美國FDA對登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑性能研究要點

吳傳松 國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100044）

美國FDA對登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑性能研究要點

吳傳松 國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心 （北京 100044）

登革病毒引起黃熱病以及登革感染流行在我國均有報告，登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑作為登革病毒的重要檢測手段之一，其試劑檢測性能研制顯得非常重要。本文介紹了美國FDA對登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑性能的相關(guān)要求，以期對我國從事登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑的研究人員提供一些技術(shù)思路。

登革病毒 性能研究

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，登革病毒基因組為單股正鏈RNA，長約11kb，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。登革病毒分為4個血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）。登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑是指運用RT-PCR原理檢測人血清或血漿中血清型1型、2型、3型或4型登革病毒RNA[1]。該類試劑通常包括探針、引物、酶及質(zhì)控等，用于擴(kuò)增和檢測血清型1型、2型、3型或4型血清和血漿中登革病毒RNA。登革熱是由登革病毒引起的急性傳染病，主要通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播。登革熱主要流行于世界熱帶和亞熱帶地區(qū)，東南亞、西太平洋地區(qū)和美洲，多呈地方性流行。我國主要流行于廣東、海南、廣西、福建、云南、臺灣等地，夏、秋季是主要傳播季節(jié)。2013年，全國報告病例4663例[2]，波及26個省、市、自治區(qū)。

1.登革病毒檢測試劑監(jiān)管要求概述

美國FDA對登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑按照II類特殊管理。一方面，II類特殊管理需滿足上市前監(jiān)督研究，跟蹤隨訪使用產(chǎn)品的患者情況，滿足《登革病毒核酸檢測試劑指導(dǎo)原則》[3]關(guān)于該類試劑安全性及有效性具體要求和產(chǎn)品性能標(biāo)準(zhǔn)特殊標(biāo)識要求。另一方面，該產(chǎn)品還需要符合《美國食品藥品及化妝品法》[4]其他要求或符合由其他聯(lián)邦政府機(jī)構(gòu)管理的聯(lián)邦法和規(guī)則要求。

世界衛(wèi)生組織（WHO）于2009年發(fā)布《登革熱診斷、治療、預(yù)防和控制指南》[5]，2012年發(fā)布《登革熱預(yù)防與控制全球策略》[6]；我國依據(jù)《中華人民共和國傳染病防治法》[7]，對登革病毒按照國家法定傳染病乙類傳染病管理。依據(jù)《體外診斷試劑注冊管理辦法》[8]，登革病毒核酸檢測試劑屬于病原體類檢測，按照體外診斷試劑三類管理。我國也出臺了《登革熱診療指南（2014年版）》[9]、《登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)WS 216-2008》[10]、《廣東省重癥登革熱診療指引（2014年版）》[11]等技術(shù)文件。

2.產(chǎn)品性能評價要求

該部分內(nèi)容不僅有助于審評機(jī)構(gòu)在審評期間了解產(chǎn)品的性能特性，也可以幫助用戶更好地理解產(chǎn)品的特點。研究人員提供產(chǎn)品分析性能研究清單需包括該產(chǎn)品所有性能研究特性的詳細(xì)描述信息，同時需提供研發(fā)試劑盒時的評價方案、評價指標(biāo)以及數(shù)據(jù)匯總信息等。

2.1 分析靈敏度（最低檢測限）

對于登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑而言，最低檢出限是該類試劑盒能否及時準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)病原體存在的重要依據(jù)之一。該研究必須包括登革病毒血清型-1型、2型、3型、4型樣本檢測，這些樣本來源建議采用病毒培養(yǎng)并以（pfu/ml）為單位表示病毒滴度。不同血清型系列稀釋樣本，每個稀釋病毒滴度水平重復(fù)檢測3至5次。為去除基質(zhì)效應(yīng)，稀釋樣本溶液應(yīng)采用登革病毒檢測陰性人血清或血漿或相似基質(zhì)溶液。采用95%置信區(qū)間陽性檢出率作為最低檢測限確定標(biāo)準(zhǔn)。在擬確定最低檢測限水平附近額外檢測至少20份平行樣本，以證明病毒檢出率在95%可信區(qū)間。最低檢出限單位可采用RNA病毒拷貝數(shù)或pfu/ml。需在該試劑配套常見適用機(jī)型上驗證不同類型樣本最低檢測限。在滿足上述要求的同時，通過額外檢測4種登革病毒血清型其他菌株，包括不同登革病毒流行病毒株，進(jìn)一步驗證試劑最低檢出限。研究人員可以通過文獻(xiàn)或其他方法排除研究中未驗證的登革病毒株，但需在產(chǎn)品說明書中明確未驗證的不同登革病毒株。

