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    結(jié)核病DNA疫苗研究進(jìn)展

    2016-12-17 08:36:00薛玉芹
    關(guān)鍵詞:綜述結(jié)核病

    薛玉芹,方 強(qiáng)

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    結(jié)核病DNA疫苗研究進(jìn)展

    薛玉芹,方強(qiáng)

    [關(guān)鍵詞]結(jié)核??;DNA疫苗;綜述

    結(jié)核病(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mtb)引起的以呼吸道為主的一種傳染性疾病,嚴(yán)重危害人類健康。隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人類對(duì)抗TB已取得了一定的成果,包括有效的治療藥物及疫苗的研發(fā)。但同時(shí)由于Mtb耐藥的嚴(yán)重性、人類免疫缺陷性病毒(HIV)與Mtb的雙重感染及流動(dòng)人口的日益增多、吸毒等,加上不少國(guó)家對(duì)TB的忽視,TB在全球范圍內(nèi)呈回升趨勢(shì)。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2012年全球結(jié)核病控制報(bào)告》[1]指出,雖然目前死于TB的人和患病的人都呈下降趨勢(shì),但每年仍有數(shù)百萬TB新發(fā)病例,2011年全球新增TB患者870萬人,死于TB的人數(shù)為140萬人,其中新增TB患者中有3.7%患有耐多藥TB,全球TB負(fù)擔(dān)仍然十分嚴(yán)重。

    至今,卡介苗(BCG)仍是被批準(zhǔn)使用的預(yù)防TB的唯一疫苗,其保護(hù)力不穩(wěn)定,差異大,究其原因可能受BCG菌株差異、感染Mtb菌株的差異性、Mtb的內(nèi)源性復(fù)燃和外源性再感染以及接種人群和臨床試驗(yàn)方法的差異性等的影響[2]。隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,新型的TB疫苗已得到廣泛研究,如活疫苗、亞單位疫苗(DNA疫苗、重組蛋白疫苗等)和滅活疫苗等,其中DNA疫苗以其安全、經(jīng)濟(jì)、有效等優(yōu)點(diǎn),成為近年來TB疫苗研究的熱點(diǎn)之一,本文就TB DNA疫苗的研究進(jìn)展作一綜述。

    1DNA疫苗的概念及免疫機(jī)制

    1.1DNA疫苗的概念DNA疫苗是指把能引起機(jī)體保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原體抗原編碼的外源基因和真核表達(dá)載體連接,通過某種方法導(dǎo)入機(jī)體,通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯合成抗原蛋白,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生對(duì)該抗原的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng),以達(dá)到預(yù)防和/或治療疾病的目的。WOLFF等[3]研究發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼肌細(xì)胞能捕獲不加任何處理的外源基因并在一定時(shí)間內(nèi)表達(dá),并能誘發(fā)小鼠產(chǎn)生相應(yīng)的細(xì)胞與體液免疫反應(yīng),從而開辟了核酸疫苗學(xué)的新天地。DNA疫苗按其應(yīng)用目的可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。

    1.2DNA疫苗的免疫機(jī)制目前認(rèn)為,TB DNA疫苗被直接導(dǎo)入宿主體內(nèi)后,在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Mtb蛋白抗原,加工形成多肽抗原,與宿主細(xì)胞MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子結(jié)合,遞呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng),引起特異性細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,特別是細(xì)胞毒體細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。組織細(xì)胞攝入質(zhì)粒DNA后,在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯成抗原蛋白分子。一部分內(nèi)源性抗原蛋白結(jié)合到泛肽上,被蛋白酶降解為多肽,通過肽轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng),形成多肽-MHC-Ⅰ類分子聚合物,最后到達(dá)細(xì)胞膜表面,借助TCR受體被CD8+細(xì)胞識(shí)別,誘發(fā)CD8+CTL T細(xì)胞應(yīng)答;同時(shí),部分抗原從抗原提呈細(xì)胞(APC)的細(xì)胞膜進(jìn)入,通過MHC-Ⅱ遞呈途徑,被APC溶酶體降解為多肽,最后形成成熟的MHC異聚體,在細(xì)胞膜表面,被CD4+T細(xì)胞識(shí)別,引起細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。其中,還有一部分抗原多肽遞呈給B細(xì)胞,激活B細(xì)胞,部分轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞,產(chǎn)生特異性抗體,引發(fā)體液免疫[4-6]。

    2TB DNA疫苗的種類

    2.1TB預(yù)防性DNA疫苗疫苗的最初目的是為了預(yù)防疾病的發(fā)生,DNA疫苗也是如此。TB DNA疫苗的研究目的也是由于BCG保護(hù)力不穩(wěn)定,而作為第二代疫苗的重組蛋白亞單位疫苗誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱,對(duì)TB的預(yù)防并不理想,需要研發(fā)能夠全面誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫的新型疫苗來預(yù)防TB的發(fā)生。近年來,隨著對(duì)結(jié)核菌致病機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入,預(yù)防性DNA疫苗的研制目標(biāo)不僅限于針對(duì)正常人群抗結(jié)核桿菌感染的預(yù)防,更重要的是要研發(fā)針對(duì)潛伏期感染的疫苗,達(dá)到抑制、清除潛伏感染的細(xì)菌,防止TB復(fù)發(fā)也是其重要的目標(biāo)[7]。目前,已有多種TB預(yù)防性DNA疫苗在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得了較理想的效果。

