三七改善慢性腎臟病大鼠腎臟纖維化的研究*

徐 穎，王 麗，吉琳梅，沈宏春，程偲婧，樊均明，文 丹

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；5.四川大學(xué)生物治療 國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；6.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000)

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三七改善慢性腎臟病大鼠腎臟纖維化的研究*

徐 穎1，王 麗2，吉琳梅1，沈宏春3，程偲婧3，樊均明4，5△，文 丹6

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合研究中心，四川瀘州 646000；3.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000；5.四川大學(xué)生物治療 國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041；6.西南醫(yī)科大學(xué)，四川瀘州 646000)

目的 探討三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的表達(dá)改善慢性腎臟病(CKD)大鼠腎臟纖維化的作用。方法 將雄性SD大鼠100只隨機(jī)分為5組：正常組(NOR，n=20)、模型組(CKD，n=20)、三七組(RN，n=20)、三七肉桂組(RNC，n=20)、三七桔梗組(RNP，n=20)。除NOR組外均采用腺嘌呤灌胃方法建立CKD大鼠模型，建模后NOR組和CKD組予以同等體積生理鹽水灌胃，RN、RNC、RNP組予以相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)4周。4周后處死各組大鼠取血清檢測腎功能[肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)]，取腎臟組織做HE、Masson染色觀察各組大鼠腎臟組織病理損傷程度，應(yīng)用免疫組化法檢測腎臟組織纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)表達(dá)，用Westetn blot法檢測腎臟組織轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)。結(jié)果 與NOR組相比，模型組腎功能能減退，Scr、BUN顯著升高(P<0.01)，腎間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化表現(xiàn)，膠原的沉積增多(P<0.05)，腎臟組織TGF-β、α-SMA、FN、LN表達(dá)顯著升高。與模型組相比，各治療組腎功改善，Scr、BUN明顯降低(P<0.01)，腎間質(zhì)纖維化程度降低，膠原的沉積減少(P<0.05)，腎組織α-SMA、TGF-β、FN、LN表達(dá)有所回降。其中RNC組作用強(qiáng)于RN組和RNP組。結(jié)論 三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七均能不同程度延緩腺嘌呤所致CKD大鼠腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程，其可能機(jī)制是降低TGF-β蛋白表達(dá)。

腎間質(zhì)纖維化 ；慢性腎臟疾??；轉(zhuǎn)化生長因子；三七； 肉桂； 桔梗

慢性腎臟疾病(chronic kidney diseases，CKD)是嚴(yán)重危害人類健康的常見、多發(fā)疾病，腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)展到終末期的共同途徑和主要病理機(jī)制。腎臟纖維化過程涉及多種細(xì)胞生物學(xué)和分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)是主要的致腎臟纖維化因子，TGF-β能調(diào)控多種細(xì)胞的生長、分化、凋亡甚至自噬。相關(guān)研究[1-2]表明TGF-β過度表達(dá)使腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，進(jìn)而導(dǎo)致腎小管和腎小球的炎癥及硬化，在慢性腎臟病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。中醫(yī)中藥在腎臟疾病治療中有很好的療效。艾娜等[3]在最新一項臨床研究中發(fā)現(xiàn)，三七復(fù)方結(jié)合西醫(yī)基礎(chǔ)治療能明顯提高CKD 3期患者總有效率，改善生活質(zhì)量。但其具體改善腎臟病的分子機(jī)制未明，因此本研究通過建立腺嘌呤誘導(dǎo)的CKD大鼠模型，觀察三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七對CKD大鼠腎功能、腎臟纖維化及TGF-β蛋白的影響，進(jìn)一步探討三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七對腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠100只，購于西南醫(yī)科大學(xué)SPF動物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量200～250 g，10～16周。三七組藥物由三七10 g組成；三七肉桂組藥物由三七10 g、肉桂10 g組成；三七桔梗組藥物由三七10 g、桔梗10 g組成。藥物的購買、質(zhì)檢和制備由西南醫(yī)科大附屬中醫(yī)院中藥制劑室協(xié)助完成。各藥物組均制備成濃縮劑備用，由專人負(fù)責(zé)一次性制備完成。經(jīng)煮沸、過濾、濃縮至每毫升藥液含生藥2.5 g。免疫組化SP劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TGF-β抗鼠單克隆抗體購自Cell Signaling Technology 公司，F(xiàn)N抗鼠單克隆抗體、α-SMA抗兔單克隆抗體、LN抗兔單克隆抗體均購自Abcam公司。

