蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性及其與榕母管薊馬毒力的相關(guān)性

黃 鵬，余德億，姚錦愛(ài)，黃夢(mèng)雪

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，福建 福州 350013)

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蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性及其與榕母管薊馬毒力的相關(guān)性

黃 鵬，余德億，姚錦愛(ài)，黃夢(mèng)雪

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，福建 福州 350013)

【目的】 探討蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性與菌株對(duì)榕母管薊馬毒力的相關(guān)性，為榕母管薊馬優(yōu)質(zhì)高效生防菌株的初步篩選提供參考。【方法】 室內(nèi)觀察蠟蚧輪枝菌V07、V16063、V3450和Vp28 4株菌株的生物學(xué)特性，測(cè)定其對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的毒力，通過(guò)逐步回歸分析探討兩者間的相關(guān)性。【結(jié)果】 4株蠟蚧輪枝菌菌株的生物學(xué)特性存在異同，產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高，但V3450菌株生長(zhǎng)速度最快，孢子GT50最短；V16063和Vp28菌株生長(zhǎng)速度較快，孢子GT50較短；V07菌株生長(zhǎng)速度最慢，孢子GT50最長(zhǎng)。榕母管薊馬成蟲(chóng)受供試菌株侵染后的死亡趨勢(shì)均隨菌劑濃度升高和侵染時(shí)間延長(zhǎng)而上升，但不同菌劑中的變幅則明顯不同，侵染致死效果依次為V3450>V16063>Vp28>V07，LT50依次為V3450

蠟蚧輪枝菌；生物學(xué)特性；榕母管薊馬；成蟲(chóng)毒力

榕母管薊馬(Gynaikothripsficorum(Marchal))隸屬于纓翅目(Thysanoptera)薊馬科(Thripidae)，是出口盆栽榕樹(shù)上的主要害蟲(chóng)[1-4]。目前，該蟲(chóng)的防控偏重于使用化學(xué)農(nóng)藥[5-7]，易造成“3R”和藥害問(wèn)題。生物防治是一種安全、有效、持久的控害方法，且蟲(chóng)生真菌挖掘利用已是害蟲(chóng)生防的重要發(fā)展方向之一[8]。蠟蚧輪枝菌(Lecanicilliumlecanii(Zimmermann) Zare & Gams)是一種地理分布和寄主范圍均比較廣泛的昆蟲(chóng)病原真菌，在國(guó)內(nèi)外已有一些高效菌株被篩選用于西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis(Pergande))[9-10]、棕櫚薊馬(ThripspalmiKarny)[11]和煙薊馬(T.tabaciLindeman)[12]等的生物防治，但有關(guān)榕母管薊馬高效防控菌株的篩選尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于蠟蚧輪枝菌的來(lái)源多樣性及其對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)的毒力大小不同，若將每種不同來(lái)源的菌株依次對(duì)榕母管薊馬進(jìn)行毒力測(cè)定，不僅篩選工作量大，而且受供試蟲(chóng)源飼養(yǎng)時(shí)間的制約，因此，有必要尋找一種相對(duì)簡(jiǎn)便且有效的初篩方法，先淘汰部分低效或無(wú)效的菌株，再通過(guò)毒力測(cè)定最終篩選出對(duì)榕母管薊馬具有控制和應(yīng)用潛能的優(yōu)質(zhì)高效菌株，以提高篩選效率。目前，有研究人員通過(guò)建立菌株生物學(xué)特性與毒力的回歸方程，分析他們之間的相關(guān)性，分別證實(shí)球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Balsamo) Vuillemin)對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)(DendrolimuspunctatusWalker)和小菜蛾(Plutellaxylostella(L.))的毒力與產(chǎn)孢量呈極顯著相關(guān)[13-14]，玫煙色棒束孢(Isariafumosorosea(Wize) Brown et Smith)對(duì)小菜蛾的致病力與菌株生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率呈極顯著相關(guān)[15]，這表明蟲(chóng)生真菌的某些生物學(xué)特性可作為評(píng)判菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)毒力大小的初篩指標(biāo)。但目前有關(guān)通過(guò)建立回歸方程，分析蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性與菌株對(duì)榕母管薊馬毒力的相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以蠟蚧輪枝菌V07、V16063、V3450和Vp28為供試菌株，室內(nèi)觀察這些菌株的生物學(xué)特性，并測(cè)定其對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的毒力，再通過(guò)逐步回歸分析探討兩者間的相關(guān)性，為榕母管薊馬優(yōu)質(zhì)高效生防菌株的初步篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蠟蚧輪枝菌V07、V16063、V3450和Vp28菌株由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供，菌種保存與活化均采用察氏培養(yǎng)基；供試榕母管薊馬成蟲(chóng)采集于福建省漳州市漳浦縣的盆栽榕樹(shù)種植基地，在溫度(26±2) ℃、相對(duì)濕度(60±5)%、光周期L∶D =8∶16、光照強(qiáng)度(10 000±50) lx條件下，用特制養(yǎng)蟲(chóng)瓶(專利號(hào)：ZL 2012 1 0018430.7)和當(dāng)年新抽垂葉榕嫩枝條(枝條上有3張以上嫩葉)飼養(yǎng)13～15代，建立穩(wěn)定種群后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試菌株活化 取保存的4株蠟蚧輪枝菌菌株接種到9 cm的察氏培養(yǎng)基平板上，置于溫度(25±1) ℃、相對(duì)濕度(90±5)%、光周期L∶D=14∶10、光照強(qiáng)度(2 000±50) lx的光照培養(yǎng)箱(HGZ-150型，上?；厶﹥x器制造有限公司)內(nèi)活化培養(yǎng)10 d，備用。

