三個道地產區(qū)丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后bc1-2、bax表達的影響*

李紅剛 王紅鴿 聶曉楓 孫 陳衛(wèi)銀 陜西省渭南職業(yè)技術學院(渭南714000)

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三個道地產區(qū)丹參混合提取物對大鼠腦缺血再灌注后bc1-2、bax表達的影響*

目的：通過觀察四川、山東、河南三個道地產區(qū)丹參混合提取物對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2和bax蛋白表達的影響，探討三產區(qū)丹參對神經細胞凋亡的影響。方法：采用頸內動脈線栓加環(huán)扎法制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24h后各組bc1-2和bax蛋白的表達采用免疫組化法檢測。結果：再灌注24h后，模型組腦內損傷區(qū)周圍bcl-2的表達明顯增加(P<0.05)，三產區(qū)丹參組均能明顯上調bcl-2的表達，與模型組比較有顯著差異(P<0.05)，其中山東丹參組上調的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異(P<0.05)，河南、四川丹參組比較無顯著差異(P>0.05)；再灌注24h后，模型組腦內損傷區(qū)周圍bax的表達顯著增加(P<0.01)，三產區(qū)丹參組均能明顯降低bax的表達，與模型組比較有顯著差異(P<0.01)，其中四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，三組比較均有顯著差異(P<0.05)。結論：三個道地產區(qū)丹參混合提取物均能通過上調bcl-2表達，降低bax的表達，從而抑制神經細胞凋亡，發(fā)揮腦保護作用。不同產區(qū)丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

丹參是常用活血化瘀藥，其對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的影響報道較多，但查閱文獻，未見不同產地丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型影響的報道。本研究選取四川、河南、山東三個道地產區(qū)丹參混合提取物，旨在觀察不同產區(qū)丹參對大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織bc1-2、bax表達的影響，從而探討其對神經細胞凋亡的影響。

1 材料和方法 1.1 動 物 健康SD大鼠60只(購于四川大學)，合格證號：scxk(川)-10-2006，雌雄各半，體重275.25±24.28g，清潔級，鼠齡7～8周。

1.2 藥品與試劑 采取四川中江古店、山東沂南、河南方城栽培丹參根10kg，樣品采集后快速運回實驗室，經加工處理后，干燥成藥材，由成都中醫(yī)藥大學藥學院提取制成0.4g/ml生藥的供試品溶液。兔抗大鼠bcl-2單克隆抗體、兔抗大鼠bax單克隆抗體 ( 購買自北京博奧森生物技術有限公司)；生物素化羊抗兔IgG抗體(購買自北京中衫金橋生物技術有限公司)。

1.3 造模及分組 大腦中動脈閉塞(MCAO)模型制備方法，采用頸內動脈線栓加環(huán)扎法。將60只大鼠按數字隨機法分為：正常組、假手術組、模型組、四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組，每組10只。正常組：不給予任何干預措施；假手術組：先切開右側頸部皮膚，然后暴露右側頸總動脈分叉，隨后再縫合皮膚，術前5d生理鹽水灌胃，1次/d，術后2h生理鹽水再灌胃1次；模型組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d生理鹽水灌胃，1次/d，再灌注后2h時生理鹽水再灌胃1次；四川丹參組、山東丹參組、河南丹參組：MCAO造模90min后再灌注，造模前5d分別予四川、山東、河南丹參混合提取物灌胃，1次/d，再灌注后2h再灌胃1次。再灌注24h后處死大鼠。根據人與動物用量體表面積換算法計算，實驗中丹參混合提取物的灌胃劑量為6.75ml/kg。

1.4 HE及免疫組織化學檢測方法 病理組織切片標本收集及處理：實驗各組SD大鼠，再灌注后24h灌注取腦并固定，固定72h后做成石蠟切片，每個標本各取1張用于HE染色。應用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法進行，一抗為兔抗大鼠bcl-2、bax單克隆抗體，二抗為生物素化羊抗兔IgG抗體,封片后再采用光鏡觀察。陽性細胞計數和統(tǒng)計學分析:免疫組化染色結果拍照后進行半定量分析，并計算陽性細胞的積分光密度值IOD。采用SPSS19.0進行數據統(tǒng)計，采用單因素方差分析比較各組間數據，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，以P<0.01為極顯著統(tǒng)計學差異。

