缺血性腦損傷神經(jīng)細胞凋亡及其相關基因的表達*

曹麗霞，楊玉梅

(包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦損傷神經(jīng)細胞凋亡及其相關基因的表達*

曹麗霞，楊玉梅

(包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭014060)

缺血性腦損傷后神經(jīng)元的死亡包括凋亡和壞死，近年來，缺血性腦損傷的研究中主要集中在缺血后的細胞凋亡過程。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指在某些生理或病理刺激誘導下，機體為維護內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，通過多種調(diào)控因子相互激活和表達，激活DNA內(nèi)切酶，從而使細胞正常死亡的過程。細胞凋亡主要發(fā)生在缺血周圍區(qū)，是一種涉及多種基因及其蛋白相互作用的自主死亡的過程。因此，對腦缺血后神經(jīng)元損傷的作用靶點和作用機制進行系統(tǒng)深入的研究具有重要意義。

1 細胞凋亡通路

1.1 Caspase依賴性凋亡通路

1.1.1 內(nèi)源性線粒體通路 缺血性腦損傷后，由于線粒體通透性轉位孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)在各種凋亡誘導因素刺激下不可逆地過度開放，導致細胞色素C、絲氨酸蛋白酶(high temperature requirement protein A2，HtrA2)、第二線粒體衍生的天冬氨酸蛋白水解酶激活劑(second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)等從線粒體膜間隙釋放至胞漿內(nèi)［1］。細胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)結合形成凋亡小體，活化Procaspase-9，導致Caspase-3激活，介導細胞凋亡［2］;此外，當神經(jīng)細胞發(fā)生凋亡時，SmacDIABLO能通過和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)結合抑制活化的Caspase-9，促進Caspase-3的激活，引起細胞凋亡［3］。

1.1.2 外源性死亡受體通路 死亡受體(death receptor，DR)屬于腫瘤壞死因子受體超家族中的一個亞家族。Fas、TNFR1、DR3、DR4是目前研究比較清楚的死亡受體。由Fas-Fas-L和TNFR為代表介導的細胞凋亡通路研究最多。

腦缺血后神經(jīng)細胞受到缺血等一系列刺激后，細胞表面的Fas配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)、TNF配體(tumor necrosis factor α，TNFα)分別與相應的受體(FasR，TNFR1)結合，使受體相互交聯(lián)形成三聚體并激活，通過死亡效應域(death effect domain，DED)結合Fas相關死亡域蛋白(Fas -associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和 Procaspase-8形成死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex，DISC)，該死亡誘導信號復合物導致Caspase-8被活化，激活的Caspase-8啟動蛋白酶級聯(lián)反應，從而活化下游的效應酶Caspase，誘導Fas介導的細胞凋亡［4］。

1.2 Caspase非依賴性凋亡通路 腦缺血后，DNA發(fā)生損傷，大量表達多聚ADP核糖聚合酶-1(poly ADP-ribose polymerase-1，PARP-1)，PARP-1催化生成多聚ADP核糖(Poly ADP-ribose，PAR)，PAR進入線粒體使線粒體釋放凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor，AIF)并轉位進入核內(nèi)，導致染色質濃縮和DNA降解，形成PARP-1過度表達的惡性循環(huán);當細胞接受凋亡信號刺激后，Bcl 2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/ adenovirus E1B 19 kDa-interacting protein 3，BNIP 3)同源二聚體和線粒體外膜結合，使MPTP開放，導致線粒體內(nèi)的核酸內(nèi)切酶G(endonuclease G，EndoG)被釋放并轉移至核內(nèi)。同時，在細胞核內(nèi)AIF和Endo G相互作用，導致DNA斷裂和染色質凝聚，從而導致不依賴Caspase的細胞凋亡［5］。總之，這 3條信號轉導通路都是通過caspase-3完成最終的激活。其中線粒體介導的細胞凋亡通路作為經(jīng)典的凋亡通路，近年來受到人們的廣泛關注。

2 細胞凋亡相關基因的表達

細胞凋亡受多種基因調(diào)控，包括Bcl-2家族基因、Caspase-3基因、p53基因、Fas基因、熱休克蛋白(heat stock protein，HSP)基因、即早基因(immediate-early genes，IEGs)等［6］。

