AFLP引物組合數(shù)對(duì)準(zhǔn)確分析馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響

沈德周 縱 丹 周安佩 顏璐茜 李 旦 何承忠,4

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224;4. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

?

AFLP引物組合數(shù)對(duì)準(zhǔn)確分析馬纓杜鵑遺傳多樣性的影響

沈德周1,2縱 丹1,2周安佩1,2顏璐茜1,2李 旦3何承忠1,2,4

(1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 2. 西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224; 3. 西南林業(yè)大學(xué)云南生物多樣性研究院，云南 昆明 650224;4. 西南林業(yè)大學(xué)西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

利用5、7、9、11和13對(duì)AFLP引物組合對(duì)4個(gè)居群馬纓杜鵑遺傳多樣性進(jìn)行分析，探討不同引物組合數(shù)量對(duì)其遺傳多樣性參數(shù)指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：隨著引物組合數(shù)量的增加，紫溪山居群遺傳多樣性的各參數(shù)指標(biāo)變化趨勢(shì)一致， 5對(duì)引物組合檢測(cè)結(jié)果略高于其他引物組合數(shù)，但差異不顯著，其余3個(gè)居群的變化規(guī)律不明顯；不同引物組合數(shù)量對(duì)居群間遺傳距離無(wú)顯著影響，UPGMA聚類結(jié)果完全相同。由此可見(jiàn)，選用5對(duì)引物組合對(duì)馬纓杜鵑進(jìn)行遺傳多樣性分析就能夠提供較為準(zhǔn)確的結(jié)果。

馬纓杜鵑；遺傳多樣性；AFLP標(biāo)記；引物

馬纓杜鵑 (Rhododendrondelavayi)，又名馬纓花，杜鵑花科 (Ericaceae)，杜鵑屬，常綠灌木或小喬木，樹干直，最高可達(dá)12 m。葉革質(zhì)，長(zhǎng)圓狀披針形或長(zhǎng)圓狀倒批針形，長(zhǎng)7～16 cm，寬2～5 cm，側(cè)脈14～18對(duì)?；ㄐ蚨嗷芗?，有花10～20朵?；ㄝ嘈?，花冠鐘形，深紅色。蒴果長(zhǎng)圓柱形?；ㄆ?—5月，果期9—11月。在我國(guó)廣布于云南全省及貴州西部，海拔1 200～3 000 m處，生長(zhǎng)于常綠闊葉林或云南松林下，局部地區(qū)形成馬纓花純林[1]。馬纓杜鵑具有較高的觀賞、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[2-4]，吸引了眾多學(xué)者的研究目光。但馬纓杜鵑變種豐富，難以從形態(tài)學(xué)上加以鑒定區(qū)分[1]，同時(shí)存在著同名異物，同物異名的現(xiàn)象，對(duì)馬纓杜鵑良種的選育和繁育造成影響，不利于其大規(guī)模種植和加工利用[5-6]。因此，有必要對(duì)馬纓杜鵑群體間和種內(nèi)不同個(gè)體的遺傳多樣性進(jìn)行全面的調(diào)查研究，為其遺傳育種、種植資源收集及進(jìn)一步的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