1.2.2 供試菌株生物學(xué)特性觀察 用無(wú)菌打孔器分別在4株活化菌株的培養(yǎng)皿內(nèi)打取直徑5 mm的菌苔，菌絲面朝下接種于直徑9 cm的察氏培養(yǎng)基平板上，每株菌株各接5個(gè)培養(yǎng)皿，置于與1.2.1節(jié)相同光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天下午15:00采用十字交叉法測(cè)量每株菌株菌落直徑的增長(zhǎng)量，連續(xù)測(cè)量10 d，計(jì)算每株供試菌株的生長(zhǎng)速度。然后往每個(gè)培養(yǎng)皿中加入10 mL的0.05%吐溫-80無(wú)菌水作為潤(rùn)濕劑洗脫并收集分生孢子，經(jīng)3層脫脂紗布過(guò)濾除去菌絲和雜質(zhì)得孢子原液，在400倍的倒置生物顯微鏡(BDS300型，重慶奧特光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)下，用紐鮑爾血細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量。再將每株菌株的5份孢子原液均稀釋300倍，各取1 mL孢子懸浮液均勻涂布于5份2%水瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于相同條件的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3 h用400倍的倒置生物顯微鏡隨機(jī)觀察每個(gè)培養(yǎng)基3個(gè)視野，每個(gè)視野至少20個(gè)孢子，以孢子的芽管長(zhǎng)度大于或等于孢子短軸直徑為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù)，15 h后計(jì)算4株菌株的孢子萌發(fā)率并估測(cè)孢子萌發(fā)中時(shí)(GT50)。