1.2 動物分組、模型建立及處理 動物隨機(jī)分成5組：正常組(NOR，n=20)、模型組(CKD，n=20)、三七組(RN，n=20)、三七肉桂組(RNC，n=20)、三七桔梗組(RNP，n=20)。CKD組和RN、RNC、RNP組參照文獻(xiàn)[4]采用腺嘌呤(300 mg/kg)灌胃4周的方法建立大鼠CKD模型，建模后RN、RNC、RNP組予以相應(yīng)藥物(3 mL/d)灌胃，NOR組和CKD組予以同等體積生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。于藥物干預(yù)后4周分別處死各組大鼠，留取血清檢測腎功能；同時收集腎臟標(biāo)本，部分于4%多聚甲醛溶液中固定并用石蠟包埋，部分置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 腎臟功能指標(biāo)測定 腔靜脈采血3 mL，離心后取上層血清，采用全自動生物化學(xué)儀(Beckman CX7，美國)檢測尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。

1.3.2 腎臟病理及纖維化改變 采用HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織病理改變。Masson染色操作按照常規(guī)方法。取Masson染色組織切片參考Mizuguchi等[5]的方法，每個切片選取10個不重復(fù)的400倍視野以藍(lán)色膠原沉積為陽性信號，應(yīng)用Image Pro Plus Software 6.0 圖像分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析，計算腎間質(zhì)膠原沉積面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值，并取平均值。

1.3.3 免疫組化法測定腎臟α-SMA、纖維連接蛋白(FN)、層黏連蛋白(LN)蛋白表達(dá) 腎組織常規(guī)脫水、包埋、切片后，采用SP法按照實(shí)驗(yàn)試劑盒操作說明書檢測大鼠腎臟組織中FN、LN蛋白表達(dá)。DAB染色、蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片。 陽性的FN、LN蛋白在細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核中呈棕黃色顆粒。

1.3.4 Western-blot測定腎臟TGF -β蛋白表達(dá) 抽提腎臟組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。所得蛋白于100 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h,洗膜3次，每次10 min；加兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃慢搖過夜；洗膜3次，每次10 min；加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶3 000)37 ℃ 1 h，洗膜；加鼠抗大鼠TGF -β多克隆抗體(1∶1 000)4 ℃慢搖過夜，洗膜3次，每次10 min；加HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG(1∶3 000)37 ℃ 1 h，洗膜；ECL放射自顯影。顯影結(jié)果使用Quantity One軟件進(jìn)行光密度(OD)值分析，結(jié)果用GAPDH校正。

2 結(jié) 果

2.1 腎功能檢測 實(shí)驗(yàn)至藥物干預(yù)第4周時，CKD、RN、RNP、RNC組大鼠Scr、BUN均較NOR組明顯升高(P<0.01)。RN、RNP、RNC與CKD組比較，各指標(biāo)均有明顯降低(P<0.01)，說明應(yīng)用RN、RNP、RNC后，均能降低血Scr、BUN，改善腎功能，見表1。

表1 各組大鼠腎功能指標(biāo)比較±s)

a：P<0.01，與NOR組比較；b：P<0.01，與CKD組比較。

2.2 腎臟病理損傷及纖維化程度

2.2.1 腎臟HE染色觀察 NOR組大鼠腎小管排列整齊，腎間質(zhì)無異常改變，無纖維組織增生，腎小管管腔內(nèi)無結(jié)晶物沉積；CKD組可見大量腎小管上皮細(xì)胞脫落或空泡樣變性，高度擴(kuò)張的腎小管與萎縮的腎小管并存，還可見腎小球明顯萎縮，腎小管內(nèi)有蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化增生，腎間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞浸潤。RN、RNP、RNC組腎小管輕度擴(kuò)張、腎小球萎縮、腎間質(zhì)輕度纖維化，病變程度均較CKD組輕，見圖1。