2 結 果 2.1 各組腦組織光鏡下的HE染色結果 如圖所示，正常組和假手術組細胞與間質之間界限清楚，細胞核完整，核仁清晰；模型組細胞與間質之間界限不清楚，大部分組織細胞壞死，多數細胞溶解呈空泡狀，可見核固縮和核碎裂；三產區(qū)丹參各組腦組織細胞壞死程度較模型組輕，可見少量細胞核固縮及溶解，部分胞質液化。

2.2 免疫組化染色的結果 2.2.1 bcl-2蛋白免疫組化染色的結果:正常組和假手術組腦內bcl-2表達較少，二者無顯著差異；模型組腦內損傷區(qū)周圍bcl-2的表達增加，與正常組、假手術組比較P<0.05；三產區(qū)丹參組均能明顯上調腦內損傷區(qū)周圍bcl-2的表達，與模型組比較P<0.05；山東丹參組上調腦內損傷區(qū)bcl-2的幅度最大，與河南、四川丹參組比較有顯著差異P<0.05，河南、四川丹參組比較無顯著差異P>0.05，見表1。免疫組化染色見圖2。

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：河南丹參組；E：四川丹參組；F：山東丹參組

表1 各組Bcl-2的IOD值

2.2.2 bax蛋白免疫組化染色結果：正常組、假手術組腦內bax表達較少，二者無顯著差異；模型組腦內損傷區(qū)周圍bax的表達顯著增加，與正常組、假手術組比較P<0.01；三產區(qū)丹參組均能明顯降低腦內損傷區(qū)周圍bax的表達，與模型組比較P<0.01；四川丹參組降低腦內損傷區(qū)周圍bax的幅度最大、山東丹參組次之，河南丹參組降低的幅度最小，山東、河南丹參組與四川丹參組相比P<0.01，河南丹參組與山東丹參組相比P<0.05，見表2。免疫組化染色見圖3。

表2 各組Bax的IOD值

A：正常組；B：假手術組；C：模型組；D：四川丹參組；E：山東丹參組；F：河南丹參組

3 討 論 3.1 缺血性腦血管病與活血化瘀 缺血性腦血管病屬于中醫(yī)“中風”范疇，對中風病因病機的認識,歷代醫(yī)家一般認為不外乎與瘀、虛、火、風、痰有關。其中瘀阻腦絡是卒中的病理基礎[1]，血蓄于腦是卒中病的病理中心，血瘀證候存在中風病各證型和階段之中。所以，活血化瘀是治療中風的基本治法。目前，活血化瘀藥多種制劑已廣泛應用于臨床治療腦血管病[2]，且療效較為滿意，同時對活血化瘀藥治療卒中的機理研究也在不斷深入。

3.2 腦缺血再灌注與細胞凋亡 腦缺血再灌注(Cerebra ischemia and reperfusion，CIR)是指腦缺血一段時間后，再恢復其血液供應的過程。多數研究表明，腦缺血再灌注后腦缺血性的損傷反而會加重。腦缺血再灌注后細胞壞死和細胞凋亡并存，缺血中心區(qū)主要是細胞壞死，是不可逆的；而細胞凋亡主要出現(xiàn)在缺血灶周圍區(qū)即缺血半暗帶，是可逆的，因此，腦缺血再灌注后神經細胞凋亡已成為研究的熱點。

3.3 三個道地產區(qū)丹參活性成分的研究 關于丹參藥材的道地產區(qū)，郭寶林等考證[3]歷史上河南、山東、湖北和山西等幾個省都曾被視為丹參的道地產區(qū)。近代以來,川產丹參被視為佳品,其在《中國道地藥材》中被列為道地藥材?？偨Y以上文獻記載，丹參道地產區(qū)主要有四川、河南、山東、山西及湖北等5個產地。多數研究表明，不同產地丹參中丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大。本研究所選用四川中江古店、山東沂南、河南方城三個道地產區(qū)丹參,經成都中醫(yī)藥大學嚴鑄云教授等[4-5]測定丹參酮ⅡA、丹酚酸和丹參素等活性成分的含量差別較大，與多數文獻報道結果相似。