    2.2TB治療性DNA疫苗由于化療藥的不良反應(yīng)和耐多藥結(jié)核菌株的流行等,TB的免疫治療引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。治療性疫苗是指接種于已感染病原體的個(gè)體,發(fā)揮主動(dòng)免疫,成為近年來控制傳染性疾病的新方向[8]。 TB治療性疫苗的目的是誘導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),殺死細(xì)胞內(nèi)寄生的Mtb,DNA疫苗在細(xì)胞內(nèi)生成內(nèi)生性抗原,不僅能誘導(dǎo)體液免疫和TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答,還能誘導(dǎo)特異性的CTL應(yīng)答,能將低效的抑菌反應(yīng)轉(zhuǎn)換成高效的殺菌作用。日本科學(xué)家[9]將白細(xì)胞介素(IL)-6相關(guān)基因連接到腺病毒載體,構(gòu)建IL-6相關(guān)DNA疫苗,采用該疫苗治療小鼠后,發(fā)現(xiàn)其肺部Mtb數(shù)目明顯低于BCG東京株,且能激發(fā)CTL活性,具有顯著的治療效果。目前在TB疫苗研制中備受關(guān)注的Ag85分泌性抗原,梁艷等[10-11]證明Ag85A、Ag85A/ESAT6嵌合型DNA疫苗與藥物聯(lián)合使用能顯著提高藥物對(duì)耐藥Mtb感染的治療效果。其中,Mtb早期表達(dá)的蛋白,適應(yīng)宿主體內(nèi)的免疫環(huán)境,成為免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)蛋白,因此在潛伏感染期首次表達(dá)的蛋白(休眠期蛋白)是治療性疫苗表達(dá)的重要抗原,但目前研究甚少,主要包括休眠相關(guān)基因熱休克蛋白(HSP)X、休眠相關(guān)蛋白(Dormancy-related,DosR)等。有研究[12-13]證明,HSP65與IL-12編碼基因融合表達(dá)構(gòu)建的DNA疫苗,在治療TB小鼠的實(shí)驗(yàn)中,能顯著提高TH1細(xì)胞免疫反應(yīng),減少M(fèi)tb的數(shù)目。

    3結(jié)核DNA疫苗研究的主要疫苗候選基因

    3.1DosR編碼基因DosR是由Rv3407基因編碼,是Mtb從潛伏期轉(zhuǎn)化到再活化狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生的特異性蛋白,對(duì)潛伏期人群有明顯的保護(hù)作用[14],是治療性疫苗的重要抗原。有研究[15-17]發(fā)現(xiàn),Rv3407能誘導(dǎo)Mtb潛伏期的特異性記憶T細(xì)胞分泌干擾素(IFN),構(gòu)建的 PVAX1-Rv3407 DNA 疫苗,通過宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)表達(dá)蛋白抗原,能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,對(duì)Mtb的潛伏期感染狀態(tài),產(chǎn)生高效的T細(xì)胞免疫。研究[18]報(bào)道,Mtb休眠期抗原Rv2660c和Ag85B、ESAT6融合制備的疫苗具備有效預(yù)防潛伏期感染結(jié)核菌的復(fù)活。

    3.2HSP編碼基因HSP又稱“分子伴侶”,屬于胞質(zhì)蛋白,是被免疫系統(tǒng)識(shí)別的重要抗原,其編碼基因是研究最早的DNA疫苗候選分子之一,近年來被用來研究DNA疫苗的主要是HSP65、HSP70編碼基因。二者質(zhì)粒DNA疫苗既可用作預(yù)防性疫苗又可作為治療性疫苗。ANDEREN等[19-20]構(gòu)建了HSP65與人IL-2融合基因的DNA疫苗,研究發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ和IL-2和特異性的IgG2a抗體,在用于治療TB小鼠模型時(shí),能明顯降低Mtb的數(shù)目,提高TH1型細(xì)胞免疫反應(yīng)。胡方靖等[21]構(gòu)建pIHsp65GM真核表達(dá)質(zhì)粒并研究其DNA疫苗的免疫原性和對(duì)感染Mtb小鼠的免疫保護(hù)效果,研究表明,pIHsp65GM DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性的IgG,脾淋巴細(xì)胞增殖和分泌IFN-γ,且脾、肺載菌量均低于對(duì)照組。HSP70具有基因佐劑作用,有多個(gè)T細(xì)胞和B細(xì)胞表位,免疫原性比Hsp65更強(qiáng),可誘發(fā)特異性Th1反應(yīng)。LOWRIE等[22]研究發(fā)現(xiàn),用HSP-70 DNA疫苗治療感染Mtb的小鼠,其HSP-70DNA疫苗可誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生和特異性的CTL活性,小鼠脾、肺菌落數(shù)顯著低于對(duì)照組。史小玲等[23]把Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗接種于用H37Rv強(qiáng)毒株攻擊后的小鼠,研究表明該疫苗具有良好的免疫治療作用。

