乳苣水提取物對人肺癌細(xì)胞SPCA-1生長的影響

蔣佳君, 韓雨珊, 劉小敏, 張彩艷, 賀燕云

(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,上海 200444)

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乳苣水提取物對人肺癌細(xì)胞SPCA-1生長的影響

蔣佳君, 韓雨珊, 劉小敏, 張彩艷, 賀燕云

(上海大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,上海 200444)

為了探討乳苣水提取物對體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞SPCA-1的影響,分別用質(zhì)量濃度為0.5、1、1.25和1.5 g/L(mg/mL)的乳苣水提取物處理SPCA-1細(xì)胞,24 h后通過CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn),與對照組(未處理)相比,處理組細(xì)胞增殖活力均顯著下降(P<0.001).流式細(xì)胞儀檢測(AnnexinⅤ-FITC/PI染色)發(fā)現(xiàn)隨著處理濃度的增加,處理組細(xì)胞凋亡率都顯著提高(P<0.05),且呈劑量依賴關(guān)系.為了探索乳苣是否對體內(nèi)腫瘤有抑制作用,構(gòu)建了SPCA-1細(xì)胞的裸鼠皮下瘤模型,通過觀察喂食乳苣水提取物后皮下瘤的生長情況發(fā)現(xiàn),與未喂食乳苣水提取物的對照鼠相比,喂食5周后的實(shí)驗(yàn)組的瘤體得到明顯的抑制.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乳苣水提取物能夠抑制體外和體內(nèi)生長的SPCA-1細(xì)胞,可以作為一種潛在的預(yù)防和治療肺癌的藥物做進(jìn)一步研究.

乳苣水提取物; 肺癌細(xì)胞; 增殖; 凋亡; 抗腫瘤作用

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全世界每年有1 000萬新發(fā)癌癥患者,600萬人死于癌癥,癌癥幾乎是死亡的代名詞,目前,治療癌癥的措施有手術(shù)、化療、放療和免疫治療等方法,但其治療效果都不理想.由于中藥的毒副作用低,能提高機(jī)體的免疫力,所以越來越多的中晚期癌癥患者選擇中藥治療,許多報(bào)道也證明了中藥在抗腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移中的優(yōu)勢.因此尋找能預(yù)防癌癥并能長期服用的高效無毒的中草藥成為迫切的問題.本研究中的菊科乳苣屬植物乳苣(Mulgedium tataricum(Linn.) DC.)又名蒙山萵苣、紫花山萵苣、苦菜等,多年生草本植物,民間作為野菜采食,有抗菌、消炎、止痛等功效,我國晉西北人長期采食,以其特有的苦寒屬性及所含成份,煮熟放置后長期不餿、食后具有泄熱寧神,清心明目,消炎解毒作用.已有的對乳苣的研究主要集中在對乳苣的總黃酮和多酚的提取和抗氧化方面的研究[1-3].天然的黃酮類化合物具有抗心腦血管疾病、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、治療骨質(zhì)疏松,它具有清除自由基、超氧化物和羥基自由基、抑制脂質(zhì)過氧化及抗癌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗輻射等作用[4-5].由于苦菜的食用方法多為沸水煮食或陰干后泡食,所以實(shí)驗(yàn)材料用陰干的乳苣全草的水浸泡提取物作用于癌細(xì)胞,以此探索乳苣水溶狀態(tài)下對癌細(xì)胞的作用.前期探索發(fā)現(xiàn)乳苣對體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞H1299和A549均具有抑制作用[6].

本文作者首先用不同濃度的乳苣水提取物作用體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞SPCA-1,實(shí)驗(yàn)探索乳苣水提取物是否可以抑制體外培養(yǎng)的SPCA-1細(xì)胞的增殖,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.然后制作SPCA-1細(xì)胞的裸鼠皮下瘤模型,對荷瘤裸鼠每天灌食乳苣水提取物,觀察皮下瘤的生長情況.本實(shí)驗(yàn)探討乳苣的水提取物對肺癌腫瘤細(xì)胞的生長抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為保健品和新藥的研究開發(fā)提供線索.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株SPCA-1細(xì)胞,購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究院.

1.1.2 主要試劑

乳苣(Mulgedium tataricum(L.) DC.)為菊科乳苣屬植物,采于晉西北農(nóng)田,由上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王偉博士鑒定.DMEM培養(yǎng)基(CORNING);胎牛血清(Hyclone);胰蛋白酶(Hyclone);Penicillin-Streptomycin Solution (Hyclone);CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司);Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物公司).

