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    急性遞增負荷運動對小鼠骨骼肌SOD同工酶活性和mRNA表達的影響

    2016-12-17 03:31:13LIChunguang漆正堂丁樹哲
    成都體育學院學報 2016年3期
    關(guān)鍵詞:小鼠

    王 平,LI Chunguang,漆正堂,丁樹哲

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    急性遞增負荷運動對小鼠骨骼肌SOD同工酶活性和mRNA表達的影響

    王 平1,LI Chunguang2,漆正堂3,4,丁樹哲4

    目的:通過建立急性遞增負荷小鼠運動模型,探討小鼠急性跑臺運動后骨骼肌抗氧化防御系統(tǒng)的反應(yīng)。方法:30只6周齡清潔級雄性ICR小鼠,體重20.81±2.31g,隨機分為安靜對照組(C組,6只)、急性遞增負荷運動45min組(E1組,6只)、90min組(E2,6只)、120min組(E3組,6只)和150min組(E4組,6只)組。正式運動按以下程序:第1 級負荷:0°,8.2m/min(相當于53%VO2max),15min;第2 級負荷:5°,15m/min(相當于64%VO2max),15min;第3 級負荷:10°,19.3m/min(相當于76%VO2max)。各組分別運動至所設(shè)相應(yīng)時間及安靜對照組,取出左、右側(cè)腓腸肌,采用硝酸還原酶法測定線粒體NO含量,采用化學比色法測定eNOS活性,采用黃嘌呤氧化酶法測定線粒體MnSOD、CuZnSOD的活性;實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測骨骼肌MnSOD、CuZnSOD基因表達水平。結(jié)果:(1)與安靜對照組相比,小鼠骨骼肌線粒體NO含量在急性遞增負荷運動45min、90min、120min和150min均出現(xiàn)顯著增加(P<0.05),且90min達到峰值(P<0.01);小鼠骨骼肌線粒體eNOS活性在急性遞增負荷運動45min、90min和120min均出現(xiàn)顯著增加(P<0.05),且90min達到峰值(P<0.01),但150min未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05);(2)線粒體MnSOD活性在急性運動45min后明顯增加(P<0.05),急性運動90、120min和150min均出現(xiàn)極顯著增加(P<0.01),且在120min達到峰值;(3)與安靜對照組相比,MnSODmRNA在急性運動45min出現(xiàn)顯著性增加(P<0.05),急性運動90min、120min和150min均出現(xiàn)極顯著性增加(P<0.01),且在150min達到峰值(P<0.01)。結(jié)論:線粒體MnSOD對急性遞增負荷運動具有較好的應(yīng)答反應(yīng),是運動刺激-反應(yīng)-適應(yīng)的主要SOD機制。

    急性遞增運動;骨骼??;NO;eNOS;MnSOD;CuZnSOD

    關(guān)于肌肉自由基理論的研究始于20世紀50年代[1],Koren等人證實肌肉在反復(fù)收縮時自由基含量會顯著增加[2]。Davies等人證實大鼠進行一次性力竭性運動后,骨骼肌自由基明顯增加[3]。在過去30多年來,國內(nèi)外許多學者認為自由基對機體是有害的,但現(xiàn)在越來越多的研究證實在運動適應(yīng)過程中肌肉收縮產(chǎn)生的活性氧具有生理性的作用,機體細胞在面對自由基攻擊時,會做出相應(yīng)的反應(yīng),激發(fā)產(chǎn)生抗氧化防御系統(tǒng)諸如超氧化物歧化酶、過氧化物酶等[4]。因此,對于活性氧的正常產(chǎn)生機體細胞能夠做出很好的應(yīng)對反應(yīng)。

