AM真菌、水分和施磷水平對(duì)丹參生長及品質(zhì)的影響

齊俊香，楊曉宇，王紫月，杜天舒，李建恒

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

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AM真菌、水分和施磷水平對(duì)丹參生長及品質(zhì)的影響

齊俊香，楊曉宇，王紫月，杜天舒，李建恒

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

利用盆栽實(shí)驗(yàn)考察不同水分和施磷水平下接種AM真菌對(duì)丹參幼苗生長及品質(zhì)的影響.通過測定丹參生長量、全氮、全磷、丹參酮ⅡA和丹參多糖的含量來研究丹參幼苗的生長及品質(zhì).結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同水分及施磷水平下，接菌株的株高、根長、根冠比、全氮、全磷、丹參酮ⅡA和丹參多糖的含量顯著高于未接菌株.相同水分不同施磷水平下，隨施磷量的增加，丹參株高、根長、根冠比、全氮、全磷、丹參酮ⅡA和丹參多糖的含量均先升高后下降，在第二施磷水平(P2)為0.15 g/kg時(shí)達(dá)到最大，全氮和全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大分別為1.842%和0.354%.不同水分相同施磷水平下，接種株丹參酮ⅡA和丹參多糖的含量顯著高于未接菌株，70%田間持水量下丹參酮ⅡA和丹參多糖含量較高.70%田間持水量及施磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15 g/kg時(shí)接種株的丹參酮ⅡA和丹參多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，分別為0.252%和6.166%，較對(duì)照組分別提高0.016%和1.516%.

AM真菌；丹參；磷；丹參酮ⅡA；多糖

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)又名紫丹參，屬多年生草本植物，中藥丹參在中國應(yīng)用歷史悠久，其根與根莖是主要用藥部位，傳統(tǒng)中醫(yī)藥記載丹參的藥理作用甚廣，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等作用[1-2]，常被用于治療月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)及冠心病等癥狀.丹參主要藥用成分包括脂溶性化合物(如丹參酮ⅡA)和水溶性化合物(如丹酚酸B)，此外，還含有多糖與甾醇等活性成分[3].丹參在預(yù)防及治療某些常見病、慢性病中有著不可替代的作用，臨床需求量越來越大.目前，由于人工種植過程中種植資源退化嚴(yán)重，抗病性差，導(dǎo)致丹參品質(zhì)參差不齊，使得丹參的產(chǎn)量和品質(zhì)下降[4].因此，考察不同種植條件與丹參品質(zhì)間的相關(guān)性，有利于選擇丹參合理栽培條件，為菌根生物技術(shù)提高丹參產(chǎn)量與品質(zhì)方面提供理論參考.

叢枝菌根(arbuscular mycorrhiza,簡稱AM)真菌是自然界分布最為廣泛的一種土壤有益微生物，它能與大部分的陸生植物形成良好共生關(guān)系.植物根系被AM真菌包圍，在土壤中產(chǎn)生巨大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，增大了植物根系與土壤水分、養(yǎng)分的接觸面積，有利于植物根系對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收，特別是對(duì)移動(dòng)性較差的磷的吸收.AM真菌能明顯提高植株抗旱性、抗病性、抗逆能力，提高植株產(chǎn)量和品質(zhì)等作用[5-6]，促進(jìn)植物有效成分的積累等[7]，但土壤養(yǎng)分會(huì)直接影響AM真菌對(duì)植物的侵染效果[8].

磷是所有植物生長的必需營養(yǎng)元素，是細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、核甘酸和酶的組成成分[9].由于土壤中的磷多以有機(jī)態(tài)存在而無法被植物直接利用，AM真菌侵染植物后，能夠增強(qiáng)植物根系產(chǎn)生的酸性或堿性磷酸酶的活性，同時(shí)AM真菌自身也能分泌酸性或堿性磷酸酶，進(jìn)而活化土壤有機(jī)磷來改善植物對(duì)磷的吸收[10-11].Singh[7]等研究證明了接種AM真菌能改善茶葉品質(zhì)，增強(qiáng)茶葉對(duì)養(yǎng)分的吸收，提高了茶苗葉中的糖、咖啡因和總多酚等物質(zhì)的含量.賀學(xué)禮等[12]研究證明不同水肥條件下接種AM真菌能促進(jìn)丹參根系對(duì)水分和礦質(zhì)元素的吸收和利用.本實(shí)驗(yàn)考察不同水分和施磷水平下接種AM真菌對(duì)丹參生長、全氮、全磷含量及藥用成分的影響，為實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化種植及提高中藥臨床療效提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

P3000高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司).