遺傳多樣性是指種內(nèi)不同居群之間或同一居群內(nèi)不同個(gè)體之間的遺傳變異總和，它是物種適應(yīng)自然并發(fā)生進(jìn)化的基礎(chǔ)[7]。而能夠反映生物個(gè)體或居群間基因組中某種差異特征的DNA片段，即DNA分子標(biāo)記，可以直接反映基因組DNA之間的差異[8]。近年來(lái)，采用分子標(biāo)記技術(shù)分析物種遺傳多樣性的報(bào)道有很多，而所使用的標(biāo)記種類、標(biāo)記數(shù)量、引物數(shù)量不盡相同，如Demeke等[9]在使用RAPD技術(shù)對(duì)蕓苔屬植物進(jìn)行研究時(shí)認(rèn)為，要充分反映其親緣關(guān)系，至少需要10對(duì)引物組合；陳新露等[10]認(rèn)為至少13對(duì)引物組合才能使得RAPD分子標(biāo)記的分析結(jié)果更加客觀；李潞濱等[11]認(rèn)為，利用AFLP技術(shù)在以系統(tǒng)學(xué)關(guān)系分析為目的的研究中，尤其是對(duì)基因組較大的植物，應(yīng)采用盡可能多的引物組合分析供試樣品。采用引物組合的數(shù)量不同，不僅在試驗(yàn)成本方面存在差異，也對(duì)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和不同結(jié)果之間的可比性評(píng)價(jià)帶來(lái)了一定的困擾。為此，本研究采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)馬纓杜鵑4個(gè)自然居群的遺傳多樣性水平進(jìn)行檢測(cè)，探討在不影響試驗(yàn)結(jié)果可靠性以及盡可能節(jié)省成本的情況下，可以準(zhǔn)確揭示馬纓杜鵑遺傳多樣性水平的合理引物組合數(shù)，旨在為其群體遺傳學(xué)研究提供前期基礎(chǔ)，也能夠?yàn)槠渌锓N遺傳多樣性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的56份馬纓杜鵑樣本分別采自于紫溪山、馬雄山、板凳山和小營(yíng)地4個(gè)自然居群 (表1)。每一居群的采樣數(shù)均為14份，單株間隔50 m以上，以避免采集到親緣關(guān)系較近的個(gè)體。在每一樣株上均采集位于植株中部且生長(zhǎng)狀況良好的健康嫩葉6～8片，放入裝有變色硅膠的自封袋中干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

表1 供試4個(gè)馬纓杜鵑居群的基本概況

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取

采用改良的SDS法依照標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿流程提取分析樣本的基因組總DNA[12]，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì) (Spekol-1300) 共同檢測(cè)其濃度和純度，稀釋至50 ng/μL的濃度，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AFLP體系建立

AFLP分析參照Vos等[13]的方法。使用EcoRI+MseI 2種限制性內(nèi)切酶組合進(jìn)行基因組DNA雙酶切，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)采用EcoR I+00/MseI+00引物組合，將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍作為選擇性擴(kuò)增DNA模板，選擇性擴(kuò)增采用EcoR I+3/MseI+3引物組合共計(jì)15對(duì)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100TMThermal PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3 電泳分離

選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物加入1/3體積的雙指示劑，于95 ℃變性5 min，隨后立即放置于冰水混合物中。取6 μL上樣于已預(yù)電泳30 min的6%變性聚丙烯酰胺凝膠中，70 W恒定功率電泳約2 h。電泳結(jié)束后采用銀染檢測(cè)法[14]進(jìn)行AFLP顯色反應(yīng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究從15對(duì)引物組合中隨機(jī)選取3對(duì)引物組合作為基數(shù)，在剩余的12對(duì)引物組合中，以隨機(jī)抽取的2對(duì)引物組合 (不重復(fù)抽取) 為單位從3對(duì)引物組合逐級(jí)遞增到13對(duì)，分別為5、7、9、11和13對(duì)，并設(shè)置3次重復(fù)。在電泳圖譜上對(duì)遷移率相同的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為 “1”，無(wú)帶記為 “0”，形成0/1 矩陣。采用多態(tài)性信息含量 (polymorphism information content, PIC) 評(píng)價(jià)不同引物組合數(shù)量的標(biāo)記效應(yīng)，計(jì)算公式為 “PIC=∑PICi/N=∑2fi(1-fi)/N”[15]，其中 “PICi” 表示第 “i” 個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量，“fi” 表示擴(kuò)增條帶 (記為 “1” 的條帶)的出現(xiàn)頻率， “1-fi” 表示無(wú)效帶 (記為 “0” 的條帶)的頻率， “N” 表示檢測(cè)到的多態(tài)性條帶數(shù) (NPB)。應(yīng)用POPGENE 1.32軟件對(duì)馬纓杜鵑4個(gè)自然居群的多態(tài)位點(diǎn)百分率 (PPB)、觀測(cè)等位基因數(shù) (Na)、有效等位基因數(shù) (Ne)、Nei′s基因多樣性指數(shù) (H)、Shannon′s信息指數(shù) (I)、Nei′s總基因多樣度 (Ht)、居群內(nèi)基因多樣度 (Hs)、遺傳分化系數(shù) (Gst)、基因流 (Nm)、以及4個(gè)居群間的Nei′s遺傳距離等遺傳參數(shù)進(jìn)行分析，并應(yīng)用SPSS 13軟件對(duì)不同引物組合數(shù)量的遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行方差分析。采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行基于Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP擴(kuò)增結(jié)果

