巨大芽孢桿菌的應(yīng)用研究進展

劉 露，李 麗，閆洪雪，張鵬鵬，梁文輝，趙宏濤

（1.海藻活性物質(zhì)國家重點實驗室，山東 青島 266400；2.青島明月藍海生物科技有限公司，山東 青島 266400）

巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium）屬于芽孢桿菌屬[1]，是一種好氧產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性細菌，菌體直徑大于 1.0 μm，俗稱“大芽孢”菌[2]，是一種有益的土壤細菌，具有對環(huán)境友好、對糧食作物安全、對人畜無害等優(yōu)點而受到了人們的普遍關(guān)注和深入研究。自1935年蘇聯(lián)學(xué)者蒙基娜從土壤中分離了一株具有解磷作用的巨大芽孢桿菌并投入生產(chǎn)開始[3]，對巨大芽孢桿菌應(yīng)用的研究已有相當長的一段時間。20世紀50至60年代，為解決土壤中有效磷含量較低的問題，我國開始對巨大芽孢桿菌進行研究，并將其作為解磷菌用于微生物肥料的生產(chǎn)[4]。隨著研究的深入，巨大芽孢桿菌的作用進一步被發(fā)掘，已經(jīng)開始逐漸廣泛地應(yīng)用于解磷固氮、生物防治、畜牧養(yǎng)殖、水體凈化、酶工程等方面[5-7]。本研究對巨大芽孢桿菌的解磷作用、生物防治作用、水體凈化作用和表達外源蛋白作用進行了綜述，為巨大芽孢桿菌的研究和應(yīng)用提供參考。

1 巨大芽孢桿菌的解磷作用

磷是作物的必需營養(yǎng)元素之一，是土壤有效成分的重要組成部分。近些年來，為了提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)，人們不斷向土壤中施用化學(xué)肥料和有機肥來供植物吸收利用，然而作物對當季肥料的利用率只有5%～10%[8]，大部分未被利用的磷積累在土壤中，與土壤中的成分發(fā)生反應(yīng)，成為植物難以利用的形態(tài)，這種被固定在土壤中的磷很難被植物直接吸收利用，被稱為無效態(tài)磷[9]，而可以被植物吸收利用的有效態(tài)磷僅占土壤全磷量的2%～3%[10]，而為了保障植物生長，人們繼續(xù)使用化學(xué)肥料和有機肥來確保土壤中可利用的磷的含量，長此以往造成了大量不可再生資源的浪費，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降，更為嚴重的是導(dǎo)致了土地資源利用不合理、土壤環(huán)境污染情況加重等問題。為解決這些問題，人們開始從其他方面尋求解決辦法。科學(xué)研究表明，微生物對于土壤中的物質(zhì)循環(huán)利用有著重要作用，磷素循環(huán)也不例外。國內(nèi)外的一些研究證明，土壤中存在許多微生物，能夠?qū)⒐潭ㄔ谕寥乐校参镫y以吸收利用的無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為有效態(tài)磷[11]，巨大芽孢桿菌便是這些微生物中的一種。

1.1 巨大芽孢桿菌的解磷效果驗證

陳凱等[12]研究了巨大芽孢桿菌P1的解磷效果，巨大芽孢桿菌P1在蛋黃培養(yǎng)基上溶磷圈明顯，具有解有機磷的作用。張維娜等[13]研究了巨大芽孢桿菌JD-2的溶磷效果，發(fā)現(xiàn)JD-2具有較強降解有機磷、無機磷的能力，發(fā)酵液接入土壤后，能達到比較好的解磷效果。研究解磷機理發(fā)現(xiàn)解磷作用是由菌株生長過程中的代謝產(chǎn)物決定的，代謝產(chǎn)物包括有機酸、質(zhì)子和多糖等，其中有機酸[14]通過羥基和羧基對不溶性磷酸鹽進行螯合使其溶解，質(zhì)子[15]通過降低周圍的pH來溶解不溶性磷酸鹽，多糖[16]通過與有機酸的協(xié)同效應(yīng)來推動不溶性磷酸鹽的溶解。

1.2 巨大芽孢桿菌的發(fā)酵優(yōu)化

關(guān)于提高巨大芽孢桿菌發(fā)酵活菌數(shù)的相關(guān)報道，李麗等[17]采用單因素試驗和正交試驗提高巨大芽孢桿菌M03發(fā)酵活菌數(shù)，菌數(shù)較初始培養(yǎng)基提高了8.08倍。王繼雯等[18]研究了使巨大芽孢桿菌C2產(chǎn)芽孢的發(fā)酵配方，采用麩皮和豆粕為主要原料，即降低了生產(chǎn)成本又使芽孢形成率可達到100%，為菌株在復(fù)合生物肥料中的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。饒犇等[19]應(yīng)用Plackett-Burman設(shè)計法和響應(yīng)面分析法（RSM）對影響芽孢數(shù)的配方進行了優(yōu)化，發(fā)酵活芽孢數(shù)提高至42億個/mL。