表1. 推薦檢測病原體

2.2 分析特異性

2.2.1 交叉反應(yīng)

用于登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑交叉反應(yīng)驗證的病原體種類，主要考慮與登革病毒核酸序列具有同源性、易引起相同或相似臨床癥狀的其他黃熱病屬病毒（如圣路易斯腦炎、西尼羅病毒、黃熱病、日本腦炎），甲病毒屬病毒（如東部馬腦炎），其他病毒和細(xì)菌引起的發(fā)燒和皮疹癥狀（如腸道病毒、單純皰疹）。需檢測表1中列出的具有潛在交叉反應(yīng)的病毒體，這些病原體可能引起發(fā)熱性疾病。病原體需有臨床意義的相關(guān)濃度檢測，細(xì)菌濃度水平建議至少106cfu/ml，病毒濃度水平能造成的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。研究人員應(yīng)對內(nèi)標(biāo)的引物、探針和模板濃度進(jìn)行驗證，應(yīng)降低對靶基因檢測造成競爭性抑制而產(chǎn)生的假陽性；另一方面，應(yīng)保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯陽性曲線。內(nèi)標(biāo)材料可以是與登革病毒共同提取的人類核酸片段，如管家基因。建議至少105cfu/ml。需明確進(jìn)行交叉反應(yīng)病毒或細(xì)菌類型及滴度。

2.2.2 干擾物研究

評價干擾物質(zhì)對該類試劑性能影響時，建議在病毒檢測臨界值水平對每種干擾物質(zhì)干擾影響進(jìn)行檢測。干擾物濃度分布應(yīng)覆蓋人體生理及病理狀態(tài)下可能出現(xiàn)的物質(zhì)濃度。應(yīng)注明不同干擾物質(zhì)對被檢測物質(zhì)無干擾最高限值。其他潛在干擾物包括但不限于表2中物質(zhì)。

2.3 精密度

研究人員應(yīng)對每項精密度指標(biāo)評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)范圍等。本類試劑精密度評價主要包括以下要求：應(yīng)包含影響檢測精密度相關(guān)變量，除試劑（包括核酸分離/純

化組分）本身影響外，還應(yīng)對操作者、配套儀器、不同實驗環(huán)境等要素進(jìn)行相關(guān)驗證。設(shè)置合理精密度評價周期，例如：為期至少12天檢測，每天至少由兩人完成不少于兩次完整檢測，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間以及不同操作者之間精密度進(jìn)行綜合評價。研究人員應(yīng)選擇不同實驗室進(jìn)行重復(fù)實驗以對室間精密度進(jìn)行評價。用于精密度評價的參考品應(yīng)包括陰性參考品、弱陽性參考品和高濃度參考品等。

2.4 質(zhì)控品設(shè)置要求

2.4.1 陰性質(zhì)控品

設(shè)置陰性質(zhì)控品用于評價非特異擴(kuò)增或檢測過程，應(yīng)保證不存在登革病毒序列，不會得到相關(guān)信號。建議采用無登革病毒序列的患者樣本，陰性樣本包括非靶序列核酸片段。如果用于評估核酸提取過程，建議包含登革病毒全基因片段。

2.4.2 陽性質(zhì)控品

設(shè)置陽性質(zhì)控品主要用于質(zhì)控整個核酸檢測過程，包括RNA提取、擴(kuò)增和檢測。陽性樣本設(shè)置應(yīng)模仿病人臨床真實樣本。陽性質(zhì)控物包括靶序列核酸，陽性質(zhì)控品材料來源可以是臨床樣本提取的登革病毒或者登革病毒株。