篩選出來(lái)的15對(duì)引物對(duì)4個(gè)居群56份馬纓杜鵑樣本的AFLP分析結(jié)果表明 (表2)，15對(duì)引物組合共擴(kuò)增出1 142條帶，有效片段長(zhǎng)度在75～580 bp之間，其中多態(tài)性條帶 (NPB) 806條，多態(tài)帶百分率 (PPB) 為70.58%，多態(tài)性信息含量 (PIC) 為0.304 6。不同引物組合擴(kuò)增得到的多態(tài)帶數(shù) (NPB) 各不相同，最高的出現(xiàn)在引物組合E32-M36中，達(dá)79條，而E38-M46、E58-M64、E64-M49這3對(duì)引物組合擴(kuò)增得到的多態(tài)性條帶數(shù)較少，僅為29條；多態(tài)性條帶百分率最高的是引物組合E45-M54，為82.72%，最低的是引物組合E38-M46，為46.03%；多態(tài)性信息含量PIC值在不同引物組合間的變動(dòng)范圍為0.255 2 (E53-M49)～0.370 6 (E32-M36)。平均每對(duì)引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)為76.1條，多態(tài)性條帶為53.7條，多態(tài)性條帶百分率為69.65%，多態(tài)性信息含量為0.302 6。

表2 AFLP分析的引物組合及擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性水平分析

有效等位基因數(shù) (Ne) 和Nei′s基因多樣性指數(shù)(H) 是衡量物種遺傳變異常用的2個(gè)指標(biāo)，具有明顯的遺傳學(xué)意義，而Shannon′s信息指數(shù) (I) 本身沒(méi)有意義，但方便與同類研究進(jìn)行比較[16-17]。利用POPGENE 1.32對(duì)不同引物組合數(shù)量的馬纓杜鵑遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表3。從物種水平來(lái)看，不同引物組合數(shù)量的多態(tài)位點(diǎn)百分率變化范圍為68.77% (11對(duì)引物組合) ～70.08% (5對(duì)引物組合)。Ne、H、I均是5對(duì)引物組合略高，分別為1.235 8、0.156 9和0.256 0，在9對(duì)引物組合中略低，依次為1.246 8、0.163 0和0.263 8。多態(tài)性信息含量 (PIC) 略有不同，在7對(duì)引物組合中最高，達(dá)0.329 5，5對(duì)引物組合次之，為0.319 9，9對(duì)引物最低，僅0.287 7。

表3 馬纓杜鵑4個(gè)居群的遺傳多樣性參數(shù)

從居群水平來(lái)看，不同引物組合數(shù)量遺傳參數(shù)變化趨勢(shì)也不相同，隨著引物數(shù)量的增加，4個(gè)居群所擴(kuò)增的多態(tài)帶數(shù)也逐漸增加。紫溪山居群中， PPB、Ne、H、I變化趨勢(shì)一致，均在5對(duì)引物組合中最高 (50.10%、1.213 4、0.133 9和0.210 9)，多態(tài)性信息含量 (PIC) 則在7對(duì)引物組合中最高 (0.350 3)，它們?cè)?3對(duì)引物組合中最低 (47.41%、1.189 2、0.121 0、0.192 7，0.330 2)；板凳山居群中，PPB、Ne、H、I最低值均出現(xiàn)在5對(duì)引物組合中，多態(tài)性信息含量 (PIC) 最低值 (0.324 2) 則出現(xiàn)在11對(duì)引物組合中，除有效等位基因數(shù) (Ne) 最高值出現(xiàn)在9對(duì)引物組合中， PPB、H、I、PIC最高值均出現(xiàn)在7對(duì)引物組合中，分別為54.31%、0.132 3、0.213 6和0.342 1；馬雄山居群中， PPB、Ne、H、I最大值均出現(xiàn)在5對(duì)引物組合中，分別為54.75%、1.216 8、0.139 4和0.222 4；最小值除Ne在7對(duì)引物組合中，其余均在9對(duì)引物組合中，分別為52.60%、0.126 1和0.203 9，而PIC的變動(dòng)范圍為0.320 8～0.341 1，分別出現(xiàn)于13對(duì)引物組合和7對(duì)引物組合中；小營(yíng)地居群中， PPB的最高值 (63.51%) 出現(xiàn)在11對(duì)引物組合中，最低值 (61.59%) 出現(xiàn)在5對(duì)引物組合中，Ne和H最高值 (1.286 5和0.179 4) 在5對(duì)引物組合中，最低值 (1.275 9和0.174 8) 在9對(duì)引物組合中，I則在11對(duì)引物組合中最高 (0.280 3)，最低值在9對(duì)引物組合中，為0.275 0， PIC的最高值 (0.372 5) 同前3個(gè)居群一樣，出現(xiàn)于7對(duì)引物組合中，最低值出現(xiàn)于9對(duì)引物組合 (0.355 6)。由此可見(jiàn)，相同引物組合數(shù)對(duì)不同居群遺傳多樣性參數(shù)的作用規(guī)律具有一定的差異性，但對(duì)多態(tài)性信息含量 (PIC) 的影響不明顯，且遺傳多樣性參數(shù)與引物組合的多態(tài)性信息含量之間無(wú)明顯的相關(guān)性。