1.2.3 供試菌株對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的毒力測(cè)定 取活化后的4株供試菌株，參照1.2.2節(jié)洗脫并收集分生孢子，計(jì)算孢子原液的濃度，再用無(wú)菌水將每份孢子原液分別稀釋成1.00×104，1.00×105，1.00×106，1.00×107和1.00×108mL-15個(gè)處理濃度，以0.05%吐溫-80無(wú)菌水為對(duì)照，共6個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。取直徑9 cm的培養(yǎng)皿，依次鋪入1片相同直徑的花泥和濾紙，花泥厚0.5 cm、吸水8 mL，在濾紙上再放1片帶葉柄的垂葉榕嫩葉，葉柄用濕棉花包裹并與濾紙緊貼，共72個(gè)培養(yǎng)皿，每株菌株分得18個(gè)培養(yǎng)皿，均勻分成6組。用軟毛筆刷挑取同一日齡的榕母管薊馬成蟲(chóng)，每株菌株每個(gè)處理90頭，在各自處理液中浸泡10 s，待蟲(chóng)體略干時(shí)再挑到葉片上，每皿挑30頭后用保鮮膜封口，并用0.27 mm的昆蟲(chóng)針在保鮮膜上密扎細(xì)孔通氣；將培養(yǎng)皿置于與1.2.1節(jié)相同的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天下午15:00觀察、記錄死亡數(shù)，連續(xù)觀察10 d，并將死亡蟲(chóng)體挑入察氏培養(yǎng)基平板上，再置于相同條件的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、觀察，以死亡蟲(chóng)體長(zhǎng)出菌絲計(jì)為有效感染，統(tǒng)計(jì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的死亡數(shù)，計(jì)算累計(jì)校正死亡率，估測(cè)每株菌株的致死中時(shí)(LT50)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理軟件，采用Tukey檢驗(yàn)法對(duì)4株蠟蚧輪枝菌菌株生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率進(jìn)行多重比較；采用機(jī)率值分析法，估測(cè)比較4株供試菌株孢子的GT50及菌株對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的LT50；采用逐步回歸分析法，分析供試菌株生物學(xué)特性與其對(duì)榕母管薊馬毒力(1.00×108mL-1處理)的相關(guān)性，構(gòu)建最優(yōu)回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 4株蠟蚧輪枝菌菌株的生物學(xué)特性

由表1可知，V16063、V3450和Vp28菌株生長(zhǎng)較快，菌株生長(zhǎng)速度在4.68～4.94 mm/d，相互間差異不顯著；V07菌株生長(zhǎng)最慢，與其他3株菌株的差異顯著。4株菌株產(chǎn)孢量均很多，每皿達(dá)4.25×109～6.04×109，其中V3450菌株最多，其他依次為V16063、Vp28和V07菌株，菌株間略存差異，但差異不顯著。4株菌株孢子萌發(fā)率均很高，達(dá)95.91%～97.07%，其中Vp28菌株最高，其他依次為V3450、V07和V16063菌株，菌株間略存差異，但差異不顯著。V3450菌株孢子GT50最短，為5.86 h，顯著低于其他3株菌株；V07菌株孢子GT50最長(zhǎng)，與其他3株菌株差異顯著。

表 1 4株蠟蚧輪枝菌菌株的生物學(xué)特性

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each column mean significant difference (P<0.05).

2.2 4株蠟蚧輪枝菌對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的毒力

2.2.1 榕母管薊馬成蟲(chóng)受供試菌株侵染后的死亡趨勢(shì) 由圖1可知，榕母管薊馬成蟲(chóng)受4株蠟蚧輪枝菌菌株侵染后的死亡趨勢(shì)均隨菌劑濃度升高和侵染時(shí)間延長(zhǎng)而上升，但不同菌劑中榕母管薊馬成蟲(chóng)累計(jì)校正死亡率大小及死亡趨勢(shì)的變幅則明顯不同。對(duì)Vp28、V3450和V16063菌株，榕母管薊馬成蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率均在接菌3～4 d后呈現(xiàn)快速遞增，7～8 d后趨于平緩，10 d后1.00×107和1.00×108mL-1處理的累計(jì)校正死亡率，以V3450菌株最高(77.11%～85.54%)，V16063菌株位居其次(75.90%～78.31%)，Vp28菌株位居第3(66.26%～74.70%)。而對(duì)V07菌株，榕母管薊馬成蟲(chóng)的累計(jì)校正死亡率雖在接菌3～4 d后也開(kāi)始遞增，但遞增速度較緩，6～7 d后就趨于平緩，10 d后1.00×107和1.00×108mL-1處理的累計(jì)校正死亡率分別為43.37%和54.22%，僅是其他3株菌株的56.24%～65.45%和63.39%～72.58%。