2.2.2 Masson染色腎間質(zhì)纖維化面積的定量分析 Masson染色腎間質(zhì)纖維化面積百分比分別為NOR組11.72%±4.06%，CKD組63.21%±18.17%,RN組45.21%±12.16%,RNP組48.78%±11.34%,RNC組31.16%±10.4%。CKD組的纖維化面積最大，所占腎間質(zhì)的百分比最高，與NOR組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RN、RNP、RNC組腎間質(zhì)中纖維化面積所占百分比均顯著低于CKD組(P<0.05)，見圖2。

2.3 免疫組化檢測腎臟FN、LN蛋白表達(dá)

2.3.1 NOR組大鼠FN在腎小球、腎小管基膜上表達(dá)，F(xiàn)N在間質(zhì)幾乎不表達(dá)，CKD組腎小球、腎小管間質(zhì)中大量表達(dá)，相對于CKD組，各治療組FN表達(dá)均有所下降，RNC組下降最明顯，見圖3。

2.3.2 NOR組大鼠LN在腎小球、腎小管間質(zhì)幾乎不表達(dá)。CKD組腎小球硬化或黏連處有表達(dá)，腎小管間質(zhì)中大量表達(dá)，相對于CKD組，各治療組LN表達(dá)均有所下降，RNC組下降最明顯，見圖4。

2.4 Western blot檢測腎臟TGF-β和α-SMA蛋白表達(dá)

2.4.1 NOR組腎組織TGF-β微量表達(dá)，CKD組表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與CKD組相比，各治療組TGF-β表達(dá)均有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中RNC組下降最為明顯，見圖5。

2.4.2 NOR組腎組織α-SMA幾乎不表達(dá)，CKD組表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與CKD組相比，各治療組α-SMA表達(dá)均有所降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中RNC組下降最為明顯，見圖5。

A：NOR組；B：CKD組；C：RN組；D:RNP組；E:RNC組。

圖1 各組大鼠腎臟組織HE染色(×200)

A：NOR組；B：CKD組；C：RN組；D:RNP組；E:RNC組。

圖2 各組大鼠腎臟組織Masson染色(×200)

A：NOR組；B：CKD組；C：RN組；D：RNP組；E：RNC組。

圖3 各組大鼠腎臟組織FN表達(dá)(×400)

A：NOR組；B：CKD組；C：RN組；D：RNP組；E：RNC組。

圖4 各組大鼠腎臟組織LN表達(dá)(×400)

**：P<0.01，與NOR組比較；*：P<0.05，與CKD組比較。

圖5 各組大鼠腎臟組織TGF -β和α-SMA蛋白表達(dá)

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是由各種病因引起的慢性腎臟疾病,逐漸進(jìn)展至終末期腎衰竭(end-stage renal disease，ESRD)的共同通路，其病理改變主要為腎單位的進(jìn)行性破壞，同時大量成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生堆積而導(dǎo)致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭。因此，抑制腎間質(zhì)的纖維化，阻斷纖維化發(fā)展的通路，對CKD的治療有十分重要的意義。越來越多的證據(jù)表明細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路在細(xì)胞因子的介導(dǎo)下導(dǎo)致腎纖維化。其中，TGF-β是主要的致腎臟纖維化的因子，TGF-β信號系統(tǒng)調(diào)控著各種慢性腎小球損傷的一系列的病理生理過程，介導(dǎo)腎小球的硬化、腎間質(zhì)纖維化。有研究表明，在糖尿病狀態(tài)下，腎臟內(nèi)過多的ROS可使TGF-β信號通路(non-Smad)激活，活化的TGF-β進(jìn)入細(xì)胞核，通過轉(zhuǎn)錄因子而影響致纖維化因子的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，最終促進(jìn)ECM過度沉積而形成腎纖維化。在本研究中，筆者也發(fā)現(xiàn)TGF-β蛋白的表達(dá)在CKD大鼠的腎臟組織中明顯升高，腎間質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重纖維化表現(xiàn)，膠原的沉積增多，α-SMA、FN、LN表達(dá)顯著升高，且出現(xiàn)明顯的腎功能減退。這說明TGF-β信號傳導(dǎo)通路可能是腎臟纖維化、慢性腎臟病進(jìn)展的重要因素之一，針對TGF-β信號通路活化作為靶點(diǎn)的治療手段，可能成為延緩腎臟病進(jìn)展的重要措施。