此外，5、7、9、11和13對(duì)引物組合數(shù)量所得出的Nei′s總基因多樣度 (Ht) 依次為0.163 0、0.159 2、0.156 9、0.160 1、0.158 0；居群內(nèi)基因多樣度 (Hs) 依次為0.145 6、0.142 3、0.139 6、0.142 6、0.140 0；居群間遺傳分化系數(shù) (Gst) 分別為0.106 5、0.105 7、0.110 9、0.109 0、0.114 2，均表明馬纓杜鵑的遺傳變異主要存在居群內(nèi)不同個(gè)體之間，居群間的遺傳變異僅占總變異的11%左右；居群間基因流 (Nm) 分別為4.198 8、4.229 9、4.021 9、4.088 4、3.883 9，表明馬纓杜鵑居群間基因交流頻繁。

進(jìn)一步應(yīng)用SPSS軟件對(duì)不同引物組合數(shù)量獲得的馬纓杜鵑遺傳多樣性參數(shù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明 (表4)，引物組合數(shù)量的增加對(duì)馬纓杜鵑遺傳多樣性參數(shù) (PPB、Na、Ne、H、I、Ht、Hs、Gst、Nm) 的影響均不顯著 (P> 0.05)，表明使用5對(duì)引物組合就可以準(zhǔn)確地對(duì)馬纓杜鵑的遺傳多樣性水平進(jìn)行分析。

表4 馬纓杜鵑遺傳多樣性參數(shù)的方差分析

2.3 遺傳距離與聚類分析

對(duì)4個(gè)不同自然居群的馬纓杜鵑Nei′s遺傳距離分析結(jié)果表明(表5)，在5對(duì)引物組合中，遺傳距離的范圍為0.013 3～0.026 5；7對(duì)引物組合中，遺傳距離的范圍為0.015 0～0.027 5；9對(duì)引物組合中，遺傳距離的范圍為0.013 6～0.029 5；11對(duì)引物組合的遺傳距離范圍在0.013 8～0.030 3之間；13對(duì)引物組合的遺傳距離范圍在0.015 8～0.034 6之間。不同引物組合數(shù)所得的居群間遺傳距離與引物組合數(shù)之間無(wú)明顯相關(guān)性，但不同引物組合數(shù)揭示的居群之間遺傳關(guān)系完全一致，即紫溪山居群與板凳山居群之間的遺傳距離最小，表明二者之間的親緣關(guān)系較近，而紫溪山居群與小營(yíng)地居群之間的遺傳距離最大，表明二者之間的遺傳差異較大。

表5 馬纓杜鵑居群間的遺傳距離

采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行基于居群間Nei′s遺傳距離的UPGMA聚類分析，構(gòu)建不同引物組合數(shù)下的馬纓杜鵑4個(gè)居群聚類圖 (圖1)。由聚類圖可見(jiàn)，AFLP共計(jì)5組引物組合數(shù)的聚類分析結(jié)果完合一致，馬纓杜鵑4個(gè)居群可以劃分為2個(gè)大組，第I組由來(lái)自楚雄市的紫溪山居群和板凳山居群構(gòu)成，第II組包含了來(lái)自曲靖市的馬雄山居群和小營(yíng)地居群。