2.2.2 供試菌株對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的LT50由表2可知，1.00×104mL-1處理濃度，4株供試菌株的LT50均較長(zhǎng)(9.38～13.30 d)，其中以V3450菌株最短，其他依次為Vp28、V07和V16063菌株，且相互間差異不顯著。1.00×105和1.00×106mL-1處理濃度，4株供試菌株的LT50略有變短(8.50～11.69 d和7.23～10.09 d)，仍以V3450菌株最短，其他則依次為Vp28、V16063 和V07菌株，且相互間存在差異但不顯著。1.00×107和1.00×108mL-1處理，4株供試菌株的LT50均明顯變短，但還是以V3450菌株最短(5.72 d和5.17 d)，V16063菌株位居其次(5.77 d和5.54 d)，Vp28菌株位居第3(6.38 d和5.86 d)；V07菌株最長(zhǎng)，且與其他3株菌株差異顯著。

圖 1 榕母管薊馬成蟲(chóng)受4株蠟蚧輪枝菌菌株侵染后的死亡趨勢(shì)

表 2 4株供試菌株對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的LT50

注：同行數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each row mean significant difference (P<0.05).

2.3 蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性與其對(duì)榕母管薊馬毒力的相關(guān)性

由表3可知，在逐步回歸分析過(guò)程中，蠟蚧輪枝菌4個(gè)生物學(xué)指標(biāo)對(duì)菌株毒力的作用水平不同。其中產(chǎn)孢量(x2)和孢子萌發(fā)率(x3)對(duì)累計(jì)校正死亡率(y1)和LT50(y2)的作用不顯著(F=0.00)，而被剔除；菌株生長(zhǎng)速度(x1)和孢子GT50(x4)對(duì)累計(jì)校正死亡率(y1)和LT50(y2)的作用則達(dá)顯著水平(F≥28.34)，被引入后得2個(gè)最優(yōu)回歸方程y1=-1 434.001 7+217.937 5x1+75.604 1x4和y2=175.829 8-23.811 1x1-9.053 5x4，相關(guān)系數(shù)分別高達(dá)0.999 3和0.996 2，且顯著性檢驗(yàn)均達(dá)顯著水平(P<0.05)。同時(shí)，由方程變量的偏相關(guān)分析可知，累計(jì)校正死亡率與菌株生長(zhǎng)速度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與孢子GT50呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；LT50與菌株生長(zhǎng)速度和孢子GT50均呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

表 3 蠟蚧輪枝菌生物學(xué)特性與其對(duì)榕母管薊馬毒力的相關(guān)性

注：x1、x2、x3和x4分別表示菌株生長(zhǎng)速度、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和GT50，y1和y2分別表示累計(jì)校正死亡率和LT50。

Note:x1,x2,x3,x4,y1andy2are mean strains growth rate,sporulation quantity,conidia germination rate, conidia GT50,corrected accumulative mortality and LT50,respectively.