葡萄糖、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、過氧化氫、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鉬酸銨、偏釩酸銨、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、2,4-二硝基酚、鹽酸、甲醇、丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)種子于2014年4月購自河北安國藥材市場；AM真菌優(yōu)勢(shì)菌種(雙網(wǎng)無梗囊霉)經(jīng)三葉草擴(kuò)繁，含孢子、菌絲以及侵染根段的根際土作為菌劑，每10 g菌劑含有60個(gè)孢子.

所用土壤取自保定農(nóng)田，采集深度約為20 cm；過2 mm篩后按土沙質(zhì)量比2∶1混勻；實(shí)驗(yàn)所用花盆規(guī)格為21.5 cm×16 cm×20.5 cm，施加肥料分別為CO(NH2)2、NaH2PO4和K2SO4；最大田間持水量為21%.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)分為土壤持水量、接種AM真菌和施磷量共3個(gè)因素.土壤水分設(shè)2個(gè)水平，35%的田間持水量(WHC)和70%的WHC；相同水分下施磷量設(shè)3個(gè)水平，分別為0.07、0.15和0.23 g/kg，分別用P1、P2和P3表示，相同水分及相同施磷條件下設(shè)接菌和未接菌(CK)2種處理，共12組，每組重復(fù)4次，共48盆.

2014年4月10日播種.每盆裝約3 kg土(非滅菌)，每盆加0.963 g CO(NH2)2和1.005 g K2SO4.接菌組的每個(gè)處理加入40 g菌劑，分2層施加，未接菌組加入等量的滅菌菌劑.出苗約2周后定苗，每盆3棵，待其生長2個(gè)月，2014年7月5日對(duì)植株開始進(jìn)行水分處理，通過稱重法控制土壤持水量.實(shí)驗(yàn)期間對(duì)丹參進(jìn)行日常管理，2014年9月5日收獲.

1.4 測定方法

土壤pH測定用pH計(jì)，堿解N測定用堿解擴(kuò)散法，速效P測定用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法，有機(jī)質(zhì)測定用重鉻酸鉀容量法，速效K測定用比濁法[13].待幼苗收獲后，用卷尺測量丹參的株高、主根長.全N含量用凱氏定氮法，全P含量用釩鉬黃比色法測定[14].收獲后，將根部于105 ℃條件下烘15 min殺青，在75 ℃條件下烘干至恒重，粉碎過篩后，丹參酮ⅡA含量用高效液相色譜法測定[1]，利用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化丹參多糖提取條件，并進(jìn)行方差分析和直觀分析，丹參多糖含量測定用苯酚-硫酸法[15].每個(gè)處理重復(fù)4次.

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤因子測定結(jié)果

土壤pH為8.18，有機(jī)質(zhì)為13.94 g/kg，堿解氮為62.47 mg/kg，速效磷為18.56 mg/kg，速效鉀為105.285 mg/kg.與相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)照，符合丹參的生長條件.

2.2 水分和施磷水平對(duì)丹參生長量的影響

由表1可知，P1～P2水平下，接菌株株高、根長和根冠比(35%根長除外)顯著高于未接菌株；在P3水平及35% WHC時(shí)，接菌株株高低于未接菌株，但差異不顯著(P>0.05)；接菌株根長高于未接菌株，但差異不顯著(P>0.05)；接菌株根冠比顯著高于未接菌株.在P3水平及70% WHC時(shí)，AM真菌顯著降低丹參株高、根長和根冠比，這表明土壤水分和施磷量均會(huì)影響AM真菌的侵染效果.

相同水分及不同施磷水平下，各處理丹參的株高、根長和根冠比均隨著施磷水平的增加先升高后降低，在P2時(shí)含量最大，且P2顯著高于P1和P3，接菌株大于未接菌株(70% P3除外).除35% WHC中未接菌株根冠比、根長和未接菌株株高的P1與P3水平之間差異不顯著以外，其他各施磷水平間均差異顯著(P<0.05).表明施磷量過低或過高均不利于丹參正常生長.

不同水分及相同施磷水平下，與35% WHC相比，70% WHC下丹參株高、根長與根冠比顯著提高.說明水分脅迫會(huì)阻礙丹參的根系發(fā)育，AM真菌能降低水分脅迫對(duì)丹參生長的阻礙作用.

表1 AM真菌、水分及施磷水平對(duì)丹參生長的影響

數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；* 表示同一水分和磷水平下接菌株與未接菌株差異顯著；不同大寫字母表示在70%水分下不同處理在5%水平下差異顯著；不同小寫字母表示在35%水分下不同處理在5%水平下差異顯著；顯著性差異均在5%水平下分析比較.其他表同此.