CKD的中醫(yī)藥防治已經(jīng)成為中西醫(yī)結(jié)合延緩腎臟疾病進(jìn)展的普遍臨床應(yīng)用及研究熱點(diǎn)，而腎間質(zhì)纖維化作為其主要病理基礎(chǔ)，是中醫(yī)藥防治慢性腎臟病的主要切入點(diǎn)。

目前已有關(guān)于中醫(yī)藥通過調(diào)控TGF-β信號通路改善腎臟纖維化的研究。最近一項關(guān)于TGF-β信號通路的研究進(jìn)一步闡述了其在腎間質(zhì)纖維化的作用及慢性腎病炎癥的分子機(jī)制。TGF-β信號通路在調(diào)節(jié)腎臟組織的炎性反應(yīng)、改善降低腎小球和腎間質(zhì)炎性反應(yīng)損傷的同時刺激了細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟組織的沉積，進(jìn)而導(dǎo)致進(jìn)行性的腎纖維化。TGF-β還可促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞也會導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎組織的沉積[6]。來自體內(nèi)外的研究證據(jù)證明利用中和TGF-β抗體、核心蛋白聚糖、反義寡核苷酸阻斷TGF-β可以預(yù)防或改善腎纖維化。三七在臨床上應(yīng)用于慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、糖尿病腎病及慢性腎衰竭等各種腎臟疾病的治療，取得了良好的療效。其有效成分三七總皂苷可通過抑制腎組織TGF-β信號通路以及降低致纖維化細(xì)胞因子及炎癥因子蛋白表達(dá)水平，減輕腎小球和腎間質(zhì)炎性反應(yīng)，從而改善UUO大鼠腎纖維化。本研究中三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七均下調(diào)了CKD大鼠腎組織TGF-β的表達(dá)，改善了腎功能，減少了膠原的沉積，降低了腎組織α-SMA、FN、LN表達(dá)，改善了CKD大鼠的腎間質(zhì)纖維化。

引經(jīng)、歸經(jīng)理論是中醫(yī)理論體系的重要組成部分。引經(jīng)藥指藥物對機(jī)體某部分的選擇性作用，即某些藥對某些臟腑、經(jīng)絡(luò)有特殊的親和作用，因而對這些部位的病變起著主要或者特殊的治療作用[7]。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)來看中醫(yī)的引經(jīng)理論與西醫(yī)的載體學(xué)說有著相似之處。引經(jīng)藥作為藥物的定向載體，把藥物送到或介導(dǎo)至作用點(diǎn)或靶器官，既充分發(fā)揮了對作用點(diǎn)或靶器官的治療作用，又避免了對其他器官的毒副作用。目前已有研究[8-9]從中醫(yī)歸經(jīng)和引經(jīng)理論出發(fā)，利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)驗(yàn)證了三七和引經(jīng)藥物介導(dǎo)的三七復(fù)方對UUO所致的大鼠腎間質(zhì)纖維化的抑制作用。本研究中RNC組的療效優(yōu)于RN組及RNC組，也從一定程度上揭示了引經(jīng)藥物的靶向治療作用。