1.1.3 主要儀器

流式細(xì)胞儀為Moflow XDP;CO2培養(yǎng)箱;酶標(biāo)儀為美國BioRad產(chǎn)品;倒置顯微鏡為LEICA 公司產(chǎn)品;冷凍干燥機(jī)為美國LABCONCO公司產(chǎn)品.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳苣水提取物制備

采全草,陰干,-80 ℃保存.將8 g的干乳苣,粉碎,浸泡到100 mL沸水中,超聲1 h,沸水浴30 min,過濾兩次,分裝原液經(jīng)48 h冷凍干燥后制成凍干粉,-80 ℃保存,備用.使用時(shí),用培養(yǎng)基或水重新溶解凍干粉,0.22 μm濾膜過濾后使用.

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

以含10%新生牛血清(體積分?jǐn)?shù))、100 μg/mL青霉素、100 μg/ mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SPCA-1,37 ℃、5%CO2,恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)消化傳代.

1.2.3 細(xì)胞增殖活力檢測(CCK-8法)

將細(xì)胞均勻鋪于96孔板中,待細(xì)胞貼壁生長至覆蓋培養(yǎng)板底部50%～60%時(shí),用不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞24 h,檢測前4 h先換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),每孔加5 μL CCK-8試劑,避光溫育1～2 h,用酶標(biāo)儀測450 nm下的吸光值(OD值),每個(gè)劑量重復(fù)4次,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡

不同濃度乳苣水提取物處理細(xì)胞24 h后收集到的細(xì)胞,用200 μL loading buffer懸浮細(xì)胞,2.5 μLL FITC染色,室溫避光處理15 min,再用5 μL碘化丙錠(PI)染色,冰浴避光處理5 min后上流式細(xì)胞儀檢測,用Summit 5.2 獲取數(shù)據(jù)并分析.

1.2.5 裸鼠皮下瘤模型的建立和乳苣水提物喂食裸鼠

5周大的雌性裸鼠隨機(jī)分為處理組和對照組,通過灌胃的方式對處理組裸鼠(體重約為14～15 g)每天每只喂食50 mg的乳苣水提取物(水溶物),對照組喂食同等體積的溶劑水,對處理組裸鼠先進(jìn)行3d的喂藥處理,3 d后,對SPCA-1細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下注射(每只注射1.5×106個(gè)SPCA-1細(xì)胞),然后連續(xù)喂食乳苣提取物5周,每周記錄瘤體體積以及裸鼠的體重和進(jìn)食量,當(dāng)瘤體體積約為1～1.2 cm3時(shí),殺鼠取瘤,對瘤體稱重.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 乳苣水提取物明顯抑制了SPCA-1細(xì)胞的增殖

如圖1所示,乳苣水提取物作用SPCA-1細(xì)胞24 h后,對細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用.乳苣對SPCA-1增殖的抑制作用與其劑量呈正相關(guān),實(shí)驗(yàn)組的增殖抑制作用與空白對照組比較,均有顯著性差異(p<0.001).

圖1 不同質(zhì)量濃度的乳苣水提取物對SPCA-1細(xì)胞增殖的影響(***表示與對照組相比達(dá)到顯著水平p<0.001)

2.2 乳苣水提取物誘導(dǎo)SPCA-1細(xì)胞的凋亡

在細(xì)胞凋亡的早期階段,胞漿膜磷脂的不對稱性喪失,導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)層暴露于外層,從而可被PS特異的Annexin V探針?biāo)鶚?biāo)記,PI不能透過完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染.因此將Annexin V與PI匹配使用,就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來.流式Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)圖(圖2)可見,右下象限(FITC+/PI-)和右上象限(FITC+/PI+)分別代表細(xì)胞的早期凋亡和晚期凋亡,左下象限為活細(xì)胞(FITC-/PI-),左上象限為壞死細(xì)胞(FITC-/PI+).不同劑量的乳苣水提取物作用SPCA-1細(xì)胞的平均凋亡率分別為11.04%、15.39%、23.40%、37.85%、67.44%,當(dāng)處理液中乳苣水提取物質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí),作用24 h后,處理組凋亡率與對照組相比就有顯著性意義(p<0.05).