圖1 AFLP 5對(duì)引物組合數(shù)的基于Nei′s遺傳距離聚類圖

Fig.1 Dendrogram of AFLP five primer combinations based on Nei′s genetic distance

3 討 論

與其他同類型分子標(biāo)記技術(shù)相比，AFLP標(biāo)記通常能檢測(cè)到更多的條帶數(shù)目，多態(tài)性較高，一直以來(lái)都受到研究者的青睞，被不斷用于研究生物種群的遺傳結(jié)構(gòu)、物種遺傳多樣性分析和系統(tǒng)進(jìn)化等領(lǐng)域[18]。且相比其他標(biāo)記，AFLP技術(shù)檢測(cè)效率高，很少的引物組合即可達(dá)到研究目的，因此研究者在對(duì)植物遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行研究時(shí)，依據(jù)研究目的的不同，選用的引物組合數(shù)量也不同[11]。閆志峰等[19]采用AFLP標(biāo)記的8對(duì)熒光引物對(duì)10個(gè)野生種群共計(jì)129個(gè)黃檗 (Phellodendronamurense) 個(gè)體進(jìn)行了遺傳多樣性分析，索風(fēng)梅等[20]同樣也采用AFLP標(biāo)記8對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)唐古特大黃 (Rheumtanguticum)、掌葉大黃 (Rheumpalmatum) 和藥用大黃 (Rheumofficinale) 的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，而吳揚(yáng)等[21]則選用3對(duì)AFLP引物對(duì)黃金茶 (Camelliasinensis) 群體的111個(gè)株系進(jìn)行了遺傳多樣性分析。

應(yīng)用于品種的區(qū)分時(shí)，由于AFLP技術(shù)的高效性，僅用少數(shù)幾對(duì)引物就可以達(dá)到研究目的。Cervera等[22]在對(duì)來(lái)自西班牙的67個(gè)葡萄 (Vitisvinifera) 品種進(jìn)行AFLP分析時(shí)，使用2對(duì)引物就很好地解決了同名異物和同物異名的問(wèn)題，Tignon等[23]采用AFLP技術(shù)對(duì)蘋果 (Maluspumila) 品種進(jìn)行鑒別時(shí)，僅用1對(duì)AFLP引物組合就能夠鑒別28個(gè)待測(cè)蘋果品種。李潞濱等[11]選用10對(duì)AFLP引物組合對(duì)竹子系統(tǒng)關(guān)系進(jìn)行研究結(jié)果表明，僅用1對(duì)引物組合就能區(qū)分出26個(gè)竹種的差異，且隨著引物數(shù)量的增加，26個(gè)供試竹種的聚類關(guān)系趨于一致。但應(yīng)用于居群間和居群內(nèi)個(gè)體遺傳多樣性的研究時(shí)，AFLP標(biāo)記所用引物數(shù)量各不相同，季鵬章等[24]采用AFLP技術(shù)對(duì)云南南部及周邊地區(qū)狹隘分布的大理茶 (Camelliataliensis) 11個(gè)居群共204個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，僅選用2對(duì)引物組合擴(kuò)增獲得的多態(tài)性條帶百分率達(dá)100%，檢測(cè)到大理茶的遺傳多樣性水平較低，且遺傳變異主要存在于居群內(nèi)。陳良華等[25]采用4對(duì)多態(tài)性高、分辨力強(qiáng)的引物組合對(duì)4個(gè)四川核桃 (Juglusregia) 居群共46個(gè)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果表明群體內(nèi)的遺傳多樣性大于群體間的遺傳多樣性。而黃驥[26]等選用7對(duì)AFLP引物組合對(duì)武陵山區(qū)蛇足石杉 (Huperziaserrata) 4個(gè)居群的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明居群間遺傳多樣性有明顯差別。王東升等[27]在對(duì)山東省5個(gè)地區(qū)共62份紫椴 (Tiliaamurensis) 遺傳多樣性分析時(shí)，選用了9對(duì)AFLP引物組合，分析結(jié)果表明紫椴具有較高的遺傳多樣性。由此可見(jiàn)，種內(nèi)遺傳多樣研究所選用的引物數(shù)量沒(méi)有統(tǒng)一的定論，選用引物數(shù)量較少時(shí)，會(huì)影響數(shù)據(jù)的判斷，產(chǎn)生較大的隨機(jī)誤差，選用引物數(shù)量較多，會(huì)增加工作量，造成非必要的時(shí)間與成本上的損失。本研究分別選取AFLP標(biāo)記的5、7、9、11和13對(duì)引物組合對(duì)4個(gè)不同自然居群的馬纓杜鵑遺傳多樣性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，隨著引物組合數(shù)的增加，AFLP分析結(jié)果無(wú)論在物種水平，還是在居群水平，馬纓杜鵑的遺傳多樣性參數(shù)差異均不顯著，且聚類分析結(jié)果完全一致，表明在采用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行馬纓杜鵑群體遺傳學(xué)分析時(shí)，選擇5對(duì)引物組合即可得到較為準(zhǔn)確的分析結(jié)果。但將AFLP分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于不同物種的群體遺傳學(xué)分析時(shí)，適宜的引物組合數(shù)是否相同或存在差異，尚有待于進(jìn)一步研究。