    目前越來越多的研究表明,低濃度的活性氧可誘導機體抗氧化酶和其他防御系統(tǒng)的表達,這種現(xiàn)象可以用毒物興奮效應(yīng)概念解釋,從這一點看,自由基是有益的。最近此理論被延伸到運動源性活性氧效應(yīng)中[5-6]。在運動過程中,毒素是活性氧的形成,活性氧觸發(fā)細胞具體的適應(yīng)反應(yīng),如抗氧化防御系統(tǒng)酶活性的增加,抵抗氧化應(yīng)激,氧化損傷減小[7]。耐力訓練可使大鼠線粒體MnSOD和谷胱甘肽過氧化酶顯著增加[8]。但目前關(guān)于急性運動后機體的一氧化氮(NO)含量、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS))活性、抗氧化酶活性和其基因的表達情況如何,研究的還不充分,本研究建立急性遞增負荷跑臺運動小鼠模型,檢測骨骼肌線粒體一氧化氮(NO)含量、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性、CuZnSOD和MnSOD活性和基因表達的時相性變化情況,探討急性跑臺運動誘導小鼠骨骼肌抗氧化防御系統(tǒng)的分子機制,也為科學合理進行運動訓練提供一些理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組

    清潔級6周齡雄性ICR小鼠30只,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,許可證號為SCXK(滬)2007-0005,體重20.81±2.31g,所有小鼠進行每籠5只的干籠飼養(yǎng),自由進食、飲水,以國家標準嚙齒類動物常規(guī)飼料喂養(yǎng),飼料和墊料均由上海生工生物技術(shù)有限公司提供,動物房溫度維持在18℃-24℃,相對濕度為45%-55%,自然光照。實驗動物隨機分為安靜對照組(C),急性遞增負荷運動45min組(E1),急性遞增負荷運動90min組(E2),急性遞增負荷運動120min組(E3)和急性遞增負荷運動150min組(E4),共5組,每組6只。

    1.2 運動方案

    實驗前所有動物均未進行過跑臺運動,小鼠進行正式實驗之前進行3天適應(yīng)性跑臺訓練,坡度為0°,速度5m/min,持續(xù)時間5min。正式實驗參照Bedford據(jù)鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運動負荷訓練方案[9],按以下程序運動:第1 級負荷:0°,8.2m/min(相當于53%VO2max),15min;第2 級負荷:5°,15m/min(相當于64%VO2max),15min;第3 級負荷:10°,19.3m/min(相當于76%VO2max),各組分別運動至所設(shè)相應(yīng)時間。

    1.3 取材

    各組小鼠運動至對應(yīng)時間,即刻斷頭迅速取出左、右側(cè)腓腸肌,稱濕重。左側(cè)腓腸肌加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)抽提線粒體,右側(cè)腓腸肌至于液氮中,然后轉(zhuǎn)入-80°冰箱保存,待測,安靜對照組與運動組同時取材。

    1.4 線粒體NO含量和eNOS活性的測定

    NO和eNOS試劑盒均購自南京建成生物試劑公司,NO測試方法采用硝酸還原酶法,eNOS測試方法采用化學比色法,均采用TECAN infinite M200型號酶標儀置于測試版中進行測定。

    1.5 線粒體CuZnSOD、MnSOD活性的測定

    線粒體提取的方法采用差速離心法,其具體制備過程參照[10]。CuZnSOD、MnSOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法,蛋白定量采用BCA法,采用TECAN infinite M200型號酶標儀測定,單位U/mgprot。

    1.6 Real time PCR檢測CuZnSOD、MnSOD基因表達水平

    冰上取腓腸肌約40mg,采用Invitrogen Trizol法提取總RNA,參照試劑盒說明書進行,紫外分光光度法計算OD260/OD280比值,選取符合Real-time PCR要求的RNA進行反轉(zhuǎn)錄(RT);RT使用ReverTra Ace qPCR RT Kit,條件為15℃,5min;37℃,15min;98℃,5min,合成第一鏈cDNA;cDNA的PCR使用2×SYBR green PCR Master Mix反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為預(yù)變性(95℃,1min);35個PCR循環(huán)(95℃,15s;61℃,30s;72℃,45s,收集熒光)。擴增反應(yīng)結(jié)束后,建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線。當熔解曲線只顯示一個主波峰時,說明PCR擴增特異性較高,反應(yīng)結(jié)束后,PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值,以β-actin基因為內(nèi)參,根據(jù)公式2-ΔCt計算各樣品目的基因的相對表達量。