3 結(jié)論與討論

菌株生物學(xué)特性是影響蟲(chóng)生真菌毒力的主要因素之一。雷妍圓等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌對(duì)小菜蛾的致病力與菌株產(chǎn)孢量呈極顯著相關(guān)，玫煙色棒束孢對(duì)小菜蛾的致病力與菌株生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率呈極顯著相關(guān)；黃大慶等[13]和王成樹(shù)等[16]研究發(fā)現(xiàn)，球孢白僵菌菌株對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)的LT50與菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)中時(shí)呈極顯著相關(guān)；Altre等[17]發(fā)現(xiàn)，玫煙色擬青霉(Paecilomycesfumosoroseus(Wize) Brown et Smith)對(duì)小菜蛾的致病力與菌株孢子的萌發(fā)中時(shí)呈顯著正相關(guān)。這些研究均表明，蟲(chóng)生真菌生長(zhǎng)速度快慢、產(chǎn)孢量大小、孢子萌發(fā)率高低和萌發(fā)速度快慢與菌株毒力存在一定的相關(guān)性，可作為評(píng)判菌株對(duì)目標(biāo)害蟲(chóng)毒力大小的初篩指標(biāo)。本研究以4株蠟蚧輪枝菌為供試菌株，室內(nèi)觀察其生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)供試菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高，但V3450菌株生長(zhǎng)速度最快、孢子GT50最短，V16063和Vp28菌株生長(zhǎng)速度較快、孢子GT50較短，V07菌株生長(zhǎng)速度最慢、孢子GT50最長(zhǎng)；同時(shí)測(cè)定這些菌株對(duì)榕母管薊馬成蟲(chóng)的毒力，發(fā)現(xiàn)V3450菌株侵染致死效果最好、LT50最短，V16063和Vp28菌株侵染致死效果較好、LT50較短，V07菌株侵染致死效果最差、LT50最長(zhǎng)。通過(guò)逐步回歸分析探討菌株生物學(xué)特性與毒力的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，菌株毒力與其生長(zhǎng)速度和孢子GT50顯著相關(guān)，菌株生長(zhǎng)越快、孢子萌發(fā)越快，毒力越高，這與黃大慶等[13]、雷妍圓等[14-15]、王成樹(shù)等[16]和Altre等[17]的部分研究結(jié)果一致；而菌株毒力與產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率未呈顯著相關(guān)，這可能是由于供試菌株的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高且差異不顯著的緣故。因此，在供試菌株產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率均很高時(shí)，菌株生長(zhǎng)速度和孢子GT50可作為評(píng)判蠟蚧輪枝菌對(duì)榕母管薊馬毒力大小的初篩指標(biāo)。

蟲(chóng)生真菌對(duì)寄主的致病和致死是一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程，受菌株生物學(xué)特性和生化特性的共同影響，是多方因子聯(lián)合作用的結(jié)果[13，18-19]，因此今后有必要進(jìn)一步探討蠟蚧輪枝菌胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和脂肪酶活性水平等生化特性與菌株對(duì)榕母管薊馬毒力的相關(guān)性，從中篩選出若干生化指標(biāo)，豐富、完善該菌的初篩指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高效菌株的快速初篩，為利用蟲(chóng)生真菌防控榕母管薊馬等害蟲(chóng)提供更多的支持。

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Correlation between biological characteristics ofLecanicilliumlecaniiand the virulence againstGynaikothripsficorum

HUANG Peng,YU Deyi,YAO Jin’ai,HUANG Mengxue

(InstituteofPlantProtection,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou,Fujian350013,China)

【Objective】 This study explored the correlation between biological characteristics ofLecanicilliumlecaniiand the virulence againstGynaikothripsficorumto provide reference for preliminary screening of high quality and efficient entomogenous fungi againstG.ficorum.【Method】 The biological characteristics of fourL.lecaniistrains (V07,V16063,V3450 and Vp28) were observed and the virulence againstGynaikothripsficorumwas determined.Then,the correlation was analyzed by stepwise regression analysis.【Result】 There were similarities and differences among biological characteristics of fourL.lecaniistrains.They all had high sporulation quantity and conidia germination rate.Strain V3450 had the fastest growth rate and the shortest conidia GT50.Strains V07 had the slowest growth rate and the longest conidia GT50.Growth speed and conidia GT50of strains V16063 and Vp28 were in middle.The death trend ofG.ficorumadults increased with the increase of concentration and infection time.The sequence of infection lethal effect was V3450>V16063>Vp28>V07 while the sequence of LT50was V3450

Lecanicilliumlecanii;biological characteristics;Gynaikothripsficorum;adult virulence

時(shí)間:2016-10-09 10:08

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.11.025

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161009.1008.050.html

2015-04-27

福建省科技重大專項(xiàng)(2013NZ0002-4)；福建省屬公益優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目(2014R1024-1)；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J01110)；福建省科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目(2015C0027)

黃 鵬(1984-)，男，福建莆田人，助理研究員，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治研究。E-mail：roc_huang@yeah.net

余德億(1972-)，男，福建浦城人，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治研究。E-mail：yudy_2004@126.com

S476.12；S436.8+5

A

1671-9387(2016)11-0172-06