    3.3Ag85復(fù)合物編碼基因Ag85復(fù)合物是Mtb和BCG主要的分泌性蛋白,由Ag85A、Ag85B、Ag85C三個(gè)組分構(gòu)成。在Ag85編碼基因構(gòu)建的DNA疫苗中,Ag85A和Ag85B效果為佳,Ag85C基因重組的DNA疫苗效果不及Ag85A和Ag85B[24]。Ag85A和Ag85B含有數(shù)個(gè)T細(xì)胞抗原決定簇,可誘導(dǎo)感染鼠產(chǎn)生Ⅳ型超敏反應(yīng)(DTH)和保護(hù)性免疫。HA等[25]將Ag85A DNA疫苗及IL-12用于感染TB小鼠的治療,發(fā)現(xiàn)該疫苗和藥物聯(lián)合治療能顯著減少小鼠TB的復(fù)發(fā)。此外,國(guó)內(nèi)研制的Ag85A DNA疫苗,正在進(jìn)行中試工藝研究中[26]。

    3.4MPT64編碼基因MPT64編碼基因位于RD2區(qū),在某些BCG菌株缺失,編碼的分泌性MPT64蛋白是重要的T細(xì)胞抗原和B細(xì)胞抗原,能誘導(dǎo)Mtb感染的豚鼠發(fā)生很強(qiáng)的DTH反應(yīng)。KAMATH等[27]首次將MTP64 DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射免疫小鼠,在間隔免疫過程中血清特異性抗體滴度逐漸升高,可誘導(dǎo)脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ和特異性的CTL活性。梁艷等[11,28]比較Mtb MPT64、ESAT6、Ag85A和Ag85B 4種DNA疫苗的免疫原性發(fā)現(xiàn),4組DNA疫苗肌內(nèi)注射后均可在體內(nèi)表達(dá),MPT64DNA疫苗誘導(dǎo)的抗體水平最高。但與IL-12或IFN-γ質(zhì)粒DNA同時(shí)免疫時(shí),抗體水平無明顯增加,證明MPT64DNA疫苗與細(xì)胞因子共刺激后,細(xì)胞因子可降低小鼠對(duì)其疫苗的抗原特異性抗體反應(yīng),而轉(zhuǎn)為以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫為主。

    3.5PstS編碼基因Mtb磷酸鹽特異轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(phosphate-specific transport system,PstS)包括3個(gè)磷酸鹽結(jié)合蛋白,分別稱為PstS-1(也稱為蛋白抗原b)、PstS-2、PstS-3,PstS 基因所構(gòu)建的DAN疫苗免疫小鼠后可產(chǎn)生特異性的抗體和誘導(dǎo)TH1型細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生IL-12及IFN-γ等,其中PstS-1 DNA疫苗免疫不能激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答,PstS-3 DNA免疫可產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答,接受H37Rv強(qiáng)毒株攻擊后,脾、肺菌數(shù)量明顯減少,PstS-2 DNA免疫產(chǎn)生的免疫水平介于中間[29]。

    3.6RD1區(qū)優(yōu)勢(shì)抗原ESAT6、CFP10編碼基因BCG缺失的RD1區(qū),僅存在于致病性分枝桿菌和一些非典型分枝桿菌。RD1區(qū)同一操縱子的ORFs Rv3875和Rv3874分別編碼的ESAT6和CFP10,是RD1區(qū)核心抗原,可誘導(dǎo)T細(xì)胞,PBMC、NK及TB患者PBMCs產(chǎn)生強(qiáng)烈的IFN-γ[30],具有良好的抗原性,而全部BCG都缺失這兩種蛋白,使其成為當(dāng)今TB疫苗研制的熱點(diǎn)候選分子。有研究[31-32]表明,ESAT6和CFP10可使感染Mtb的小鼠體內(nèi)記憶效應(yīng)T細(xì)胞增殖及在感染早期即可產(chǎn)生高水平的IFN-γ。張海等[33]構(gòu)建的Mtb ESAT6-CFP10融合DNA疫苗免疫小鼠后,能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生的IFN-γ與對(duì)照組BCG相比無明顯差異,可產(chǎn)生較好的免疫效果。WANG等[34]將泛素和ESAT6基因融合,研究發(fā)現(xiàn),該DNA疫苗顯著增加了細(xì)胞免疫應(yīng)答,提供了較好的保護(hù)作用。