    各基因引物序列如下:

    CuZnSOD: Forward5’-agatgacttgggcaaaggtg-3’,Reverse 5’-tctccatcagctgtcattgc-3’;

    MnSOD: Forward5’-gccccctgagttgttgaata-3’,Reverse5’-gccccctgagttgttgaata-3’;

    β-actin: Forward 5’-tgttaccaactgggacgaca-3’, Reverse 5’-ctatgggagaacggcagaag-3’。

    上述引物序列查自NCBI數(shù)據(jù)庫,由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

    2 實驗結(jié)果

    2.1 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體NO含量的影響

    從表1顯示,與對照組相比,小鼠骨骼肌線粒體NO含量在急性遞增負荷運動45min、90min、120min和150min均出現(xiàn)顯著增加(P<0.05),且90min達到峰值(P<0.01)。

    表1 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體NO的影響Table1 Effect of Acute Incremental Treadmill Exercise on Mitochondrial NO Content in Skeletal Muscle of Mice

    2.2 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體eNOS活性的影響

    從表2顯示,與對照組相比,小鼠骨骼肌線粒體eNOS活性在急性遞增負荷運動45min、90min和120min均出現(xiàn)顯著增加(P<0.05),且90min達到峰值(P<0.01),但150min未出現(xiàn)顯著性變化(P>0.05)。

    表2 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體eNOS活性的影響Table2 Effect of Acute Incremental Treadmill Exercise on Mitochondrial eNOS Content in Skeletal Muscle of Mice

    2.3 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體CuZnSOD和MnSOD的影響

    從表3顯示,與對照組相比,小鼠骨骼肌線粒體MnSOD的活性在急性遞增負荷運動45min開始顯著增加(P<0.05),運動至90min、120min和150min出現(xiàn)極顯著增加(P<0.01),且120min達到峰值;但CuZnSOD活性在急性遞增負荷運動45min、90min、120min和150min(P>0.05)。

    表3 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌線粒體CuZnSOD和MnSOD的影響Table3 Effect of Acute Incremental Treadmill Exercise on Mitochondrial CuZnSOD and MnSOD in Skeletal Muscle of Mice

    2.4 急性遞增負荷跑臺運動對小鼠骨骼肌CuZnSODmRNA和MnSODmRNA表達的影響

    從表4顯示,與對照組相比,小鼠急性運動45min時,MnSODmRNA表達顯著增加(P<0.05),當運動到90min、120min、150min時,出現(xiàn)極顯著增加(P<0.01),且150min達峰值;但CuZnSOD mRNA表達在運動45min、90min、120min和150min均未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。

    表4 急性遞增負荷運動對小鼠骨骼肌CuZnSODmRNA和MnSODmRNA表達的影響Table4 Effect of Acute Incremental Treadmill Exercise on Mitochondrial CuZnSODmRNA and MnSODmRNA in Skeletal Muscle of Mice

    3 分析與討論

    我們的研究發(fā)現(xiàn),急性運動明顯增加骨骼肌線粒體NO含量,NO含量的變化基本呈時間依賴性(45-150min),在運動90分鐘時達到峰值,提示急性運動引起骨骼肌線粒體NO的形成可能與運動過程關(guān)系密切。耐力運動導致老年大鼠骨骼肌NO含量增加[11],90分鐘和150分鐘游泳增加血清NO含量[12],提示運動源性NO含量的增加有助于心臟輸出量和骨骼肌血流量的增加[13]。