2.3 水分和施磷水平對(duì)丹參全氮及全磷含量的影響

由表2可知，P1～P2下，與未接菌株相比，接種AM真菌顯著提高了植株全氮和全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)；在P3水平下，丹參全氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在35% WHC時(shí)接菌株處理低于未接菌株，而在70% WHC時(shí)丹參全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)接菌株顯著低于未接菌株；相同水分及不同施磷水平下，全氮、全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨著施磷水平的增大先升高后降低，在P2時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，說明磷能促進(jìn)丹參對(duì)礦質(zhì)元素及養(yǎng)分的吸收和運(yùn)輸，但磷的濃度過高會(huì)影響丹參對(duì)礦質(zhì)元素的吸收.

不同水分及相同施磷水平下，與35% WHC相比，70% WHC下植株的全氮和全磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高.表明水分脅迫會(huì)抑制丹參的根系吸收礦質(zhì)元素，70%水分更有利于丹參吸收礦質(zhì)元素.

表2 AM真菌、水分及施磷水平對(duì)丹參全氮和全磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.4 水分和施磷水平對(duì)丹參酮ⅡA含量的影響

由表3可知，同一水分及施磷水平下，與未接種株相比，接種株丹參酮ⅡA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于未接菌株(35%P3除外)，且在P2及70% P1時(shí)差異顯著(P<0.05).同一水分及不同施磷水平下，丹參酮ⅡA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均隨施磷水平的增加先升高后降低，P2時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，且顯著高于P1和P3.不同水分及相同施磷水平下，70% WHC下丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，說明水分脅迫影響丹參酮ⅡA累積.分析70% WHC、P2水平下接菌株樣品的高效液相色譜圖(圖1，2)，得到丹參酮ⅡA質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為0.252%，符合中國藥典的規(guī)定(大于0.2%).

圖1 丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品溶液色譜Fig.1 Tanshinone ⅡA HPLC of standard

圖2 丹參酮ⅡA樣品溶液的色譜Fig.2 Tanshinone ⅡA HPLC of sample

土壤持水量/%接種P處理w(丹參酮ⅡA)/%土壤持水量/%接種P處理w(丹參酮ⅡA)/%35P10.224±0.014dAMP20.234±0.002d*P30.158±0.005eP10.213±0.004bCKP20.221±0.004aP30.196±0.004c*70P10.23±0.003E*AMP20.252±0.004D*P30.214±0.005FP10.219±0.003BCKP20.236±0.008AP30.208±0.003C

2.5 水分和施磷水平對(duì)丹參多糖含量的影響

本實(shí)驗(yàn)研究了溫度、時(shí)間、料液比、醇濃度4個(gè)因素對(duì)提取丹參多糖的影響，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，利用4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化丹參多糖的提取.根據(jù)表4選擇L9(34)正交表做實(shí)驗(yàn)，重復(fù)2次，結(jié)果如表5，并進(jìn)行直觀分析和方差分析(表6).按優(yōu)化后的提取工藝條件(A2B3C1D2)對(duì)不同處理下的接種株和未接種株丹參樣品進(jìn)行提取，結(jié)果如表7.

相同水分及施磷水平下，接菌株多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于未接菌株，表明AM真菌有利于丹參根部多糖的積累.相同水分及不同施磷水平下，丹參多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均會(huì)隨著施磷水平的增大先升高再降低，在P2水平時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，說明磷水平過高或過低均影響丹參多糖的積累.不同水分及相同磷水平下，與35% WHC相比，70% WHC下的丹參多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著提高.這與丹參酮ⅡA的變化規(guī)律基本一致.在70% WHC下，P2時(shí)接菌株根部多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大為6.166%.

表4 實(shí)驗(yàn)因素水平表

表5 正交實(shí)驗(yàn)的安排及結(jié)果

續(xù)表5

表6 方差分析

F0.01(2,9)=8.02，F(xiàn)0.05(2,9)=4.26，* 表示顯著，** 表示極顯著.

表7 不同水分和施磷水平下接種AM真菌對(duì)丹參多糖的影響

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AM真菌能很好地侵染丹參根系，接種AM真菌能促進(jìn)丹參對(duì)N、P等礦質(zhì)元素的吸收和藥用成分的積累.Janos[16]等研究了接種AM真菌可以明顯促進(jìn)荔枝對(duì)養(yǎng)分的吸收和促進(jìn)幼苗生長.賀學(xué)禮[17]等研究表明，AM真菌提高了黃芩生長量，促進(jìn)對(duì)N、P、K元素的吸收和黃芩苷含量的積累.本實(shí)驗(yàn)中，與未接種株相比，接種AM真菌顯著提高丹參生長量，也促進(jìn)丹參對(duì)N、P元素的吸收及丹參酮ⅡA和多糖的累積.這可能是AM真菌與丹參形成共生體后，植物根系被AM真菌包圍，在土壤中產(chǎn)生巨大的菌絲網(wǎng)絡(luò)，增大了植物根系與土壤中水分和養(yǎng)分的接觸面積，有利于根系吸收所需土壤水分和礦質(zhì)元素，改善丹參體內(nèi)營養(yǎng)狀況，從而有利于丹參健康生長.

