長鏈非編碼RNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用

陶詩聰 郭尚春 張長青

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長鏈非編碼RNA在骨關(guān)節(jié)炎中的作用

陶詩聰 郭尚春 張長青

長鏈非編碼RNA(LncRNA)在軟骨發(fā)育及骨關(guān)節(jié)炎(OA)病理進程中起到了重要的調(diào)控作用。LncRNA可以調(diào)控軟骨細胞增殖、分化和凋亡，影響軟骨細胞外基質(zhì)分泌，通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶分泌影響軟骨細胞外基質(zhì)降解，參與軟骨炎癥反應(yīng)，在軟骨退行性變的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。該文就LncRNA在OA發(fā)生發(fā)展中的作用作一綜述。

長鏈非編碼RNA；骨關(guān)節(jié)炎；表觀遺傳

隨著人類基因組計劃的順利完成，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性遠遠超過以往的認知。人類轉(zhuǎn)錄組分為翻譯蛋白質(zhì)的編碼RNA(即信使RNA，mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)，它們在生理和病理情況下都發(fā)揮著重要的功能[1]。人類基因組中只有1.5%的序列被轉(zhuǎn)錄成mRNA，而大多數(shù)轉(zhuǎn)錄為ncRNA。ncRNA一度被視為沒有功能的RNA，但隨著研究的深入，學(xué)者們認識到ncRNA在疾病進程中也發(fā)揮著相當重要的作用[2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是ncRNA的亞類，長度大于200個核苷酸，在細胞的多種功能中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[3]。大部分LncRNA表達量較低，常位于核內(nèi)，較mRNA有更強的組織特異性、細胞類型特異性和亞細胞分布特異性[1,4]。

關(guān)節(jié)軟骨是一種透明軟骨，其來源于中胚層的間充質(zhì)干細胞(MSC)[5]，由MSC增殖、分化為軟骨細胞，并分泌細胞外基質(zhì)(ECM)。軟骨ECM主要由Ⅱ型膠原、蛋白多糖、蛋白聚糖組成[6]。骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種關(guān)節(jié)軟骨慢性退行性病變，它可以由衰老、肥胖、心血管疾病、糖尿病、機械損傷等原因引起[7]。近年來LncRNA在調(diào)控軟骨分化及OA進程中的作用初步展現(xiàn)，可作為未來治療OA的潛在靶點。

1 LncRNA命名與分類

學(xué)者們根據(jù)功能和特征對LncRNA進行命名[8]，例如抗分化非編碼RNA(DANC)、骨形成蛋白-2與成骨蛋白-1應(yīng)答基因(BORG)、X失活特異轉(zhuǎn)錄物(XIST)、轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)同源異形盒A轉(zhuǎn)錄本 (LncRNA-HIT)、同源異形盒轉(zhuǎn)錄本反義RNA(HOTAIR)、同源異性盒A末端轉(zhuǎn)錄本(HOTTIP)、特異性生長抑制基因5(GAS5)、軟骨損傷相關(guān)長鏈非編碼RNA(LncRNA-CIR)、機械應(yīng)力相關(guān)長鏈非編碼RNA(LncRNA-MSR)、母系印跡表達轉(zhuǎn)錄本(H19)、p50相關(guān)環(huán)氧化酶-2基因外RNA(PACER)、軟骨細胞炎癥相關(guān)基因間長鏈非編碼RNA(CILinc，包括CILinc01和CILinc02)、母系表達基因3(MEG3)、減數(shù)分裂增多2-相似假基因2(PMS2L2)、心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄本(MIAT)[9-19]。

根據(jù)GENCODE分類可將功能、特征不明確的LncRNA分為5種亞類(圖1)[20-21]。①反義：序列覆蓋mRNA的外顯子序列，但來自于反義鏈，命名方式為對應(yīng)基因名加“-AS”后綴，例如HIF1A-AS1、ZBED3-AS1、KCNK15-AS1。②基因間長鏈非編碼RNA(LincRNA)：來自編碼基因間隔區(qū)的LncRNA，用“Linc”命名，例如LINC00152、LINC01589、LincRNA-UFC1[22]。③覆蓋：此Lnc-RNA序列包含1個編碼或非編碼基因，命名方式為包含的基因名加“-OT”后綴，例如SOX2-OT。④內(nèi)含：此LncRNA序列屬于1個基因的內(nèi)含子，命名以所在基因名加“-IT”后綴，例如SPRY-IT1。⑤加工轉(zhuǎn)錄物：此LncRNA沒有開放閱讀框(ORF)，且不屬于上述4種亞類。