    NOS有三種同分異構(gòu)體,分別是神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘生型NOS(iNOS)[14]。nNOS和eNOS在骨骼肌中含量豐富,nNOS主要存在于肌纖維膜中,eNOS主要存在于線粒體中[15]。iNOS主要在骨骼肌炎癥階段表達[16]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),骨骼肌線粒體eNOS活性呈時間依賴性增加(運動45min到120min),運動90分鐘達到峰值,與NO含量變化趨勢基本一致,提示適宜運動可以提高骨骼肌線粒體eNOS活性,推測,NO含量的變化極有可能與eNOS活性增加有關(guān)。我們的研究結(jié)果與以前的研究結(jié)果報道一致,他們研究發(fā)現(xiàn),耐力運動明顯提高骨骼肌eNOS的表達和活性[17]。也有人報道運動通過增加骨骼肌血流量、剪切力甚至某種特定的細胞信號轉(zhuǎn)導途徑諸如磷脂酶C、鈣離子等使血管內(nèi)皮細胞eNOS表達和活性明顯增加[18]。

    N0可調(diào)控運動性線粒體生物發(fā)生、抗氧化還原等生物學作用[19]。已有研究證實,NO的產(chǎn)生可調(diào)控骨骼肌靶基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達,也可改變細胞內(nèi)氧化還原信號狀態(tài)[20]。NO信號途徑的變化與運動性骨骼肌內(nèi)皮功能的適應(yīng)密切相關(guān)[21]。耐力運動通過NO信號途徑增加老年大鼠骨骼肌GPx-1和SOD的含量,減少血管緊張素II的釋放[22]。NO也可調(diào)控骨骼肌PI3K/Akt和MnSOD信號途徑[21]。因此,NO也有可能作為信號分子調(diào)節(jié)骨骼肌運動性氧化應(yīng)激[23]。

    細胞抗氧化防御系統(tǒng)對于需氧生物的生存至關(guān)重要。針對哺乳動物,SOD在清除體內(nèi)自由基,維護骨骼肌功能方面起著決定性作用[24]。SOD按其所含金屬輔基不同,其同工酶主要分為兩種,一種是CuZnSOD(含Cu、Zn金屬輔基),特性非常穩(wěn)定,以前認為主要存在于細胞漿,目前有研究證實線粒體中也有CuZnSOD[25];另一種是MnSOD(含錳Mn金屬輔基),主要存在于線粒體基質(zhì)中[24]。重組人SOD研究發(fā)現(xiàn),CuZnSOD半衰期較短,只有6-10分鐘,而MnSOD半衰期較長,約5-6小時[26]。兩種類型的SOD活性和基因相對表達量與骨骼肌的抗氧化能力密切相關(guān)[27]。

    目前比較一致的觀點是耐力運動明顯增加骨骼肌MnSOD活性[28-29]。但關(guān)于急性運動對CuZnSOD和MnSOD活性和基因相對表達的報道還不是很一致,本研究結(jié)果顯示,MnSOD活性在急性運動45分鐘開始明顯增加,隨后90min、120min、150min均出現(xiàn)極顯著增加,在120min達到峰值,但CuZnSOD活性在急性運動45min、90min、120min和150min均未發(fā)生明顯變化。與Higuchiet al 等人[30]的研究結(jié)果一致,他們的研究發(fā)現(xiàn),運動訓練使MnSOD活性增加,CuZnSOD活性沒有發(fā)生顯著變化。