    4提高TB DNA疫苗免疫效力的策略

    眾多研究表明,TB DNA疫苗免疫效力不高,單一Mtb抗原的DNA疫苗的保護(hù)效果一般不及BCG,嚴(yán)重制約著DNA疫苗的發(fā)展。增強(qiáng)DNA保護(hù)效應(yīng)的方法除了選擇更為有效的保護(hù)性抗原和多種抗原聯(lián)合免疫或采用Prime-Boost免疫策略[35](即初次用DNA疫苗免疫,再次用BCG、抗原蛋白或抗結(jié)核藥物加強(qiáng)免疫)等方法外,表達(dá)載體與佐劑的選擇以及免疫途徑也至關(guān)重要。

    4.1DNA疫苗載體的選擇及優(yōu)化自TB DNA疫苗研究以來,質(zhì)粒作為其研究載體仍然占重要地位。人們通過優(yōu)先選擇具備基因特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子、功能性剪接體和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子、特異有效的非甲基化CpG序列以及影響真核生物表達(dá)的Kozak序列等的質(zhì)粒[36-39],構(gòu)建優(yōu)化質(zhì)粒載體的DNA疫苗。近年來,隨著載體應(yīng)用研究的深入,病毒載體以其可在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)目的基因的優(yōu)勢(shì),成為DNA疫苗表達(dá)載體研究的熱點(diǎn)。最新研究[40-41]報(bào)道的一種ESAT6新型DNA疫苗,可表達(dá)ESAT6T細(xì)胞表位的減毒流感病毒A/New Caledonia/20/99株活疫苗可誘導(dǎo)ESAT6的高水平的抗血清抗體滴度,表明病毒樣顆粒作為展示表位載體的有效性和可操作性。目前,病毒性載體的研究主要以腺病毒和痘病毒為主。

    慢病毒載體具備能感染分裂期細(xì)胞和非分裂期細(xì)胞,攜帶的外源基因表達(dá)水平高,容納外源目的基因的片段大等優(yōu)點(diǎn)。其中腺病毒具有強(qiáng)有力的免疫原性和佐劑作用,可誘發(fā)CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞免疫反應(yīng)[42]和特異性的記憶免疫反應(yīng),有研究者[43]認(rèn)為第5型腺病毒用于結(jié)核疫苗的研究具有廣泛性,但5型腺病毒在人群中有高度流行性,感染后的人體易產(chǎn)生中和抗體,削弱流行區(qū)的疫苗效率,而35型是非流行株,用途較為廣泛;痘病毒具有接種一次,就能獲得長(zhǎng)期免疫效果的優(yōu)點(diǎn)。目前,已有眾多實(shí)驗(yàn)研究表明用該兩種病毒載體構(gòu)建的TB DNA疫苗的優(yōu)勢(shì)性和有效性,如ESAT6的重組腺病毒DNA疫苗,用于感染小鼠的免疫治療,發(fā)現(xiàn)其肺部的細(xì)菌數(shù)和病灶的炎癥反應(yīng)程度減少[44];以痘病毒為載體的重組Ag85A DNA疫苗目前已進(jìn)入臨床二期試驗(yàn)[45]。

    此外,病原體與感染宿主在密碼子使用偏嗜性方面的差異可能導(dǎo)致外源性蛋白表達(dá)偏低,從而導(dǎo)致DNA疫苗的誘發(fā)免疫效應(yīng)偏低,這已成為DNA疫苗發(fā)展的重要瓶頸之一。隨著生物技術(shù)手段的發(fā)展,密碼子優(yōu)化技術(shù)為研制有效的TB DNA疫苗提供了新思路。密碼子優(yōu)化是指在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列的前提下,利用序列定點(diǎn)突變或全基因合成的方法,改變保護(hù)性抗原基因的稀有密碼子,使之更適合在真核宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá),刺激宿主產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫應(yīng)答和保護(hù)力。在TB疫苗研究中,LAKEY等[46]將Mtb85A、85B及超氧化物歧化酶(SOD)在大腸埃希菌中使用率低的密碼子進(jìn)行優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)85B蛋白表達(dá)量增加約54倍,85A和SOD蛋白表達(dá)量提高4~6倍。KO等[47]對(duì)MtbAg85B抗原基因優(yōu)化,構(gòu)建人源化的Ag85BDNA疫苗,體內(nèi)外試驗(yàn)均提示,優(yōu)化后的Ag85B蛋白表達(dá)量顯著提高,且優(yōu)化后hAg85BDNA疫苗可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更強(qiáng)的Th1和CTL免疫反應(yīng)應(yīng)答,產(chǎn)生更好的保護(hù)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室將CFP10和ESAT6基因進(jìn)行優(yōu)化,構(gòu)建CFP10/PVAX1和ESAT6/PVAX1重組DNA疫苗,通過與優(yōu)化前比較,觀察其免疫效應(yīng)及保護(hù)力是否有所提高。這將是一個(gè)有意義的嘗試,目前該研究正在進(jìn)行之中。