2.1 Bcl－2基因家族在缺血性腦損傷中的表達

2.1.1 Bcl-2在缺血性腦損傷中的表達 B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2)是從濾泡性淋巴瘤中分離出來的細胞凋亡信號轉導通路中最重要的凋亡抑制基因。凋亡抑制基因Bcl-2高表達能抑制MPTP的開放，阻止細胞色素C及促凋亡相關蛋白釋放到線粒體膜外，從而抑制caspase-3的激活，導致各種因素誘導的細胞凋亡。Bcl-2還能通過抑制氧自由基結合Bax蛋白，從而抑制細胞凋亡。

崔芳琴等［7］通過建立腦缺血再灌注模型，觀察不同缺血時間的小鼠腦組織免疫組織化學染色切片，證實了在腦缺血早期受損神經(jīng)元內(nèi)，Bcl-2表達上調(diào)。但是隨著缺血時間進一步延長，Bcl-2表達進一步減少，為臨床上使用Bcl-2激動劑治療腦缺血提供依據(jù)。

2.1.2 Bax在缺血性腦損傷中的表達 Bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡基因，正常情況下，胞質中的Bax以單體形式存在。在凋亡信號誘導下，胞質中的Bax以無活性的單體形式轉移至線粒體，與線粒體膜結合使其構型發(fā)生改變，形成異源二聚體復合物，使線粒體通透性發(fā)生改變，開放線粒體通透轉換孔，釋放凋亡因子如細胞色素C等，細胞色素C與AIF及procaspase-9結合形成“凋亡小體”，從而啟動細胞凋亡級聯(lián)反應［8］。

高紅莉等［9］通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，研究血府逐瘀湯對腦缺血再灌注大鼠皮質神經(jīng)細胞凋亡的影響。結果顯示，模型組與假手術組比較，大鼠腦組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達顯著增加，血府逐瘀湯大、中、小劑量給藥組大鼠腦組織中Bax、Caspase-3 mRNA的表達量較模型組明顯降低，而Bcl-2 mRNA表達較模型組明顯升高。提示血府逐瘀湯可能通過下調(diào)神經(jīng)細胞Bax、Caspase-3 mRNA的表達，上調(diào)Bcl-2 mRNA的表達，抑制細胞凋亡。

2.2 Caspase在缺血性腦損傷中的表達 Caspase-3是細胞凋亡信號通路中最關鍵的效應酶，在神經(jīng)細胞凋亡級聯(lián)反應中處于核心位置。各種因素引起的細胞凋亡都是通過 caspase-3完成最終激活的。在正常細胞中Caspase-3合成后以酶原和無活性的形式存在，當細胞發(fā)生凋亡時，激活的Caspase-3可以使一系列NF-κB、結構蛋白及多聚ADP核糖聚合酶活化，形成凋亡小體和DNA片段化，從而介導細胞凋亡。

有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注模型組 Caspase-3 mRNA表達明顯高于假手術組，凋亡細胞顯著增多;與模型組比較，天麻素大、中、小劑量組和尼莫地平組Caspase -3 mRNA表達明顯降低，提示天麻素可通過下調(diào)Caspase-3 mRNA的表達，抑制神經(jīng)細胞凋亡，從而有效地保護腦缺血。張曼等［10］研究結果顯示，缺血再灌注模型組Caspase-3蛋白表達較假手術組顯著增加;菟絲子黃酮50mg/kg、l00mg/kg劑量組和尼莫地平組Caspase-3蛋白的表達較缺血再灌注模型組顯著減少。提示菟絲子黃酮可以通過下調(diào)Caspase-3蛋白的表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。

2.3 p53在缺血性腦損傷中的表達 p53是一種與腫瘤密切相關的抑癌基因，包括野生型p53和突變型p53。野生型p53是促凋亡基因，它可以直接導致細胞凋亡，也可以通過激活一系列下游基因間接導致細胞凋亡。當細胞發(fā)生凋亡時，p53能通過上調(diào)促凋亡基因，下調(diào)抗凋亡基因，在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用。

