菖葛益智方對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5表達(dá)的影響*

周曉俊 邊 瑩 李 莉 尚俊平 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

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菖葛益智方對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5表達(dá)的影響*

周曉俊 邊 瑩 李 莉△尚俊平 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(咸陽 712000)

目的：通過菖葛益智方對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5的表達(dá)影響，探討菖葛益智方防治血管性認(rèn)知障礙的分子機(jī)制。方法：采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞法，制備血管性認(rèn)知障礙大鼠模型。所有大鼠共6組，正常對(duì)照組，模型組，假手術(shù)組，菖葛益智方大劑量組、菖葛益智方中劑量組、菖葛益智方小劑量組，每組10只。灌胃6周。檢測(cè)大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5的含量。結(jié)果：正常對(duì)照組occludin和claudin-5的表達(dá)豐富，模型組occludin和claudin-5表達(dá)明顯減弱。菖葛益智方小劑量組與對(duì)照組相比，occludin、claudin-5表達(dá)沒有明顯改變；菖葛益智方大劑量組occludin、claudin-5的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加。結(jié)論：菖葛益智方可以促進(jìn)occludin和claudin-5合成及表達(dá)，使血腦屏障的通透性得以降低。

血管性認(rèn)知功能障礙(Vascular cognitive impairment,VCI)指由腦血管病或者腦血管因素引起的認(rèn)知障礙，如果能夠及早進(jìn)行干預(yù)治療，多數(shù)可以緩解病情進(jìn)展，改善其臨床癥狀[1]。缺血性卒中引起腦組織的缺血缺氧，導(dǎo)致的組織能量耗竭，從而啟動(dòng)并加重腦組織損傷[2]。腦功能的實(shí)現(xiàn)主要依靠神經(jīng)細(xì)胞，近年來，神經(jīng)細(xì)胞不可逆損傷機(jī)制是人們研究探索的熱點(diǎn)，并因此產(chǎn)生較多的神經(jīng)保護(hù)策略，但至今也沒有一致認(rèn)可的療效顯著的神經(jīng)保護(hù)藥物[3]。

菖葛益智方主要由石菖蒲、葛根、巴戟天、郁金、遠(yuǎn)志五味中藥組成，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)菖葛益智方能明顯改善血管性認(rèn)知障礙患者中醫(yī)證候，為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制及藥理作用,本研究進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn),為菖葛益智方的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 藥品與試劑 菖葛益智方由石菖蒲、葛根、郁金、遠(yuǎn)志、巴戟天五味中藥材組成。所有藥材均購(gòu)自陜西中藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定。藥物稱好后，水煎制成混懸液，-4℃冰箱保存?zhèn)溆谩D大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。occludin和claudin-5抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich(中國(guó))公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 造模前將大鼠隨機(jī)分成6組，分別為正常對(duì)照組，模型組，假手術(shù)組，菖葛益智方大劑量組、菖葛益智方中劑量組、菖葛益智方小劑量組，每組10只。

1.3 VCI大鼠模型的制備 清潔級(jí)Wistar雄性大鼠共計(jì)60只，全部大鼠于造模之前均行水迷宮測(cè)試，并且祛除先天愚型的大鼠。應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈閉塞法進(jìn)行造模。具體方法為：應(yīng)用10%的水合氯醛溶液，以400mg / kg 的量進(jìn)行腹腔麻醉，然后取仰臥位，行頸部中切口，于顯微鏡下進(jìn)行雙側(cè)頸總動(dòng)脈分離，并進(jìn)行永久性結(jié)扎。

1.4 給 藥 灌胃量全部按體表面積法計(jì)算，按照SD大鼠160g等量于成人60kg，大鼠每日用藥量等于每日成人藥量×6.562/346.68，并以換算后的大鼠等效劑量作為小劑量組，其5倍劑量為中等劑量組，10倍量為大劑量組。所有大鼠從實(shí)驗(yàn)前1周開始，菖葛益智方組應(yīng)用菖葛益智方藥液灌胃，1d1次。模型組給予等劑量的NS灌胃，1d1次。

1.5 血腦屏障(BBB)的通透性滲出量檢測(cè) 用生理鹽水配制2%EB，以2mg/kg的總量靜脈給藥。每組大鼠均為8只，取材前24h由尾靜脈緩慢注射2.5%EB。之后24h后取腦，應(yīng)用生理鹽水沖洗直至液體清澈，然后用濾紙吸干，并稱其重量，而后浸泡于5 ml甲酰胺中，50攝氏度水浴中孵育72h，移出溶液，以2000轉(zhuǎn)/min的速度離心5min，取上清。而后，在UV300紫外可見光分光光度計(jì)下，620nm波長(zhǎng)處檢測(cè)EB甲酞胺中的OD值，定量分析計(jì)算樣本腦組織中EB的含量。純甲酞胺溶液作為空白對(duì)照組。