    4.2免疫佐劑TB DNA疫苗的使用可以不聯(lián)合佐劑,但合適的佐劑在某種程度上可解決其免疫原性低的問題,提高其免疫效應(yīng)和保護(hù)力,減少疫苗的免疫劑量和免疫次數(shù)。佐劑從最初的鋁鹽佐劑、弗氏佐劑,到各種新型佐劑已取得了迅速的發(fā)展,目前臨床上批準(zhǔn)用于人體的佐劑主要是鋁佐劑和MF59兩種。其次,細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-18等可促進(jìn)TH1反應(yīng),在TB DNA疫苗的發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。SHI等[48]將Hsp65基因與人IL-2融合構(gòu)建DNA疫苗,研究顯示對(duì)感染Mtb的小鼠具有很好的保護(hù)效果。李暉等[49]將Mtb8.4/hIL-12嵌合DNA疫苗免疫小鼠,與BCG和Mtb8.4疫苗相比免疫作用增強(qiáng)。結(jié)核菌DNA中未甲基化的CpG序列一方面可誘導(dǎo)B細(xì)胞的增殖分化,同時(shí)還可激活T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌細(xì)胞因子,誘發(fā)以TH1為主的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

    此外,泛素、單磷酰脂(MLA)、IC31以及一些新型的復(fù)合佐劑如CAF01、TBD等可誘導(dǎo)有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫保護(hù)效應(yīng)[50-53]。目前作為免疫佐劑熱門研究領(lǐng)域的Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑,可介導(dǎo)即時(shí)的非特異性的抗病原體反應(yīng),并能通過相應(yīng)的信號(hào)通路和免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng),發(fā)揮佐劑作用,在疫苗研究中已有所研究[54-55]。隨著納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)中的發(fā)展,納米材料以其具有易于加工修飾、促進(jìn)功能分子入胞、保護(hù)DNA和蛋白質(zhì)等降解,延長(zhǎng)在血液的循環(huán)時(shí)間等優(yōu)點(diǎn),作為載體或佐劑在增強(qiáng)抗原免疫原性方面具有巨大的潛力,目前已有相關(guān)納米粒子作為佐劑在DNA疫苗中的一些研究[56-59]。

    4.3免疫途徑DNA疫苗的免疫途徑有多種,不同的免疫途徑可影響抗原的吸收和表達(dá),誘導(dǎo)的免疫強(qiáng)度和免疫機(jī)制也不同[60]。早期DNA疫苗采用的常規(guī)肌內(nèi)注射法,其骨骼肌細(xì)胞攝取DNA后,可長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)表達(dá),且肌肉接種誘發(fā)的免疫以TH1型為主,激活CTL、TH1細(xì)胞及產(chǎn)生IgG2a為主的B細(xì)胞[61],但質(zhì)粒DNA注射后,由于肌束膜的影響,僅有1%~2%的肌纖維被轉(zhuǎn)染,大部分DNA未能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),只留在細(xì)胞間隙被降解,攝取量極低。所以,有研究者通過肌內(nèi)注射聯(lián)合體內(nèi)電轉(zhuǎn)染技術(shù)來提高質(zhì)粒DNA的攝取量,增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。體內(nèi)電轉(zhuǎn)染(又稱體內(nèi)電穿孔、電轉(zhuǎn)化、電脈沖)是通過脈沖電流增加靶細(xì)胞的滲透性,使DNA易透過細(xì)胞膜,而不損害靶細(xì)胞,解決質(zhì)粒DNA在靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低的問題。有研究[62]將質(zhì)粒DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射后立即施加方型波電脈沖,發(fā)現(xiàn)肌內(nèi)注射10 μg DNA疫苗加電轉(zhuǎn)染,能誘導(dǎo)出與不加電轉(zhuǎn)染接種100 μg DNA疫苗相似或更強(qiáng)的抗體免疫應(yīng)答,表明使用電轉(zhuǎn)染技術(shù)可減少DNA疫苗的劑量和成本。

    此外,新的免疫途徑如基因槍法、黏膜免疫途徑法、口服納米乳或微針陣列經(jīng)皮免疫途徑等目前處于大量試驗(yàn)階段,對(duì)未來DNA疫苗的發(fā)展具有巨大的潛力。