    但也有不一致的報道,HollanderJ等人報道,一次性力竭運動(25 m/min,5% grade,力竭時間大約1hr)并沒有使大鼠股外側(cè)深肌和股外側(cè)淺肌的CuZnSOD和MnSOD活性發(fā)生顯著變化[31]。Ishi OS等人也報道急性運動(15-20 m/min, 10 min/day for 3 days)對大鼠比目魚肌CuZnSOD和MnSOD活性均未發(fā)生顯著變化,而9周耐力運動顯著增加大鼠比目魚肌MnSOD和CuZnSOD的活性。分析其原因可能與鼠齡、鼠的飲食、運動方式、運動強度、運動持續(xù)時間、肌纖維類型、試劑盒使用的方法不同等因素[29],當然最重要的可能與此酶的基因調(diào)控復(fù)雜性有關(guān),并且骨骼肌屬于高度異質(zhì)性組織,每種肌纖維類型各自的新陳代謝特性、氧化能力和抗氧化防御能等因素力有關(guān),但是具體作用機制仍然需要進一步深入研究。

    為了進一步了解急性運動對抗氧化防御系統(tǒng)影響涉及到的分子機制,我們還檢測了MnSODmRNA和CuZnSODmRNA表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),MnSODmRNA和CuZnSODmRNA表達變化趨勢與活性變化基本一致,MnSODmRNA在急性運動45分鐘開始明顯增加,隨后90min、120min、150min均出現(xiàn)極顯著增加,且在150min達到峰值,但CuZnSODmRNA在急性運動45min、90min、120min和150min均未發(fā)生明顯變化。與Hollander J等人的報道一致,他們發(fā)現(xiàn)急性運動使大鼠股外側(cè)深肌MnSOD mRNA表達顯著增加,這種狀態(tài)一直持續(xù)到運動后2小時,而CuZnSODmRNA表達未見明顯變化[31]。分析其原因可能是由于MnSOD主要位于線粒體,MnSOD基因的啟動子上具有活性氧(包括過氧化氫)的結(jié)合位點,前期研究結(jié)果已經(jīng)證實急性運動引起小鼠腓腸肌線粒體過氧化氫含量顯著增加[32],過氧化氫的增加激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB和轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1的結(jié)合,然后通過順式作用元件(cis-acting element)影響基因表達活性的DNA序列,從而增加MnSOD基因轉(zhuǎn)錄水平[31]。的確,在哺乳動物MnSOD基因的啟動子上具有NF-kB 和AP-1的結(jié)合位點,且氧化應(yīng)激可上調(diào)MnSOD的基因表達[30,33],也可能與NO含量的增加有關(guān),它作為信號分子激活MnSOD的表達和增加酶的活性。而CuZnSOD基因啟動子上沒有上述結(jié)合位點,它在運動過程中的基因表達水平不能通過NF-kB或AP-1途徑活化。故不同的啟動子序列也許是導致運動引起2種SOD同工酶不同反應(yīng)的真正原因[30]。

    但也有相反的報道,Ishi SO等人報道,一次性力竭運動并沒有使大鼠比目魚肌MnSOD mRNA和CuZnSODmRNA[34]。HollanderJ報道耐力運動(27 m/min ,12% grade for 2 h/day, 5 days/w for 10 w)未見大鼠比目魚肌、股外側(cè)深肌和股外側(cè)淺肌MnSODmRNA和CuZnSODmRNA的表達發(fā)生顯著變化,一次性運動也未見大鼠股外側(cè)淺肌MnSODmRNA發(fā)生變化。因此,這也是急性運動對MnSOD和CuZnSOD基因表達進行深入研究的原因之一。

    4 結(jié)論

    急性運動沒有引起小鼠骨骼肌線粒體CuZnSOD含量和CuZnSODmRNA表達的顯著變化,提示CuZnSOD基因可能不含有能夠使自由基激活的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合的位點,而急性運動引起的MnSOD含量和MnSOD mRNA表達的增加,可能是急性運動引起NO、過氧化氫增加激活MnSOD基因上的啟動子促進基因轉(zhuǎn)錄,增加MnSOD的活性,從而增強骨骼肌抗氧化防御能力。

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    [34] Ohishi S, Kizaki T, Nagasawa, J, Et AL. Effects of endurance training on superoxide dismutase content and mRNA expression in rat muscle [J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 1997, 24(5):326-332.