3.4 三個道地產區(qū)丹參混合提取物對bcl-2、bax表達的影響 Bcl-2、bax是目前研究較多的一對凋亡調控基因。Bcl-2基因，即B細胞淋巴瘤-2基因(B cell lymphoma-2，Bcl-2)，該基因最初在血淋巴細胞中被發(fā)現(xiàn)。近年來，多數研究也發(fā)現(xiàn)，bcl-2基因是抑制細胞凋亡的重要基因之一，它在腦缺血再灌注損傷中表達，而且起重要作用[6]。Bax是1993年在人前B細胞基因文庫發(fā)現(xiàn)的一種基因，其作用與bc1-2相反，可抑制bcl-2的功能。以往的研究也顯示[7-8]，局灶性腦缺血后，bax蛋白表達明顯增加，其能與bcl-2蛋白形成異源二聚體，從而抑制bcl-2的功能，促進細胞凋亡?？梢?，Bcl-2和bax基因對腦細胞凋亡起重要作用，Bcl-2和bax表達水平的高低與細胞凋亡的嚴重性有直接關系。若bcl-2升高，則抑制細胞凋亡；而bax升高，則促進細胞凋亡。

河南、山東、四川三個道地產區(qū)丹參混合提取物均能明顯提高bcl-2表達，降低bax表達，表明三產區(qū)丹參混合提取物通過上調bcl-2、下調bax的表達而抑制神經細胞凋亡，從而改善缺血再灌注損傷而發(fā)揮腦保護作用。同時發(fā)現(xiàn)，三個道地產區(qū)丹參混合提取物對bax和bcl-2表達的影響不同，對bax的表達，四川丹參組降低的幅度最大，山東丹參組次之，河南丹參組再次之；對bcl-2的表達，山東丹參組上調的幅度大于河南和四川丹參組，河南和四川丹參組無明顯差異。

綜上，三個道地產區(qū)丹參混合提取物均能影響bcl-2、bax的表達，抑制神經細胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護作用；不同產區(qū)丹參混合提取物對各指標表達影響不同，其原因可能與不同產區(qū)丹參混合提取物所含活性成分的含量不同，作用靶點不一致有關。

[1] 屈 沂．益氣活血通絡湯治療缺血性腦中風療效觀察[J]．陜西中醫(yī)，2015，36(7)：818-819．

[2] 李海軍，甄志剛，王 磊，等. 參芎葡萄糖注射液治療急性腦梗死50例[J].陜西中醫(yī)，2014，35(3)：306-307．

[3] 郭寶林,林 生,馮毓秀，等. 丹參主要居群的遺傳關系及道地藥材道地性的研究[J].中草藥,2002,33(12)：1113-1116．

[4] 楊新杰,萬德光,林貴兵，等．丹參脂溶性成分的地域分布特點分析[J]．中草藥，2010，41(5)：809-812.

[5] 楊新杰，萬德光，劉 敏，等．丹參水溶性成分的地域分布特點分析[J]．天然產物研究與開發(fā)，2011，23：684-688.

[6] 李新崇，阮立新，黃其川，等．黃連堿對腦缺血/再灌注大鼠的影響及其機制研究[J]．中國臨床藥理學與治療學，2015，20(9)：1004-1007．

[7] 張玉淼，王紅蓮，周宏斌，等．丹參川芎嗪注射液對缺血性腦卒中患者血流變及外周血BCL-2、BAX、Caspase-3蛋白水平的影響[J]．中藥材，2015，38(9)：2003-2005．

[8] 陳 鋒，陽生光，李建軍，等．血塞通對全腦缺血/再灌注后大鼠海馬回中Bcl-2及Bax的影響[J]．臨床醫(yī)學工程，2015，22(11)：1426-1427．

(收稿2016-06-18；修回2016-07-29)

*陜西省渭南職業(yè)技術學院課題(WZYY201322)

再灌注 丹參(中藥) 大鼠 腦缺血 細胞凋亡 動物實驗

R743

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.056

△通訊作者：成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經內科(成都610072)