    5結(jié)語

    TB DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的新型疫苗,近年來已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展,其可作為預(yù)防性疫苗,也可作為治療性疫苗,被認(rèn)為在TB防治中占有很大的優(yōu)勢(shì)。但同時(shí)也存在著一些問題:一是目前TB DNA疫苗的研究主要局限于小鼠和豚鼠模型,很少用靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型,所以要想在臨床試驗(yàn)中取得突破,還有很長(zhǎng)的一段路要走;二是疫苗的安全問題,疫苗應(yīng)用中不良反應(yīng)的報(bào)道越來越多,主要包括免疫抑制、超敏反應(yīng)及自身免疫等。因此,在日后的DNA疫苗研究進(jìn)程中,我們要繼續(xù)探求合適的保護(hù)抗原和載體,摸索最適宜的免疫策略、途徑以及免疫劑量,充分利用佐劑的作用,將研發(fā)的新型疫苗免疫多種動(dòng)物模型,進(jìn)一步研究其保護(hù)性免疫機(jī)制,建立有效的體內(nèi)和體外疫苗評(píng)價(jià)模型,同時(shí)建立量化的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)[63]。我們相信,隨著DNA疫苗的免疫學(xué)機(jī)制和免疫策略的深入研究,人類定能克服困難,逐個(gè)攻破難題,研制出安全有效、經(jīng)濟(jì)合理的DNA疫苗用于TB的預(yù)防和治療。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1]Global tuberculosis Control WHO Report(2012)[R].Geneva:WHO,2012.

    [2]吳雪瓊.新型結(jié)核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(3):133.

    [3]WOLFF JA,WILLIAMS P,ACSADI G,etal.Direct gene transfer into mouse muscleinvivo[J].Science,1990,247(4949 pt 1):1465.

    [4]FLYNN JL,GOLDSTEIN MM,TRIEBOLD KJ,etalMajor histocompatibility complex class I-restricted T cells are required for resistance toMycobacteriumtuberculosisinfection[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(24):12013.

    [5]VAN PINXTEREN LA,CASSIDY JP,SMEDEGAARD BH,etal.Control of latentMycobacteriumtuberculosisinfection is dependent on CD8 T cells[J].Eur J Immunol,2000,30(12):3689.

    [6]HOHN H,KORTSIK C,ZEHBE I,etal.MHC class II tetramer guided detection ofMycobacteriumtuberculosis-specific CD4+T cells in peripheral blood from patients with pulmonary tuberculosis[J].Scand J Immunol,2007,65(5):467.

    [7]KAUFMANN SHE.Novel tuberculosis vaccination strategies based on under standing the immune response(Foresight )[J].J Intern Med,2010,267(4):337.

    [8]聞?dòng)衩?治療性疫苗研究現(xiàn)狀與前景[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2009:1.

    [9]OKADA M,KITA Y,KANAMARU N,etal.Novel therapeutic vaccination (granulysin DNA,adenoviral vector/IL-6 related genes) against tuberculosis[J/OL].http://www.fasebj.org/cgi/content/meetin-gabstract /22/2 Meeting Abstracts/491.

    [10]梁艷,吳雪瓊,李忠明,等.結(jié)核分枝桿菌 Ag85A/ESAT-6 嵌合型質(zhì)粒DNA 疫苗和抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療小鼠耐藥結(jié)核病的效果研究[J].中國(guó)防癆雜志,2007,29(5):382.

    [11]梁艷,吳雪瓊,李忠明,等.結(jié)核分枝桿菌 Ag85A DNA疫苗抗結(jié)核作用的研究[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(3):181.

    [12]OKADA M,KITA Y,NAKAJIMA T,etal.Novel prophylactic and therapeutic vaccine against tuberculosis [J].Vaccine,2009,27(25/26):3267.

    [13]CHANGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin 2 fusion gene[J].Tuberculosis,2009,89(1):54.

    [14]SCHUCK SD,MUELLER H,KUNITZ F,etal.Identification of T-cell antigens specific for latentMycobacteriumtuberculosisinfection[J].PLoS One,2009,4(5):e5590.

    [15]MUELLER H,DETJEN AK,SCHUCK SD,etal.Mycobacteriumtuberculosis-specific CD4+,IFN IFNγ+,and TNFα+multifunctional memory T cells coexpress GM-CSF [J].Cyt Okine,2008,43(2):143.

    [16]KAUFMANN SH.Recent findings in immunology give tuberculosis vaccines a new boost[J].Trends Immunol.2005,26(12):660.

    [17]KHERA A,SINGH R,SHAKILA H,etal.Elicitation of efficient,protective immune responses by using DNA vaccines against tuberculosis[J].Vaccine,2005,23(48/49):5655.

    [18]AAGAARD C,HOANG T,DIETRICH J,etal.A multistage tuberculosis vaccine that confers efficient protection before and after exposure[J].Nat Med,2011,17(2):189.

    [19]ANDERSEN P,ROSENKRANDS I,STRYHN A.Use of one or more polypeptides or their fragments,which are expressed during the latent stage of the mycobacterial infection,and/ or nucleicacids encoding the polypeptides,fora therapeutic vaccine against tuberculosis:WO,2004006952-A2;US,2004057963-A1;AU,2003242504-A1;EP,1523331-A2;AU,2003242504-A8[P/OL].

    [20]CHANGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin 2 fusion gene [J].Tuberculosis,2009,89(1):54.

    [21]胡方靖,武軍駐.pIHsp65GM的構(gòu)建及其對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的保護(hù)[J].免疫學(xué)雜志,2011,27(8):666.