對于功能、特征不明確且暫未歸類的LncRNA，可使用Ensembl數(shù)據(jù)庫提供的真核生物基因組自動詮釋系統(tǒng)來命名，稱為ENSG編號，例如ENSG00000260114。

除規(guī)范命名外，部分LncRNA還擁有別名，例如ENSG00000260114的別名為CTD-2574D22.4、KCNK15-AS1的別名為RP11-445H22.4、LINC01589的別名為CTA-941F9.9。

圖1 LncRNA的GENCODE分類

2 LncRNA特點

近年來，學(xué)者們通過轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn)LncRNA比mRNA具有更加特異的表達譜，在不同的細胞、組織之間以及不同的發(fā)育階段、疾病的不同階段均具有不同的表達[23-25]。同時，LncRNA表達譜與mRNA表達譜密切相關(guān)，提示LncRNA很可能是基因表達網(wǎng)絡(luò)中的共調(diào)控基因[26]。

許多LncRNA具有特異的亞細胞定位(圖2)，例如XIST位于失活的X染色體、MIAT位于亞核結(jié)構(gòu)域[27]、BORG位于細胞核[28]、GAS5位于細胞質(zhì)[29]。

圖2 常見的LncRNA定位

3 LncRNA作用機制

LncRNA可以通過一級結(jié)構(gòu)、二級機構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)來發(fā)揮各種功能。它通過折疊成獨特的構(gòu)象并與DNA、RNA或蛋白發(fā)生相互作用來調(diào)控基因表達(圖3)。

3.1 對轉(zhuǎn)錄過程進行調(diào)控

LncRNA對轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控如下。①調(diào)控RNA聚合酶Ⅱ[30]：LncRNA與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合后，抑制其與DNA相結(jié)合過程，從而抑制轉(zhuǎn)錄。②調(diào)控轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體[31]：LncRNA通過結(jié)合于編碼基因的上游啟動子區(qū)域干擾轉(zhuǎn)錄前起始復(fù)合體形成，從而抑制轉(zhuǎn)錄。

3.2 對細胞核結(jié)構(gòu)進行調(diào)控

LncRNA對細胞核結(jié)構(gòu)的調(diào)控如下。①對染色質(zhì)進行修飾[32]：LncRNA通過形成染色質(zhì)修飾復(fù)合體對染色質(zhì)中的組蛋白進行修飾(甲基化、乙?；?，增強或抑制修飾的染色質(zhì)區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性。②調(diào)控核小體重塑[33]：真核生物細胞核中，DNA環(huán)繞著由4種組蛋白組成的八聚體，形成核小體結(jié)構(gòu)，緊密狀態(tài)下的DNA無法執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能，而核小體重塑過程將DNA從核小體上松解開，以便完成轉(zhuǎn)錄功能，LncRNA在核小體重塑過程中發(fā)揮重要作用，從而參與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控。③構(gòu)成亞核結(jié)構(gòu)域[34-35]：在細胞分裂間期，LncRNA參與亞核結(jié)構(gòu)域的形成，并通過亞核結(jié)構(gòu)域影響轉(zhuǎn)錄。

3.3 通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控

LncRNA通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控過程如下。①激活轉(zhuǎn)錄因子[36-37]：LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強轉(zhuǎn)錄因子對目標DNA片段的親和力，從而促進下游基因轉(zhuǎn)錄。②抑制轉(zhuǎn)錄因子[38]：LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，干擾轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，從而抑制下游基因轉(zhuǎn)錄。③影響轉(zhuǎn)錄因子核內(nèi)外穿梭[39]：LncRNA與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，抑制其向核內(nèi)穿梭，從而抑制轉(zhuǎn)錄因子下游基因轉(zhuǎn)錄。