1.3 巨大芽孢桿菌在微生物肥料的應(yīng)用

在農(nóng)業(yè)部微生物肥料和食用菌菌種質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心辦理解磷菌登記證的菌種多為巨大芽孢桿菌，有巨大芽孢桿菌單獨使用和與枯草芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌等混合使用多種方式。產(chǎn)品形態(tài)有液體、粉劑和顆粒三種。目前正式登記巨大芽孢桿菌192種，臨時登記36種。登記證中液體菌劑活菌數(shù)一般為2.0億～5.0億個/mL，粉劑和顆粒活菌數(shù)為0.2億個/g、1億個/g～2億個/g。

1.4 巨大芽孢桿菌對農(nóng)作物影響

巨大芽孢桿菌可以提高作物的產(chǎn)量。柳艷艷等[20]研究了不同濃度的巨大芽孢桿菌BM002微生物菌劑對油菜的促生作用，0.1 g/kg濃度對提高油菜產(chǎn)量和促進根系生產(chǎn)有顯著作用。?；燮嫉萚21]從小麥根際分離了固氮菌、解磷菌和解鉀菌并研究了相互間的作用，解磷菌能促進固氮菌和解鉀菌的生長繁殖，3種菌混合使用可促進小麥的生長發(fā)育并提高產(chǎn)量。

2 巨大芽孢桿菌的其他應(yīng)用研究

2.1 巨大芽孢桿菌的生物防治作用

芽孢桿菌是植物病害生物防治的主要生防細菌，在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生拮抗性或競爭性的代謝產(chǎn)物，可抑制病原菌生長或殺死病原菌。最常用的生防芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。近年來關(guān)于巨大芽孢桿菌生防作用的研究較多，秦健[22]研究了巨大芽孢桿菌B196的抑菌作用，巨大芽孢桿菌B196可以抑制水稻紋枯病菌、水稻細菌性條斑病菌、水稻白葉枯病、番茄青枯病菌、煙草赤星病菌、煙草灰霉病菌、玉米白絹病菌和西瓜枯萎病菌等病原菌的生長。孔青[23]研究了海洋巨大芽孢桿菌抑制黃曲霉的生長，并能抑制在花生上黃曲霉毒素的生物合成，其機理為通過競爭性生長和產(chǎn)生某種次級代謝產(chǎn)物，抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素合成基因的表達。

巨大芽孢桿菌的生防作用應(yīng)用到農(nóng)業(yè)中，可以減少農(nóng)藥的使用，降低農(nóng)資成本，并可以間接地降低農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留，具有非常重要的意義。

2.2 巨大芽孢桿菌的水體凈化作用

目前對巨大芽孢桿菌的研究逐漸從傳統(tǒng)的菌種篩選、發(fā)酵條件優(yōu)化和生理生化功能到特殊功能的研究，如巨大芽孢桿菌具有水體凈化的作用。關(guān)于巨大芽孢桿菌的水體凈化的研究主要集中在對水體有機物與磷的降解、修復(fù)水體富營養(yǎng)化以及在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。王琳等[7]采用投菌法對富營養(yǎng)化景觀水體的試驗研究，巨大芽孢桿菌對富營養(yǎng)化水體中的總氮（TN）、總磷（TP）和 CODcr均有一定的去除效果。侯穎等[24]從養(yǎng)魚池水中分離篩選到一株具有氨氮降解作用的巨大芽孢桿菌，菌株在24 h內(nèi)的氨氮降解率＞95%，并具有硝酸還原和亞硝酸還原能力，可作為益生菌應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有望解決養(yǎng)殖水體中的氨氮污染問題。利用巨大芽孢桿菌凈化水體，可以避免利用化學(xué)制劑引起的二次污染問題，且成本較低，具有非常重要的意義。

2.3 巨大芽孢桿菌表達外源蛋白作用

與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達系統(tǒng)相比，巨大芽孢桿菌體積是大腸桿菌的100倍以上，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)內(nèi)毒素且蛋白分泌能力遠遠高于大腸桿菌；與其他芽孢桿菌表達系統(tǒng)相比，巨大芽孢桿菌不產(chǎn)生堿性蛋白酶，表達的外源蛋白不會被降解，且重組質(zhì)粒在巨大芽孢桿菌中能穩(wěn)定存在，不易丟失[25]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)和學(xué)術(shù)研究。巨大芽孢桿菌具有表達率高、遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)物可分泌和發(fā)酵工藝成熟的優(yōu)點。另外，巨大芽孢桿菌的細胞壁只含有肽聚糖和磷壁質(zhì)，成分簡單，在分泌的蛋白質(zhì)產(chǎn)品中不會混雜有內(nèi)毒素，且蛋白跨越細胞膜后，直接或加工后分泌到培養(yǎng)基中以活性結(jié)構(gòu)存在而不發(fā)生聚集，不需要再對蛋白質(zhì)進行復(fù)性[26]，因此巨大芽孢桿菌適用于工業(yè)大規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