許妍妍等［11］發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注后2 h，p53表達的陽性細胞數(shù)微量增多，3 h后略有增多，6 h后顯著增多，并持續(xù)增多至12 h。RT-PCR結果顯示，假手術組中p53 mRNA僅有微量表達，在缺血2～3 h大鼠腦組織中p53 mRNA僅有微量表達，6 h表達顯著增多，并持續(xù)增多至12 h。

2.4 IEGs在缺血性腦損傷中的表達 即早基因(immediate-early genes，IEGs)是一類對外界刺激信號傳入數(shù)分鐘內(nèi)即刻作出反應進行表達的基因。在正常情況下，c -fos低水平表達。當細胞發(fā)生凋亡時，F(xiàn)os蛋白由胞質轉入細胞核內(nèi)，通過和Jun蛋白相互作用形成異源二聚體轉錄因子復合物(activator protein 1，AP-l)，使其與DNA結合位點特異性結合，從而調(diào)控靶基因快速而短暫的表達［12］。

陳江君等［13］通過觀察不同缺血時間的大鼠腦組織免疫組織化學染色切片發(fā)現(xiàn)，假手術組陽性細胞數(shù)僅有微量表達;模型組海馬CA1區(qū)c-fos陽性細胞數(shù)在缺血灌注3 h表達顯著增加，48 h達高峰，72 h仍有表達;紅景天干預組c-fos陽性細胞數(shù)較同時相模型組比較明顯降低。

2.5 Fas在缺血性腦損傷中的表達 Fas是重要的促調(diào)亡基因。一方面，F(xiàn)asL與Fas兩者結合，使Fas死亡區(qū)交聯(lián)，產(chǎn)生神經(jīng)酰胺，通過某種途徑，激活內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，引起凋亡。另一方面，F(xiàn)asL與FasR結合，使受體相互交聯(lián)形成三聚體并激活，通過DED結合Fas相關死亡域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和Procaspase-8形成死亡誘導信號復合物，該死亡誘導信號復合物導致Caspase-8被活化，從而活化下游的效應酶Caspase，誘導Fas介導細胞凋亡。

實驗發(fā)現(xiàn)川芎嗪可通過下調(diào)腦缺血再灌注誘導的Fas-L蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。通過觀察不同缺血時相大鼠腦組織免疫組織化學染色切片發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組大鼠腦組織神經(jīng)細胞凋亡數(shù)目及Fas蛋白陽性細胞數(shù)目較假手術組顯著增多;Fas蛋白陽性細胞數(shù)目在缺血再灌注后6 h達高峰，24 h開始下降，細胞凋亡數(shù)目在缺血再灌注6 h顯著增加，24 h達高峰，36 h略有下降［14］。

2.6 HSP在缺血性腦損傷中的表達 熱休克蛋白(heat stock protein，HSP)是一組進化上高度保守的細胞內(nèi)可溶性蛋白。HSP70在腦缺血損傷研究中備受關注。正常情況下，HSP70 mRNA在腦內(nèi)表達穩(wěn)定，但很快被降解;應激狀態(tài)下，其他蛋白合成受到抑制，HSP70表達反而增強，敲除HSP基因后，HSP表達下降，細胞凋亡增多。

研究發(fā)現(xiàn)，模型組與假手術組比較，大鼠腦組織中HSP70 mRNA及其蛋白表達明顯增多，通心絡治療組HSP70 mRNA表達較模型組顯著增多。提示通心絡可以促進應激保護性蛋白 HSP70表達，從而抑制細胞凋亡［15］。

綜上所述，腦組織缺血缺氧后會引發(fā)一系列的病理改變，其中有關缺血所引發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡在近些年來的研究中備受關注。腦缺血后的神經(jīng)細胞凋亡是一個復雜的瀑布式級聯(lián)反應，這些凋亡調(diào)控因子之間相互協(xié)同或相互制約，共同構成一種復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)共同完成對細胞凋亡的調(diào)控。然而細胞凋亡所涉及的傳導通路和分子機制尚不清楚，因此，對這些凋亡調(diào)控因子進行系統(tǒng)深入的研究，將利于我們進一步探索神經(jīng)元損傷的作用靶點和作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。

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2015-11-10)

國家自然科學基金(81160560)

楊玉梅