使卵巢的卵母細(xì)胞呈現(xiàn)出很好的吸收效果，并且影響胚胎表型的生長(zhǎng)[15]。

RNAi技術(shù)可以作為研究基因功能的一個(gè)手段，科研人員采用RNAi技術(shù)克隆了家蠶Caspase家族基因BmCaspase-X，并對(duì)該基因的功能進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)家蠶BmCaspase-X含有Caspase家族基因所特有的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，屬于家族中的一員。但對(duì)該基因的干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[16]。

3.2生物防治方面應(yīng)用

現(xiàn)階段在對(duì)新型藥物和農(nóng)藥的研究上已經(jīng)采用了更為先進(jìn)的技術(shù)。這些技術(shù)中有通過(guò)利用昆蟲細(xì)胞、胚胎、幼蟲和成蟲借助RNAi技術(shù)在昆蟲細(xì)胞或個(gè)體模型中直接沉默目標(biāo)基因，從分子水平尋找藥物靶標(biāo)、開(kāi)發(fā)新型農(nóng)藥[17]。Baum利用RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育了能夠表達(dá)與美國(guó)西部玉米根蟲 (western corn rootworm，WCR) 液泡 ATPase編碼基因同源的dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米，增強(qiáng)了玉米對(duì)WCR的抗性，減輕了WCR對(duì)玉米的危害，進(jìn)一步提高玉米產(chǎn)量和質(zhì)量[18]。蜜蜂有在自然養(yǎng)殖條件下容易受 IAPV(Israeli acute paralysis virus以色列急性麻痹病毒)干擾而導(dǎo)致的死亡現(xiàn)象。Hunter等[4]通過(guò)對(duì)蜜蜂的野外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了與IAPV同源dsRNA，以此推斷通過(guò)RNAi技術(shù)可以幫助減少蜜蜂野外因IAPV的意外死亡，提高蜜蜂自然養(yǎng)殖的數(shù)量。

4　前景

柞蠶屬于鱗翅目大蠶蛾科柞蠶屬，其基礎(chǔ)研究相對(duì)于家蠶和果蠅等模式昆蟲較為落后。對(duì)于柞蠶的基因研究比較滯后，基因組還處于研究過(guò)程，各個(gè)基因的功能作用還不完全明確。

RNAi作為一種在動(dòng)物植物界廣泛應(yīng)用的基因沉默的手段，已經(jīng)在昆蟲多個(gè)物種的基因功能，病蟲害防護(hù)等領(lǐng)域取得可喜的結(jié)果。而柞蠶采用這項(xiàng)技術(shù)研究的報(bào)道相對(duì)較少，因此應(yīng)該將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于柞蠶的研究中去。

昆蟲上應(yīng)用RNAi技術(shù)的示例相對(duì)較多，也取得了較好的結(jié)果。但是依然存在一些關(guān)鍵的問(wèn)題需要解決，例如對(duì)于dsRNA的合成，這是RNAi技術(shù)應(yīng)用的前提，對(duì)于不同的基因結(jié)構(gòu)，并不是 dsRNA片段的長(zhǎng)度越長(zhǎng)或者越短沉默效果越好。有研究人員證實(shí)dsRNA長(zhǎng)度在300～520bp之間沉默效果最佳[19]，這需要具體昆蟲具體分析參考，借鑒前人的研究結(jié)果設(shè)計(jì)柞蠶最適宜的dsRNA長(zhǎng)度。而siRNA同樣也可以達(dá)到基因沉默的效果，但是合成費(fèi)用相對(duì)較高，因此一般都采用dsRNA進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。昆蟲介導(dǎo)方式的選擇，注射法認(rèn)為是效果較好的方法，dsRNA可以注射到昆蟲的任何部位，通常選擇在昆蟲的前胸和腹部，相對(duì)于不同的昆蟲注射的部位，注射的時(shí)期，注射的量會(huì)稍有不同。柞蠶四個(gè)不同時(shí)期通?？梢赃x擇老熟幼蟲和蛹期進(jìn)行注射。對(duì)于柞蠶的研究要進(jìn)行一系列嘗試性試驗(yàn)，弄清時(shí)間、部位、注射劑量的最佳范圍。注射法操作相對(duì)復(fù)雜，需要相關(guān)技術(shù)人員應(yīng)具有一定的試驗(yàn)基礎(chǔ)，飼喂法相對(duì)操作簡(jiǎn)單，一般飼喂法是將合成的dsRNA加入到飼料中，但效率不及注射法。因此需要以量取勝，對(duì)于試驗(yàn)的花費(fèi)相對(duì)會(huì)增加。如果選用飼喂法，對(duì)于飼喂的時(shí)間，飼喂的量，其作用時(shí)間等關(guān)鍵的問(wèn)題的研究同樣需要潛心進(jìn)行嘗試。無(wú)論是注射法還是飼喂法在昆蟲上都有大量的成功案例，可以加以借鑒與引用。RNAi在基因功能，信號(hào)傳導(dǎo)通路，基因表達(dá)調(diào)控等多個(gè)領(lǐng)域都能起到一定的基礎(chǔ)的作用，通過(guò)將特定的基因沉默，結(jié)合基因結(jié)構(gòu)研究了解基因的功能，同時(shí)結(jié)合載體連接、精子介導(dǎo)等技術(shù)完成轉(zhuǎn)基因的一部分實(shí)驗(yàn)，因此RNAi技術(shù)只是一個(gè)基礎(chǔ)的工具，它可以為后續(xù)的試驗(yàn)以及結(jié)果夯實(shí)基礎(chǔ)。

柞蠶的基因研究領(lǐng)域必然要采用這一技術(shù)，且隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)的操作會(huì)越來(lái)越成熟，需要的經(jīng)費(fèi)會(huì)逐漸減少，關(guān)鍵問(wèn)題也會(huì)迎刃而解，今后在柞蠶基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究等多方面肯定會(huì)取得喜人的成績(jī)。

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Research Status of RNA Interference and its Prospect for Tussah Basic Application Research

CHEN Miaomiao,ZHONG Liang,ZHAO Chunshan,WANG Fengcheng，JI Wanjie，ZHANG Bo，LI Xisheng*

(Liaoning Provincial Sericultural Institute, 118100, Fengcheng, Liaoning ,China)

RNA interference has been widely used in the study of insect genes, which is induced by double-stranded RNA and eventually led to the silence of homogenous mRNA.This paper mainly summarized the design of dsRNA, import methods, applications of RNAi both in domestic and overseas, and prospected the application of RNAi in tussah basic research.

RNAi; dsRNA; Antheraea pernyi

諶苗苗(1988—)，女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，從事柞蠶品種資源保護(hù)。

李喜升(1970—)，男，博士，研究員。

* 資助項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-22);遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目