因此，三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七可能同樣通過調(diào)控TGF-β信號通路起到改善腎臟纖維化作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這一猜想。相關(guān)研究[10]及本研究發(fā)現(xiàn)，在使用三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七干預(yù)之后，能明顯降低CKD大鼠血肌酐和尿素氮，且減輕大鼠腎臟纖維化水平以及病理損傷。同時，對TGF-β的測定發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)后CKD大鼠腎臟組織內(nèi)TGF-β的蛋白表達(dá)水平均有下降，這說明三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七對CKD的腎纖維化產(chǎn)生保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與其對TGF-β抑制所致的纖維化水平降低存在密切聯(lián)系。

綜上所述，筆者認(rèn)為三七及引經(jīng)藥介導(dǎo)的三七能通過抑制TGF-β的活化，有效地減輕CKD的腎纖維化，減輕腎臟病理損傷，延緩腎功能損傷進(jìn)展。TGF-β在腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，抑制TGF-β的活化有望成為延緩腎臟纖維化的一條良好途徑，且為中醫(yī)藥延緩CKD提供較好的理論基礎(chǔ)。

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Research on radix notoginseng for improving CKD rat renal fibrosis*

XuYing1,WangLi2,JiLinmei1,ShenHongchun3,ChengSijing3,FanJunming4,5△,WenDan6

(1.DepartmentofNephrology，AffiliatedHospital,SouthwestMedicalUniversity，Luzhou,Sichuan646000,China; 2.ResearchCenterofIntegratedChineeandWesternMedicine,AffiliatedHospitalofIntegratedChineeandWesternMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;3.CollegeofIntegratedChineeandWesternMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;4.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;5.NationalKeyLaboratoryofBiotherapy,SichuanUniversity,Sichuan610041,China6.SouthwestMedicalUniversity,Luzhou，Sichuan646000,China)

Objective To investigate the effects of notoginseng and guiding medicinals mediated notoginseng for improving the renal interstitial fibrosis in rats with chronic kidney disease(CKD)by regulating TGF-β signaling pathway.Methods A total of 100 male SD rats were randomly divided into five groups:normal group(NOR,n=20),model group(CKD,n=20),radix notoginseng group(RN,n=20),radix notoginseng plus platycodi group(RNP)and radix notoginseng plus cinnamon group(RNC,n=20).Except for the NOR group,the CKD rat model in other groups was established by adenine gavage.After modeling,the NOR group and CKD group were given the same volume of normal saline by gavage,while the group RN,RNP and RNC were given corresponding drugs by gavage,for 4 weeks.After 4 weeks,the rats in each group were sacrificed for collecting serum and detecting the renal function(serum Scr,BUN),the renal tissues were taken for conducting HE and Masson staining.Then the renal tissue pathological damage severity was observed.The expressions of FN and LN in kidney tissue were detected by immunohistochemistry and the expressions of TGF-β,α-SMA were detected by Western blot method.Results Compared with the NOR group,the model group exhibited the renal dysfunction(P<0.01),renal interstitial severe fibrosis manifestation and increased collagen deposition(P<0.05),and the expression of kidney tissues α-SMA(P<0.01),TGF-β(P<0.01),FN and LN were significantly increased.Compared with the model group,the renal function in various treatment groups was improved,Scr(P<0.01)and BUN(P<0.01)were significantly decreased,the renal interstitial fibrosis degree was reduced,collagen desposition was decreased(P<0.05),renal tissue α-SMA(P<0.05),TGF-β(P<0.05),FN and LN expression were reduced to some extent,in which the effect of RNC group was stronger than that of the RN group and RNP group.Conclusion Notoginseng and guiding medicinals mediated notoginseng can retard the progression of renal interstitial fibrosis caused by adenine in CKD rat in varying degrees,its mechanism maybe reduce the expression of TGF -β protein.

renal interstitial fibrosis ;chronic renal disease;TGF -β;radix notoginseng;cinnamon;platycodi

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.006

四川省瀘州市科技局基金資助項目(2013LZLY-J09、2013COLZ-S20);四川省科技項目(14ZC0027)。 作者簡介：徐穎(1990-)，碩士，主要從事慢性腎臟疾病的相關(guān)研究。△

R692

A

1671-8348(2016)33-4625-04

2016-03-26

2016-05-10)