    (編輯 孫君志)

    Effect of Acute Incremental Load Exercise on SOD activity and mRNA in Skeletal Muscle of Mice

    WANG Ping1, LI Chunguang2, QI Zhengtang3,4, DING Shuzhe4

    To investigate the changes of the content of NO and activity of eNOS,the mRNA expression and the activity changes of MnSOD and CuZnSOD on acute incremental exercisein skeletal muscle of mice and explore the effects of antioxidant defense system. Methods: thirty male ICR mice were randomly divided into control group (C), 45min exercise group (E1,n=6), 90min exercise group (E2,n=6), 120min exercise group (E3,n=6) and 150min exercise group (E4,n= 6). Mice in exercise groups were trained through treadmill exercise (0°grade, 5m/min, 5min/day) for 3 days. After adaptation, mice in exercise groups underwent treadmill exercise to the corresponding time set up. Exercise patterns are as follows: First, 8.2m/min, 0 grade, 15min; second, 15m/min, 5% grade, 15min; third, 19.3m/min,10% grade. At the end of exercise, all mice were killed and their gastrocnemius muscle were obtained. Left one was used as mitochondria extraction, right one was measured by Real-time PCR. Results: (1) Compared with control group,NO content significantly increased after 45min exercise (P<0.05), 90min((P<0.01)), 120min and 150min (P<0.05) and reached the peak at 90 min. eNOS activity significantly increased after 45min exercise (P<0.05), 90min(P<0.01), 120min (P<0.05) and reached the peak at 90min.But the eNOS activity didn’t increase in 150min group significantly (P<0.05);(2) MnSOD activity was significantly increased after 45min exercise (P<0.05), 90min, 120min and 150min (P<0.01) and reached the peak at 120min.But the CuZnSOD activity didn’t increase in all exercise groups significantly (P<0.05); (3) Compared with control group, MnSOD mRNA significantly increased after 45min exercise (P<0.05), 90min, 120min and 150min (P<0.01) and reached the peak at 150min.But the CuZnSOD mRNA didn’t increase in all exercise groups significantly (P<0.05).Conclusion: MnSOD is the key SOD enzyme in response to the acute incremental exercise, which forms a protective cycling mechanism in acuteskeletal muscle exercise.

    AcuteIncrementalExercise;SkeletalMuscle;NO;eNOS;MnSOD;CuZnSOD

    G804.7 Document code:A Article ID:1001-9154(2016)03-0111-05

    國家自然科學基金資助項目“線粒體蛋白輸入(PIM)的運動適應(yīng)與調(diào)控機制研究”(31171142);浙江省教育廳資助項目“運動誘導自噬信號通路調(diào)控骨骼肌質(zhì)量變化研究”(Y201328990);杭州師范大學博士啟動金“運動誘導自噬信號通路調(diào)控骨骼肌質(zhì)量變化研究”(PE13002004028)。

    王平,副教授,博士后,主要研究方向:骨骼肌運動適應(yīng)與信號調(diào)控。E-mail:wppa7476@163.com。

    1.杭州師范大學體育與健康學院,浙江 杭州 311121;2. National Institute of Complementary Medicine, University of Western Sydney, Penrith, New South Wales 2751, Australia;3.華東師范大學青少年健康評價與運動干預(yù)教育部重點實驗室,上海 200241;4.華東師范大學體育與健康學院,上海 200241 1. School of Physical Education and Health,Hangzhou Normal University,Hangzhou Zhejiang 311121;2. National Institute of Complementary Medicine, University of Western Sydney, Penrith, New South Wales 2751, Australia;3.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention Ministry of Education,East China Normal University,Shanghai 200241;4.School of Physical Education and Health,East China Normal University, Shanghai 200241

    2015-09-24

    2016-03-11

    G804.7

    A

    1001-9154(2016)03-0116-06

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