3.4 對微小RNA和mRNA進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控

LncRNA競爭性結(jié)合微小RNA(miRNA)，抑制miRNA與目標mRNA結(jié)合，稱作LncRNA誘導(dǎo)的miRNA沉默，此LncRNA被稱為內(nèi)源性競爭RNA(ceRNA)，又被稱為“miRNA海綿”。LncRNA可與特定mRNA的5’端特定區(qū)域結(jié)合，促進mRNA與翻譯因子結(jié)合，從而促進mRNA翻譯。LncRNA也可結(jié)合于特定mRNA的3’端特定區(qū)域，降低mRNA穩(wěn)定性并促進mRNA降解，抑制mRNA功能[40]。

圖3 LncRNA作用機制

4 LncRNA與軟骨分化

目前對于信號通路、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA在MSC向軟骨分化及軟骨ECM生成中所起作用的研究相對較多[41-42]，而LncRNA在其中的作用也開始逐漸受到關(guān)注。

如今在胚胎組織成軟骨中同源異形盒(HOX)基因相關(guān)LncRNA作用受到的關(guān)注日益增多。其中，LncRNA-HIT在未分化的四肢MSC中表達，定位于核內(nèi)，募集核因子-κB p100亞基(p100)/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)復(fù)合體，并啟動成軟骨分化。通過小干擾RNA(siRNA)沉默LncRNA-HIT，使MSC聚集并顯著降低成軟骨能力。這表明LncRNA-HIT在四肢成軟骨過程中發(fā)揮著無法取代的重要作用[11]。

在成體多能干細胞成軟骨研究中，LncRNA的作用也被初步揭示。性別決定區(qū)Y框蛋白4(SOX4)在滑膜間充質(zhì)干細胞(SMSC)的增殖和軟骨分化中發(fā)揮重要作用，但其作用機制尚未明確。Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，SOX4通過激活LncRNA-DANCR發(fā)揮功能，若阻斷LncRNA-DANCR，SOX4則失去促SMSC增殖和成軟骨的功能。

通過高通量檢測，結(jié)合生物信息學(xué)分析，對不同組織、不同發(fā)育階段、不同生理或病理條件、疾病發(fā)展不同階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，可得到差異表達基因、基因功能歸類注釋、基因相互作用網(wǎng)絡(luò)、代謝及信號通路等結(jié)果，從而預(yù)測基因功能。對LncRNA的功能預(yù)測可進一步通過靶基因預(yù)測、未知LncRNA預(yù)測、LncRNA與mRNA高通量檢測結(jié)果整合并行共表達網(wǎng)絡(luò)分析實現(xiàn)。

有研究[44]報道，經(jīng)基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，在成軟骨分化過程中有2 166個LncRNA顯著上調(diào)，1 472個LncRNA顯著下調(diào)；對其中ZBED3-AS1和LINC01589進行共表達網(wǎng)絡(luò)分析和靶點預(yù)測，結(jié)果顯示這2個LncRNA與成軟骨中起重要作用的mRNA密切相關(guān)。此高通量研究篩選出在軟骨分化過程中可能發(fā)揮功能的候選LncRNA，但需進一步研究驗證并深入探討作用機制。

5 LncRNA與OA

在OA進程中，生長因子、細胞因子、趨化因子、炎癥、氧化應(yīng)激和代謝相關(guān)研究已較為詳盡[45]，但目前仍未找到能夠延緩OA進展的有效方法。近來有研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA的表觀遺傳修飾在OA中發(fā)揮重要作用，例如LincRNA-UFC1通過充當“miRNA海綿”，沉默miR-34a，阻斷其對軟骨增殖的抑制作用。表觀遺傳修飾改變在OA進展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但僅僅是通過細胞因子和簡單的對癥治療難以逆轉(zhuǎn)OA進展。而LncRNA可通過甲基化或乙?；瘜M蛋白進行修飾，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性[22,46-47]。因此，利用LncRNA的表觀遺傳干預(yù)能力，有望研制出靶向治療藥物。