    [22]LOWRIE DB,TASCON RE,BONATO VL,etal.Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination[J].Nature,1999,400(6741):269.

    [23]史小玲,李暉,鐘森,等.Hsp70/CD80嵌合DNA疫苗對(duì)結(jié)核桿菌的治療作用[J].中華傳染病雜志,2004,22(1):30.

    [24]MALIN AS,HUYGEN K,CONTENT J,etal.Vaccinia expression of Mycobacterium tuberculosis-secreted proteins:tissue plasminogen activator signal sequence enhances expression and immunogenicity ofM.tuberculosisAg85[J].Microbes Infect,2000,2(14):1677.

    [25]HA SJ,JEON BY,KIM SC,etal.Therapeutic effect of DNA vaccines combined with chemotherapy in a latent infection model after aerosol infection of mice withMycobacteriumtuberculosis[J].Gene Ther,2003,10(18):1592.

    [26]LIANG Y,WU X,ZHANG J,etal.The treatment of mice infected with multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosisusing DNA vaccines or in combination with rifampin[J].Vaccine,2008,26(35):4536.

    [27]KAMATH AT,FENG CG,MACDONALD M,etal.Differential protective efficacy of DNA vaccine expressing secreted proteins ofMycobacteriumtuberculosis[J].Infect Immunol,1999,67(4):1702.

    [28]吳雪瓊,鄭越,徐燕杰,等.不同劑量結(jié)核病DNA疫苗及細(xì)胞因子聯(lián)合免疫的研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2006,22(10):883.

    [29]TANGHE A,LEFEVRE P,DENIS O,etal.Immunogenicity and protective efficacy of tuberculosis DNA vaccines encoding putative phosphate transport receptors[J].Immunol,1999,162(2):1113.

    [30]KUMAR M,MEENAKSHI N,SUNDARAMURTHI JC,etal.Immune response toMycobacteriumtuberculosisspecific antigen ESAT-6 among south Indian[J].Tuberculosis(Edinb),2010,90(1):60.

    [31]ZHANG H,PENG P,MIAO S,etal.Recombinant Mycobacterium smegmatis expressing an ESAT6-CFP10 fusion protein induces anti-mycobacterial immune responses and protects againstMycobacteriumtuberculosischallenge in mice[J].Scand J Immunol,2010,72(4):349.

    [32]WOODWORTH JS,FORTUNE SM,BEHAR SM.Bacterial protein secretion is required for priming of CD8+T cells specific for theMycobacteriumtuberculosisantigen CFP10[J].Infect Immun,2008,76(9):4199.

    [33]張海,師長(zhǎng)宏,王麗梅,等.表達(dá)結(jié)核分枝桿菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(6):489.

    [34]WANG QM,KANG L,WANG XH.Improved cellular response elicited by a ubiquitin-fused Esat6 DNA vaccine againstMycobacteriumtuberculosis[J].Microbiol Immunol,2009,53(7):384.

    [35]HUYGEN K.On the use of DNA Vaccines for the prophylaxis of mycobacterial diseases[J].Infect Immun,2003,71(4):1613.

    [36]JATHOUL AP,HOLEY JL,GARMORY HS.Efficacy of DNA vaccines expressing the type F botulinum toxin Hc fragment using different promoters[J].Vaccine,2004,22(29/30):3942.

    [37]CHINSANGARAM J,BEARD C,MASON PW,etal.Antibody response in mice inculated with DNA expressing foot -and -mouth disease virus capsid proteins[J].J Virol,1998,72 (5):4454.

    [38]COBAN C,ISHII KJ,GURSEL M,etal.Effect of plasmid backbone modification by different human CpG motifs on the immunogenicity of DNA vaccine vectors[J].J Leukoc Biol,2005,78(3):647.

    [39]KOZAK M.Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6[J].EMBO J,1997,16(9):2482.

    [40]KRAMMER F,SCHINKO T,MESSNER P,etal.Influenza virus-like particles as an antigen-carrie-r platform for the ESAT-6 epitope ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Virol Methords,2010,167(1):17.

    [41]KANG SM,SONG JM,QUAN FS,etal.Influenza vaccines based on virus-like particles[J].Virus Res,2009,143(2):140.

    [42]BANGARI DS,MITTAL SK.Development of nonhuman adenoviruses as vaccine vectors [J].Vaccine,2006,24(7):849.

    [43]MU J,JEYANATHAN M,SMALL CL,etal.Immunization with a bivalent adenovirus-vectored tuberculosis vaccine provides markedly improved protection over its monovalent counterpart against pulmonary tuberculosis[J].Mol Ther,2009,17(6):1093.

    [44]ZABOLOTNYKH NV,VINOGRADOVA TI,STUKOVA MA,etal.The effectiveness of influenza vectors expressing the protective mycobacterial antigen ESAT-6 in the complex therapy of generalized tuberculosis in mice[J].Probl Tuberk Bolezn Legk,2008,(12):30.