2.3 乳苣水提取物抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長

SPCA-1細(xì)胞注射5～6周大的雌性裸鼠做成皮下瘤模型,處理組連續(xù)喂藥5周,從裸鼠的體重和進(jìn)食量可見處理組裸鼠的體重并未比對照組減少,如圖3(c,d)所示.所有裸鼠體重正常增加,并可持續(xù)穩(wěn)定進(jìn)食,可見乳苣的喂食并未對實(shí)驗(yàn)鼠的飲食和生長產(chǎn)生影響.喂食第五周后,處理組瘤體的體積顯著地小于對照組的瘤體體積(p<0.05),如圖3(a,b)所示. 處理組瘤體的質(zhì)量明顯小于對照組的瘤體質(zhì)量(p<0.05),如圖3(e,f)所示.由此可見,乳苣水提取物對體內(nèi)生長的SPCA-1細(xì)胞也有抑制作用,可以抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長.

圖2 (a～e) 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)乳苣水提取物作用SPCA-1細(xì)胞后凋亡的檢測.(a) 0; (b) 0.5 mg/mL; (c) 1.0 mg/mL; (d) 1.25 mg/mL; (e) 1.5 mg/mL;(f) 乳苣水提取物作用SPCA-1細(xì)胞后凋亡變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果(***表示與對照組相比達(dá)到顯著水平p<0.001,**表示與對照組相比達(dá)到顯著水平p<0.05)

圖3 乳苣水提取物對裸鼠體內(nèi)腫瘤的抑制作用,**表示與對照組相比達(dá)到顯著水平p<0.05.(a) 喂食乳苣5周后裸鼠皮下瘤的生長情況,對照組為未喂食乳苣的裸鼠; (b) 裸鼠皮下瘤瘤體體積的生長曲線; (c)、(d) 喂食乳苣期間裸鼠的體重變化和進(jìn)食量變化; (e)、(f) 喂食乳苣5周后瘤體的重量,對照組為未喂食乳苣的裸鼠

3 討 論

觀察了乳苣水提取物對體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞SPCA-1增殖和凋亡的影響.分別用質(zhì)量濃度為0.5、1、1.2和1.5 mg/mL的乳苣水提取物處理SPCA-1細(xì)胞24 h后,與未做任何處理的對照組相比,SPCA-1細(xì)胞的增殖活力明顯下降,而且處理濃度越高,細(xì)胞增殖活力越低.同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明乳苣水提取物誘導(dǎo)了SPCA-1細(xì)胞的凋亡,與劑量濃度呈依賴關(guān)系.所有數(shù)據(jù)表明乳苣水提取物可以明顯地抑制體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞SPCA-1的增殖,這種抑制作用可能是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的.對乳苣水提取物誘導(dǎo)體內(nèi)生長的SPCA-1細(xì)胞的進(jìn)一步研究顯示,乳苣水提取物可以控制裸鼠體內(nèi)皮下瘤的生長,這種食用野菜中含有能抑制癌細(xì)胞生長的活性物質(zhì),對臨床應(yīng)用有指導(dǎo)意義,有待進(jìn)一步進(jìn)行開發(fā).

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Effect of Mulgedium tataricum (L.) DC.aqueous extracts onhuman lung cancer SPCA-1 cellsJIANG Jiajun, HAN Yushan, LIU Xiaomin, ZHANG Caiyan, HE Yanyun

(責(zé)任編輯：顧浩然)

(Experimental Center for Life Sciences,School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai 200444,China)

To illustrate the effect ofMulgedium tataricum(L.) DC.(MTDC) aqueous extracts on human lung cancer SPCA-1 cells,cultured SPCA-1 cells were treated with 0.5,1,1.25 and 1.5 mg/mL MTDC aqueous extracts.After 24 h,the cell proliferation vitality of treatment group was tested using CCK-8 kit,and was observed significantly inhibited compared with the untreated group(p<0.001).Furthermore,flow cytometry analysis revealed the apoptosis cells were significantly increased contrast with the untreated group and the effect showed a dose-dependent manner(p<0.05).To study the inhibition effect of MTDC on tumorin vivo,the SPCA-1 subcutaneous tumor model was stablished in nude mice.treatment group were fed with MTDC and the antitumor effect of MTDC was observed.Compared with control group,treatment group presented significant inhibition effect on tumor growth after 5 weeks of feeding.The tumor size was significantly smaller in treatment group (p<0.05).Our data demonstrates that MTDC can inhibit SPCA-1 cell growthin vitroandin vivo.So MTDC can be used as a potential prevention and treatment of lung cancer to do further research.

Mulgedium tataricum(L.) DC.; lung cancer cell;apoptosis; proliferation; antitumor effect

2016-06-03

上海市大學(xué)生創(chuàng)新活動計(jì)劃項(xiàng)目(cxyj-14-01)

賀燕云,上海市寶山區(qū)南陳路333號,上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,郵編:200444,E-mail:h.swallow@163.com

Q 28

A

1000-5137(2016)05-0631-06

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2016.05.019