5.1 參與軟骨破壞

研究顯示，HOX基因相關(guān)LncRNA在OA發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。HOTAIR在白細胞介素(IL)-1β誘導(dǎo)的OA細胞模型中明顯上調(diào)，而敲低HOTAIR可抑制由IL-1β誘導(dǎo)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、MMP-9生成，同時能明顯降低IL-1β導(dǎo)致的細胞凋亡[12]。HOTAIR可能是連接炎性因子與軟骨破壞之間的橋梁，以HOTAIR為靶點，有希望獲得針對軟骨的抗炎藥，取代普遍使用、有較多不良反應(yīng)的糖皮質(zhì)激素。在OA進展中HOTTIP明顯上調(diào)，它可抑制整合素α1的表達，破壞軟骨細胞與ECM間的連接，導(dǎo)致軟骨破壞[13]。在OA軟骨中GAS5明顯上調(diào)，GAS5可抑制miRNA-21而促進MMP(包括MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13)和含血小板反應(yīng)蛋白基序的金屬蛋白酶系統(tǒng)(ADAMTS)-4表達，促進細胞凋亡，同時抑制自噬反應(yīng)[14]。LncRNA-CIR通過促進MMP-13和ADAMTS-5表達參與軟骨ECM降解[15]。機械應(yīng)力也是加速OA進程的因素，它可導(dǎo)致LncRNA-MSR上調(diào)，并破壞軟骨[16]。機械應(yīng)力對軟骨的刺激始終存在，且可持續(xù)造成軟骨破壞。

5.2 保護軟骨

H19在成熟的關(guān)節(jié)軟骨細胞中受SOX9調(diào)控。H19及其衍生的miRNA-675可促進Ⅱ型膠原分泌，并維持軟骨細胞穩(wěn)定[17]。研究[48]發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境能保護關(guān)節(jié)軟骨，其中低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α可通過與β-連環(huán)蛋白相互作用保護軟骨細胞。近期研究[49]發(fā)現(xiàn)，H19衍生的miRNA-675可促進HIF-1α表達，抑制HIF-1α在有氧情況下的降解，高水平HIF-1α可起保護軟骨的作用。H19不僅能阻止軟骨破壞，還能促進軟骨ECM分泌，具有保護和修復(fù)雙重作用，擁有重要的研究價值和廣闊的應(yīng)用前景。LincRNA-UFC1具有促進軟骨細胞增殖和抑制軟骨細胞凋亡的作用，在OA軟骨中的表達量明顯減低[22]。通過核酸納米遞送系統(tǒng)[50-51]將Linc-UFC1遞送至OA軟骨，有望延緩OA進程。

5.3 其他作用

PACER、CILinc01和CILinc02在IL-1β刺激后發(fā)生顯著改變，可能參與了軟骨細胞炎癥反應(yīng)[18]，但它們在OA病程中發(fā)揮的具體功能還有待后續(xù)研究深入探討。與血管新生相關(guān)的LncRNA-MEG3在OA軟骨中的表達量明顯下降[19]，但其在OA病程中的功能還未明確，有待深入研究。

5.4 芯片預(yù)測

近年有學(xué)者通過基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)OA軟骨中有121個LncRNA發(fā)生顯著改變，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測到其中6個上調(diào)的LncRNA(HOTAIR、GAS5、PMS2L2、KCNK15-AS1、H19和ENSG00000260114)[52]。目前尚缺乏PMS2L2、KCNK15-AS1和ENSG00000260114與軟骨或OA的相關(guān)研究。

6 展望

ncRNA的發(fā)現(xiàn)改變了學(xué)者們對轉(zhuǎn)錄組的認識，miRNA研究日趨完善，但僅僅通過mRNA和miRNA尚不足以解釋生長發(fā)育和疾病發(fā)生中的各種現(xiàn)象。而LncRNA通過與mRNA、miRNA、DNA和蛋白的相互作用，實現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控，成為了近年研究熱點。但LncRNA在OA中的作用仍存在許多亟待解決的問題有待深入研究：①基因芯片研究發(fā)現(xiàn)多種LncRNA在軟骨分化中發(fā)生顯著改變，但哪些LncRNA發(fā)揮主要作用，以及其作用機制如何，目前仍未闡明；②OA發(fā)病過程中哪些表達有顯著差異的LncRNA在軟骨破壞中發(fā)揮重要作用及其具體作用機制，尚未明確；③在軟骨分化和OA進展中，可以針對哪些LncRNA進行干預(yù)，達到促進軟骨修復(fù)的目的。

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(收稿：2016-08-22; 修回：2016-10-07)

(本文編輯：盧千語)

國家自然科學(xué)基金面上項目(81572239、81472066)、國家自然科學(xué)基金青年基金(81301589)

200233， 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院骨科(陶詩聰、張長青)、上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院四肢顯微外科研究所(郭尚春、張長青)；200025， 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院(陶詩聰)

張長青 E-mail: zhangcq@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-7083.2016.06.009