1.6 用免疫組化法測(cè)定缺血腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5的表達(dá) 應(yīng)用水合氯醛將大鼠麻醉之后，沿著胸骨左緣剪開大鼠的胸腔，灌注預(yù)冷生理鹽水，速度控制在每分鐘10ml，待沒有血污之后以每分鐘5～10ml的速度滴注4%多聚甲醛，至250ml，斷頭取腦；將其放至于4%多聚甲醛后固定24h，依次放入濃度為15%、20%、30%的蔗糖溶液中進(jìn)行脫水；OTC包埋，用冰凍切片機(jī)將其按冠狀連續(xù)切成厚度為10μm的薄片，隨之進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化結(jié)果應(yīng)用Motic Images Advanced3.2圖像分析系統(tǒng)采集照片，然后進(jìn)行定量分析總結(jié)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件包(SPSS Inc.Chicago,IL)處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以Mean±SD表示，組間比較應(yīng)用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果 2.1 血腦屏障的通透性滲出量結(jié)果 應(yīng)用EB滲透性評(píng)估血腦屏障通透性的變化,發(fā)現(xiàn)各組大鼠在缺血0min、30min腦組織未見染藍(lán)，60min呈現(xiàn)缺血部位的腦組織限局性藍(lán)染，120min缺血部位腦組織藍(lán)染較前明顯加重；菖葛益智方大劑組大鼠在缺血60min、120min缺血部位的藍(lán)染程度較對(duì)照組明顯減輕。缺血腦組織EB含量變化(見表1)。在模型對(duì)照組內(nèi)，缺血30min組與0min組比較，EB的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與缺血0min組比較，缺血60min組、120min組腦組織EB的含量均高于0min組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。菖葛益智方大、中、小組0min組和30min組的腦組織EB含量與對(duì)照組0min組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,菖葛益智方的60min、120min組的EB量與對(duì)照組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 缺血腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5的表達(dá) 對(duì)照組occludin和claudin-5的表達(dá)豐富、連續(xù)(見圖1)。模型組occludin和claudin-5表達(dá)明顯減弱。菖葛益智方小劑量組與對(duì)照組缺血相比,occludin、claudin-5表達(dá)沒有明顯改變;菖葛益智方大和大劑量組occludin、claudin-5的表達(dá)與對(duì)照組相比明顯增加。

表1 血腦屏障的通透性滲出量結(jié)果

A正常對(duì)照組;B 模型對(duì)照組;C 假手術(shù)組;D 菖葛益智方小劑量組;E 菖葛益智方中劑量組;F 菖葛益智方大劑量組

A正常對(duì)照組;B 模型對(duì)照組;C 假手術(shù)組;D 菖葛益智方小劑量組;E 菖葛益智方中劑量組;F 菖葛益智方大劑量組

3 討 論 缺血性腦血管病的病理生理血改變主要原因?yàn)槲⒀軆?nèi)皮細(xì)胞損傷。本課題組經(jīng)長(zhǎng)期臨床研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆病因病機(jī)多因痰瘀互結(jié)，損傷腦絡(luò)，閉阻心竅所致。菖葛益智方主要由石菖蒲、葛根、遠(yuǎn)志、郁金、巴戟天五味中藥組成，方中石菖蒲具有祛風(fēng)宣濕、理氣活血之功效;葛根祛邪扶正之效;石菖蒲、葛根共為君藥，共奏豁痰活血、祛邪扶正之功。遠(yuǎn)志具有安神益智，祛痰解郁之效;郁金具有行氣解郁，涼血破瘀;遠(yuǎn)志、郁金為臣藥，起到活血祛痰之效。巴戟天具有補(bǔ)腎助陽、強(qiáng)筋健骨之效，以之相佐，可兼治臟腑虛損，達(dá)到標(biāo)本兼治的目的。據(jù)現(xiàn)代臨床藥理研究表明，石菖蒲在鎮(zhèn)靜、促進(jìn)學(xué)習(xí)、認(rèn)知、抗癡呆等方面具有一定的療效[4]；葛根提取物葛根素能夠增加缺血腦組織中氧濃度，從而促進(jìn)血管性疾呆的學(xué)習(xí)、記憶功能的恢復(fù)[5]。郁金對(duì)缺血缺氧性小鼠的腦組織具有保護(hù)作用[6]；遠(yuǎn)志提取物能夠提高機(jī)體的抗氧化能力[7]；巴戟天中巴戟素[8]可以增加腦內(nèi)乙酰膽堿的合成、釋放，記憶相關(guān)的神經(jīng)通路的傳導(dǎo)及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，能夠提高癡呆大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力。菖葛益智方是基于對(duì)血管性癡呆病因病機(jī)認(rèn)識(shí)的基礎(chǔ)上研制成防治VaD的有效方劑，在前期臨床發(fā)現(xiàn)，菖葛益智方能明顯改善血VCI患者中醫(yī)證候、行為能力以及認(rèn)知能力，能起到顯著阻斷血管性損害[4]。但是，菖葛益智方發(fā)揮其防治血管性認(rèn)知障礙的分子機(jī)制尚不明確。本研究采用血管性認(rèn)知功能障礙大鼠模型，研究菖葛益智方對(duì)血管性認(rèn)知功能障礙大鼠腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞occludin和claudin-5的表達(dá)的影響，以期闡明菖葛益智方是通過發(fā)揮其防治血管性認(rèn)知障礙的分子機(jī)制。該研究表明，菖葛益智方可以促進(jìn)occludin和claudin-5合成與表達(dá),從而保護(hù)BBB的完整性,降低了BBB的通透性，體現(xiàn)出了中醫(yī)藥具有多層次、多靶點(diǎn)的整體優(yōu)勢(shì),值得進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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(收稿2016-06-08；修回2016-07-02)

*陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(2013JK0832)

認(rèn)知障礙/中醫(yī)藥療法 @菖葛益智方 大鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

R743.9

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2016.11.051

△上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院(上海201966)