2.4.3 內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對照）

設(shè)置內(nèi)標(biāo)（內(nèi)對照）主要用于對管內(nèi)抑制可

表2. 潛在干擾物研究

2.5 核酸提取

對核酸擴(kuò)增檢測試劑而言，核酸提取方法是影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。不同提取方法可能會產(chǎn)生不同登革病毒核酸質(zhì)量和數(shù)量。從人血清或血漿樣本中純化登革病毒可能面臨著低濃度病毒拷貝情況，存在高濃度人源性基因型DNA、高濃度蛋白或其他背景材料。

基于以上原因，為得到滿足試劑檢測的登革病毒RNA的數(shù)量和質(zhì)量，研究人員必須結(jié)合試劑評估核酸提取方法效率，應(yīng)用試劑評價整個核酸檢測過程（包括核酸提取過程），用最低檢出限和重復(fù)性評價提取方法的合理性。

2.6 樣本收集和處理

核酸靶序列質(zhì)量和數(shù)量與樣本來源，樣本采集方法，樣本處理方法（運輸條件、存儲時間、溫度）密切相關(guān)。研究人員應(yīng)在產(chǎn)品說明書推薦樣本收集與處理方法下完成產(chǎn)品分析性能評估。例如：推薦儲存時間和溫度（包括凍存次數(shù)）對樣本穩(wěn)定性研究。需說明關(guān)于所有不同類型樣本收集和處理方法以及樣本穩(wěn)定的儲存條件。

根據(jù)登革病毒對人體侵染特性結(jié)合臨床表征，一方面，需明確該類產(chǎn)品適用樣本類型以及收集樣本合適時間或窗口時間；另一方面，應(yīng)明確樣本排除標(biāo)準(zhǔn)和接受標(biāo)準(zhǔn)。例如：研究人員應(yīng)推薦可接受的樣本存儲條件、凍融次數(shù)、運輸條件等。對于登革病毒檢測而言，應(yīng)注明樣本必須在登革病癥狀發(fā)作后盡快收集且注意生物安全風(fēng)險防范。

2.7 cut-off值研究

研究人員應(yīng)說明cut-off值被確定的依據(jù)，提供cut-off值研究方案、研究過程以及研究原始數(shù)據(jù)等。例如：人群流行學(xué)信息、結(jié)果分布、95%結(jié)果區(qū)間和99%結(jié)果區(qū)間、非陰性（陽性，灰區(qū)）結(jié)果等。應(yīng)列舉cut-off值計算過程中采用的所有統(tǒng)計學(xué)方法。如果試劑存在灰區(qū)，應(yīng)解釋說明如何確定灰區(qū)范圍。最后，用試劑在獨立樣本人群中對研究確定的cut-off值進(jìn)行驗證。

2.8 檢驗結(jié)果解釋

檢測結(jié)果解釋部分必須列出所有可能的檢測結(jié)果，說明如何確定登革病毒RNA的存在與不存在，陽性/陰性質(zhì)控品所有可能的結(jié)果。必須對可接受和不可接受的質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行解釋。如檢測試劑存在灰區(qū)范圍，應(yīng)給出檢測結(jié)果為灰區(qū)的解釋以及如何對灰區(qū)結(jié)果進(jìn)行下一步處理措施。如檢測結(jié)果需要重復(fù)檢測灰區(qū)或不可靠結(jié)果，應(yīng)說明重復(fù)檢測的接受標(biāo)準(zhǔn)。如同一病人重復(fù)檢測出現(xiàn)相同或不同結(jié)果，當(dāng)檢測結(jié)果為無效時，應(yīng)定義無效結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。研究人員需推薦無效結(jié)果處理意見，如建議復(fù)檢，則必須提供類似于對模棱兩可結(jié)果重新檢測的措施，重新測試是否來自相同核酸試劑，是否采用新的提取方法，是否檢測患者留存樣本或重新采集患者樣本等。根據(jù)產(chǎn)品檢測原理、適用人群、臨床預(yù)期用途，在分析檢測結(jié)果時，應(yīng)考慮減少檢測試劑假陰性和假陽性的可能性。檢測試劑陰性結(jié)果不能排除登革病毒感染，也不能作為患者治療的唯一依據(jù)。檢測結(jié)果為陰性時，應(yīng)增加確診發(fā)熱疾病后3至6天的樣本，使用登革病毒IgM檢測試劑進(jìn)行復(fù)測，增加登革病毒診斷結(jié)果的可靠性。假陰性結(jié)果可能因為樣本不恰當(dāng)采集、運輸及處理、樣本中存在擴(kuò)增抑制劑或者樣本中病原體數(shù)量不足。登革病毒RNA檢測僅能說明患者中存在登革病毒，但不能說明登革病毒侵染程度，也不能說明登革病毒是患者臨床癥狀的主要致病媒介，檢測結(jié)果也不能排除疾病是由其他細(xì)菌或病原體引起，試劑結(jié)果解釋應(yīng)結(jié)合其他實驗室檢測結(jié)果以及該患者臨床病癥進(jìn)行綜合分析。對于免疫抑制或免疫缺陷患者檢測結(jié)果解釋必須謹(jǐn)慎，該檢測試劑尚不適用對新生兒臍帶血、育齡人群產(chǎn)前篩查、無登革熱病癥的一般人群篩查等用途。也不適用于血源篩查或血漿捐獻(xiàn)者篩查。該試劑檢測過程中應(yīng)注意生物安全防護(hù)和避免生物污染，相關(guān)檢測人員應(yīng)具有病原學(xué)檢測經(jīng)驗，并接受標(biāo)準(zhǔn)化分子檢測培訓(xùn)。