巨大芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌，其轉(zhuǎn)化方法與革蘭氏陰性細菌不同。一般有原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。巨大芽孢桿菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是由PEG-6000介導(dǎo)的。巨大芽孢桿菌在溶菌酶的作用下轉(zhuǎn)化為原生質(zhì)體，構(gòu)建好的攜帶外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進巨大芽孢桿菌中，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法比較復(fù)雜。電擊轉(zhuǎn)化法簡單快速且轉(zhuǎn)化效率高，可有效地將DNA轉(zhuǎn)入巨大芽孢桿菌中，是巨大芽孢桿菌最常用的轉(zhuǎn)化方法。

2.4 巨大芽孢桿菌降解泡葉藻的作用

巨大芽孢桿菌除了具有解磷作用、生物防治作用、水體凈化作用、和表達外源蛋白作用外，還有一些作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。劉露等[27]篩選并鑒定了一株巨大芽孢桿菌2-2具有降解泡葉藻的作用，巨大芽孢桿菌2-2同時具有海藻膠裂解酶、蛋白酶和纖維素酶活性，將構(gòu)成海藻的大分子物質(zhì)降解成小分子、水溶性的物質(zhì)，最大限度完整地保留了海藻中的生物活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，有望取代傳統(tǒng)的物理法和化學(xué)法，采用生物法進行海藻降解。

羅巖等[28]研究了巨大芽孢桿菌具有菌產(chǎn)亞硝酸還原酶的作用，并使菌株發(fā)酵產(chǎn)生的亞硝酸還原酶的活性由原始反應(yīng)體系測得的221.015 U/mL增加至405.434 U/mL，巨大芽孢桿菌產(chǎn)亞硝酸還原酶可以降低腌制食品中亞硝酸鹽含量，使亞硝酸鹽的殘留量控制在較低的水平，減少對人體的損壞。

2.5 巨大芽孢桿菌轉(zhuǎn)化西羅莫司的作用

巨大芽孢桿菌具有轉(zhuǎn)化的作用，近年來關(guān)于微生物轉(zhuǎn)化的研究較多，微生物轉(zhuǎn)化是對化合物進行結(jié)構(gòu)修飾的一條有效途徑，針對結(jié)構(gòu)復(fù)雜的化合物，產(chǎn)生化學(xué)半合成難以獲得的新化合物。黃捷等[29]以西羅莫司（又名雷帕霉素，具有免疫抑制、抗真菌、抗增殖和抗腫瘤的作用）為底物篩選出一株巨大芽孢桿菌，具有轉(zhuǎn)化西羅莫司的作用，獲得新的西羅莫司衍生物287-P1、287-P2和287-P3。其中，287-P1經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定為29，42-O-雙去甲基雷帕霉素。

3 展望

磷作為植物生長所必需的元素，如何高效地利用土壤中的磷是今后研究重點，對發(fā)展可持續(xù)高效農(nóng)業(yè)具有重要的戰(zhàn)略意義。研究表明，無芽孢解磷細菌的解磷能力＞巨大芽孢桿菌＞蠟樣芽孢桿菌，但是該菌不產(chǎn)芽孢，作為產(chǎn)品不易保存，可利用價值不高，綜合考慮巨大芽孢桿菌更適合作為解磷菌來應(yīng)用于微生物肥料生產(chǎn)。

目前微生物肥料所用菌多為單一菌株，無法同時解決多種問題，因此可以進一步探討巨大芽孢桿菌和其他功能性菌株如根瘤菌、纖維素降解菌等的作用，采用混合菌種協(xié)同固定化技術(shù)[30]，研制復(fù)合微生物菌劑，達到充分利用土壤中各種營養(yǎng)物質(zhì)、改善土壤環(huán)境、防治土傳病害的目的。

雖然巨大芽孢桿菌擁有巨大的研究潛力，但芽孢菌的遺傳穩(wěn)定性差的缺點不容忽視，針對這些問題，可以通過轉(zhuǎn)基因或者分子細胞雜交的方式篩選培養(yǎng)出高效，適應(yīng)性強，比較穩(wěn)定的菌株。還可以根據(jù)不同的土壤條件篩選馴化出適合特定土壤和作物的菌株。

通過近100年的研究，對巨大芽孢桿菌的研究比較成熟，除了在微生物肥料方面的應(yīng)用以外，其他方面的應(yīng)用也逐漸被發(fā)現(xiàn)。巨大芽孢桿菌不僅具有解磷作用，還具有生物防治作用、富營養(yǎng)水體凈化作用和表達外源蛋白作用等，另外一些新的功能也逐漸被發(fā)現(xiàn)，可以更好地應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、畜禽養(yǎng)殖、水體凈化和生物制藥等方面，并且巨大芽孢桿菌分布廣泛，對環(huán)境友好，人畜無害。對巨大芽孢桿菌的研究具有非常重要的意義，應(yīng)用前景廣闊。

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