    [45]SCRIBA TJ,TAMERIS M,MANSOOR N,etal.Modified vaccinia Ankara-expressing Ag85A,a novel tuberculosis vaccine,is safe in adolescents and children,and induces polyfunctional CD4+T cells[J].Eur J Immunol,2010,40(1):279.

    [46]LAKEY DL,VOLADRI RK,EDWARDS KM,etal.Enhanced production of recombinantMycobacteriumtuberculosisantigens in Escherichia coli by replacement of low-usage codons[J].Infect Immun,2000,68(1):233.

    [47]KO HJ,KO SY,KIM YJ,etal.Optimization of codon usage enhances the immunogenicity of a DNA vaccine encoding mycobacterial antigen Ag85B[J].Infect Immun,2005,73(9):5666.

    [48]CHONGHONG S,HAI Z,LIMEI W,etal.Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 ofMycobacteriumtuberculosisand the human interleukin2 fusion gene[J].Tuberculosis(Edinb),2009,89(1):54.

    [49]李暉,李榕,鐘森.結(jié)核病Mtb8.4 /hIL-12嵌合基因疫苗免疫保護(hù)效果研究[J].免疫學(xué)雜志,2007,23(2):139.

    [50]王慶敏,殷明,章建程,等.泛素-結(jié)核抗原融合基因DNA疫苗誘導(dǎo)小鼠較強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(3):261.

    [51]AGGER EM,ROSENKRANDS I,OLSEN AW,etal.Protective immunity totuberculosis with Ag85B-E SAT-6 in a synthetic cationic adjuvant system IC31[J].Vaccine,2006,24 (26):5452.

    [52]GARCON N,CHOMEZ P,VAN MECHELEN M.Adjuvant Systems in vaccines:concepts,acievements and perspectives [J].Expert Rev Vaccines,2007,6(5):723.

    [53]AGGER EM,ROSEN KRANDS I,HANSEN J,etal.Cationic liposomes formulated with syntheic mycobacterial cordfactor(CAF01):a versatile adjuvant for vaccines with different immunological requirements [J].PLoS One,2008,3(9):e3116.

    [54]TRIOZZI PL,ALDRICH W,PONNAZHAGAN S.Regulation of the activity of an adeno-associated virus vector cancer vaccine administered with synthetic Toll-like receptor agonists[J].Vaccine,2010,28(50):7837.

    [55]VENUGOPAL PG,NUTMAN TB,SEMNANI RT.Activation and regulation of toll-like receptor (TLRs) by helminth parasites[J].Immunol Res,2009,43(1/3):252.

    [56]許利耕,陳春英.納米材料作為重大疾病疫苗載體或佐劑的研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào),2012,57(25):2341.

    [57]XU L,LIU Y,CHEN Z,etal.Surface-engineered gold nanorods:Promising DNA vaccine adjuvant for HIV-1 treatment[J].Nano Lett,2012,12(4):2003.

    [58]POWELL TJ,PALATH N,DEROME ME,etal.Synthetic nanoparicle vaccines produced by layer-by-layer assembly of artificial biofilms induce potent protective T-cell and antibody responsesinvivo[J].Vaccine,2011,29(3):558.

    [59]蔣青桃,馮旰珠,夏梅,等.結(jié)核桿菌ESAT-6抗原Th1優(yōu)勢(shì)表位與FL重組納米疫苗的制備及其特性研究[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(5):620.

    [60]DA′DARA AA,SKELLY PJ,FATAKDAWALA M,etal.Comparative efficacy of the Schistosoma mansoni nucleic acid vaccine,Sm23,following microseeding or gene gun delivery[J].Parasite Immunol,2002,24(4):179.

    [61]XU XM,SONG GX,SI JY.Advance in research on DNA vaccine[J].Prog Microbiol Immunol,2002,30(1):65.

    [62]宋丹,張穎,黃嘉璐,等.電轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合初免后加強(qiáng)免疫策略增強(qiáng)結(jié)核桿菌核酸疫苗免疫原性的研究[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2006,26(2):127.

    [63]都偉欣,董娜,陳保文,等.結(jié)核病新疫苗的免疫毒理學(xué)評(píng)價(jià)方法研究[J].中國(guó)防癆雜志,2012,34(3):138.

    (本文編輯姚仁斌)

    [文章編號(hào)]1000-2200(2016)03-0408-06·綜述·

    [收稿日期]2013-12-25

    [基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30600518/C030112)

    [作者簡(jiǎn)介]薛玉芹(1985-),女,碩士研究生.[通信作者] 方強(qiáng),博士,碩士研究生導(dǎo)師,教授.E-mail:fq333@sohu.com

    [中圖法分類號(hào)]R 378.91

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    DOI:10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.03.043

    [作者單位] 蚌埠醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)教研室,感染與免疫安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 蚌埠 233030

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