3.結(jié)語

登革病毒屬于我國乙類傳染性病毒，登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑檢測結(jié)果將直接反映患者體內(nèi)是否存在登革病毒感染，對個體治療方案制定以及對登革熱疫情預(yù)防和監(jiān)測產(chǎn)生影響。登革病毒核酸擴(kuò)增檢測試劑檢測過程中應(yīng)盡可能避免假陰性和假陽性。性能研究方案應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途、反應(yīng)原理、樣本類型等綜合因素設(shè)計。在研究中應(yīng)將性能研究作為研制試劑的重要環(huán)節(jié)，并在臨床使用過程中不斷改進(jìn)試劑質(zhì)量。

[1] 張富春.登革熱的診斷與治療[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：5-16.

[2] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.2013年度全國法定傳染病疫情情況[EB/OL]. (2014-02-13)[ 2016-5-23].http://www.nhfpc.gov.cn/jkj/s3578/201402/26700e8a83c04205913a106545069a11.shtml

[3] FDA.Class II Special Controls Guideline: Dengue Virus Nucleic Acid Amplification Test Reagents [EB/OL].(2014-05-30) [2016-5-23].http://www.fda.gov/medicaldevices/deviceregulationandguidance/guidancedocuments/ucm399136.htm[4] The United States Congress.(2013-08-24)[2016-5-23]. FEDERAL FOOD, DRUG, AND COSMETIC ACT http:// legcounsel.house.gov/Comps/FDA_CMD.pdf

[5] WHO.Dengue Guidelines For Diagnosis,Treatment,Prevention And Control.New Edition. Geneva,2009

[6] WHO.Handbook for clinical management of dengue. Geneva,2012

[7] 全國人民代表大會常務(wù)委員會.中華人民共和國傳染病防治法[z].中華人民共和國主席令第十七號，2004.

[8] 國家食品藥品監(jiān)督管理總局.體外診斷試劑注冊管理辦法[z].國食藥監(jiān)械[2014]5號，2014.

[9] 中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會. 登革熱診療指南（2014年版）[z]. 國衛(wèi)辦醫(yī)函[2014]746號,2014.

[10] WS 216-2008，登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)[S] 北京:人民衛(wèi)生出版社,2008.

[11] 廣東省衛(wèi)生與生育計劃委員會. 廣東省登革熱診療指引（2014年版）[z]. 粵衛(wèi)辦〔2014〕47號,2014.

The US FDA Related To Dengue Virus Nucleic Acid Amplification Detection Reagent Performance Requirements

WU Chuan-song Center For Medical Devices Evaluation of CFDA (Beijing 100044)

Our country often report dengue and yellow fever epidemic caused by dengue virus infection,Dengue virus nucleic acid amplification detection reagents as an important means of detection of dengue virus,The reagent performance research is very important.This paper describes the US FDA related to dengue virus nucleic acid amplification detection reagent performance requirements,For our research dengue virus nucleic acid amplification detection reagents to provide some technical ideas.

dengue virus, research performance

1006-6586(2016)07-0031-04

R446.1

A

2016-04-16