丹參酮ⅡA和丹參多糖均為丹參的藥用成分.其含量的高低是衡量丹參藥材品質(zhì)的主要標(biāo)準(zhǔn).本實(shí)驗(yàn)中，在70% WHC，施磷量為P2時(shí)接菌株丹參酮ⅡA和丹參多糖含量最高，丹參酮ⅡA和丹參多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.252%和6.166%.本實(shí)驗(yàn)中，土壤氮磷質(zhì)量比為0.149∶0.15，這與韓建萍[18]等認(rèn)為的當(dāng)?shù)逝c磷肥的質(zhì)量比為1∶1時(shí)有利于丹參酮ⅡA累積結(jié)果基本一致.高磷或低磷均會(huì)影響丹參根系發(fā)育以及丹參對(duì)礦質(zhì)元素的吸收，這可能是磷水平過低或過高會(huì)影響AM真菌與丹參的共生關(guān)系[8]，磷水平過低不足以使丹參正常生長，也不能充分提供AM菌生長需要的磷營養(yǎng)，使菌根生長受限制；磷水平過高降低丹參根細(xì)胞膜通透性，抑制AM真菌生長發(fā)育[19]，進(jìn)而影響丹參吸收N、P及其他礦質(zhì)元素，而這些元素可能影響丹參生長及丹參酮ⅡA和丹參多糖的含量.本實(shí)驗(yàn)中，與35% WHC相比，以70% WHC下，丹參各部分生長量、全氮、全磷含量以及丹參酮ⅡA和丹參多糖含量較高，這也許是水分脅迫降低AM真菌對(duì)丹參根系的侵染進(jìn)而影響丹參吸收磷及其他養(yǎng)分[12]，而這些養(yǎng)分可能會(huì)影響丹參生長及丹參酮ⅡA和丹參多糖的合成；也可能是土壤水分直接影響丹參吸收礦質(zhì)元素及丹參酮ⅡA和丹參多糖的積累[20].

結(jié)果表明，AM真菌、土壤水分及施磷水平在丹參的生長量的增加、礦質(zhì)元素的吸收以及藥用成分的累積方面有積極作用，改善丹參品質(zhì)，這將對(duì)實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化種植具有重要意義.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Effect of AM fungi,moisture,and phosphorus levels on the growth and quality ofSalviamiltiorrhizaBge.

QI Junxiang，YANG Xiaoyu,WANG Ziyue，DU Tianshu，LI Jianheng

(College of Pharmaceutical Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

Pot experiments were conducted to study the effects of AM fungi on growth and quality ofSalviamiltiorrhizaunder different soil moisture and phosphorus levels.The plant height，root length，root shoot ration，total N，total P，tanshinone ⅡAand polysaccharide were determinated to evaluate the quality ofS.miltiorrhizaseedlings.The results showed that inoculation of AM fungi significantly increased the plant height，root length，root shoot ratio，total N，total P，tanshinone ⅡAand polysaccharide content ofS.miltiorrhizaunder the same soil moisture and phosphorus level.Under the same soil moisture and different phosphorus levels，plant height，root length，root shoot ratio，total N，total P，tanshinone ⅡAand polysaccharide content ofS.miltiorrhizaincreased first and then decreased with increasing phosphorus application rate，and they reached the maximum at second phosporus levels (P2) was 0.15 g/kg.The content of total N，total P respectively was 1.842% and 0.354%.Under different soil moisture and the same phosphorus levels，tanshinone ⅡAand polysaccharide of inoculated plants were significantly higher than non-inoculated plants.The content of tanshinone ⅡAand polysaccharide was higher at 70% WHC.With at 70% WHC and phosphorus application rate of 0.15 g/kg they reached the maximum.The maximum content of tanshinone ⅡAand polysaccharides respectively was 0.252% and 6.166%，which respectively increased 0.016% and 1.516% compared with the control group.

AM fungi;SalviamiltiorrhizaBge.;phosphorus;tanshinone ⅡA;polysaccharides

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.05.010

2015-10-25

河北大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(3333112)

齊俊香(1992—)，女，河北衡水人，河北大學(xué)在讀碩士研究生，主要從事天然植物有效成分研究. E-mail：714548328@qq.com

李建恒(1964-)，男，河北徐水人，河北大學(xué)藥學(xué)院教授，博士，主要從事天然植物有效成分研究. E-mail：lijianheng@hbu.cn

R282.71

A

1000-1565(2016)05-0509-08