[1] 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所. 云南植物志: 第4卷[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1986.

[2] 程雪梅, 何承忠, 周敏, 等. 不同浸種方式對(duì)馬纓杜鵑種子發(fā)茅率的影響[J]. 北方園藝, 2008(10): 106-109.

[3] 徐小蓉, 張習(xí)敏, 牛曉娟, 等. 赤霉素+2, 4-D及赤霉素+丁酰肼對(duì)馬纓杜鵑光合作用日變化的影響[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 31(11): 131-136.

[4] 洪怡, 文曉鵬. 馬纓杜鵑離體快繁體系的建立及優(yōu)化[J]. 西南大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 2012, 34(8): 61-66.

[5] 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所. 云南植物志: 第2卷[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1979.

[6] 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所. 云南植物志: 第10卷[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006.

[7] 陳靈芝, 馬克平. 生物多樣性科學(xué): 原理與實(shí)踐[M]. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 2001.

[8] 陳名紅, 熊華斌, 李成云. 分子標(biāo)記在百合屬植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2011(12): 65-69.

[9] Demeke T, Adams R P, Chibbar R. Potential taxonomic use of random amplified polymorphic DNA (RAPD): a case study in Brassica[J]. Theor Appl Genet, 1992, 84(7/8): 990-994.

[10] 陳新露, 趙祥云. 應(yīng)用RAPD 技術(shù)評(píng)價(jià)丁香品種間遺傳關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報(bào), 1995, 22(2): 171-175.

[11] 李潞濱, 郭曉軍, 彭鎮(zhèn)華, 等. AFLP引物組合數(shù)量對(duì)準(zhǔn)確研究竹子系統(tǒng)關(guān)系的影響[J]. 植物學(xué)通報(bào), 2008, 25(4): 449-454.

[12] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA [J]. Nucleic Acids Research, 1980, 8(19): 4321-4325.

[13] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21): 4407-4414.

[14] Tixier M H, Sourdille R M, Leroy P, et al. Detection of wheat microsatellites using a non radioactive silver-nitrate staining method [J]. Journal of Genetic Breeding, 1997, 51(1): 175-177.

[15] Roldan-Ruiz I, Dendauw J, Van Bockstaele E, et al. AFLP markers reveal high polymorphic rates in ryegrasses (Loliumspp.) [J]. Molecular Breeding, 2000, 6(2): 125-134.

[16] Slatkin M, Barton N H. A comparison of three indirect methods for estimating average levels of gene flow [J]. Evolution, 1989, 43(7): 1349-1368.

[17] 寧?kù)o, 李健權(quán), 黃麗娟, 等. “黃金茶” 特異種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系的ISSR分析[J]. 茶葉科學(xué), 2010, 30(2): 149-156.

[18] 黃文坤, 郭建英, 萬(wàn)方浩, 等. AFLP標(biāo)記在植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2006, 22(8): 50-54.

[19] 閆志峰, 張本剛, 張昭. 等. 珍稀瀕危藥用植物黃檗野生種群遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 生物多樣性, 2006, 14(6): 488-497.

[20] 索風(fēng)梅, 宋經(jīng)元, 陳士林. 等. AFLP分析唐古特大黃、掌葉大黃和藥用大黃的親緣關(guān)系研究[J]. 中草藥, 2010, 41(2): 292-296.

[21] 吳揚(yáng), 鄧婷婷, 李娟, 等. 黃金茶種質(zhì)資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 茶葉科學(xué), 2013, 33(6): 526- 531.

[22] Cervera M T, Cabezas J A, Sancha J C, et al. Application of AFLPs to the characterization of grapevineVitisviniferaL. genetic resources. A case study with accessions from Rioja (Spain) [J]. Theoretical & Applied Genetics, 1998, 97(1/2): 51-59.

[23] Tignon M, Kettmann R, Watillon B. AFLP use for the identification of apple cultivars and mutants[J]. Acta Hortic, 2000, 521(521): 219-226.

[24] 季鵬章, 汪云剛, 蔣會(huì)兵, 等. 云南大理茶資源遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 茶葉科學(xué), 2009, 29(5): 329-335.

[25] 陳良華, 胡庭興, 張帆, 等. 用AFLP技術(shù)分析四川核桃資源的遺傳多樣性[J]. 植物生態(tài)學(xué)報(bào), 2008, 32(6): 1362-1372.

[26] 黃驥, 陳浙, 李菁, 等. 武陵山區(qū)蛇足石杉遺傳多樣性的AFLP分析[J], 西北植物學(xué)報(bào), 2014, 34(1): 83-92.

[27] 王東升, 辛紅, 邢世巖, 等. 山東省紫椴遺傳多樣性AFLP分析[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版), 2014, 43(1): 44-48.

(責(zé)任編輯 張 坤)

Effect of the Quantity of AFLP Primer Combinations on Accurately AnalyzingRhododendrondelavayiGenetic Diversity

Shen Dezhou1,2, Zong Dan1,2, Zhou Anpei1,2, Yan Luxi1,2, Li Dan3, He Chengzhong1,2,4

(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 2. Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China, State Forestry Administration,Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China; 3. Yunnan Academy of Biodiversity, Southwest Forestry University,Kunming Yunnan 650224, China; 4. Key Laboratory for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China,Ministry of Education, Southwest Forestry University, Kunming Yunnan 650224, China)

In order to investigate the effect of the quantity of primer combinations on genetic diversity parameters inRhododendrondelavayi, the amplified fragment length polymorphism (AFLP) was employed to test 4 natural populations ofRhododendrondelavayiwith 5, 7, 9, 11 and 13 AFLP primer combinations. The results showed that the genetic diversity parameters of Zixi Mountain population had same changing trends with the increase of primer combinations quantity, which indicated that the amplified resutls with 5 primer combinations were slightly higher than that with other primer combinations, but the differences were not significant. The changing trends of genetic diversity parameters in other 3 populations were not obvious. There was no significant effect on the genetic distance between populations and the cluster results were consistent based on unweighted pair group method analysis (UPGMA) with different numbers of primer combinations. So, it could be concluded that 5 primer combinations could provide accurate results ofR.delavayigenetic diversity.

Rhododendrondelavayi, genetic diversity, AFLP markers, primer

10. 11929/j. issn. 2095-1914. 2016. 06. 004

2015-12-14

云南省中青年學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目 (2012HB021) 資助；西南林業(yè)大學(xué)云南省省級(jí)重點(diǎn)學(xué)科 (林學(xué)) 建設(shè)項(xiàng)目資助；西南林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新基金項(xiàng)目 (C15070) 資助；西南林業(yè)大學(xué)云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金項(xiàng)目 (YNGB201505) 資助。

何承忠 (1970—)，男，博士，教授。研究方向：林木遺傳育種與生物技術(shù)。Email: hcz70@163.com。

S718.46

A

2095-1914(2016)06-0022-07

第1作者：沈德周 (1992—)，男，碩士生。研究方向：林木遺傳育種及群體遺傳學(xué)。Email: 1244339480@qq.com。