堿性蛋白酶水解螺旋藻制備抗氧化活性肽的工藝優(yōu)化

馬艷芳, 李玉洋, 劉金龍, 鄭明剛, 孫中濤，*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 泰安 271018；2.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266000)

堿性蛋白酶水解螺旋藻制備抗氧化活性肽的工藝優(yōu)化

馬艷芳1, 李玉洋1, 劉金龍1, 鄭明剛2, 孫中濤1，*

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 泰安 271018；2.國(guó)家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266000)

為了提高螺旋藻肽的抗氧化能力與收率，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)堿性蛋白酶水解螺旋藻粉制備抗氧化活性肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶相比，堿性蛋白酶對(duì)螺旋藻粉的水解能力最強(qiáng)，其最適水解條件為55.46 ℃、pH值為 6.71、固(g)液(mL)比為1∶10.83。在此條件下，酶解240 min，螺旋藻肽的收率為58.50%，與優(yōu)化前相比，提高了15.61%。所制備的螺旋藻肽具有較強(qiáng)的抗氧化能力，在質(zhì)量濃度為0.86 g/L時(shí)，其DPPH·清除能力為77.60%，與優(yōu)化前相比，提高了7.62%。

螺旋藻； 堿性蛋白酶； 抗氧化活性肽； DPPH·清除能力

螺旋藻(SpirulinaplatensisGeitl)是一種由單細(xì)胞或者多細(xì)胞組成的絲狀低等原核生物，藻膽蛋白含量高達(dá)50%～70%[1]，且氨基酸組成比例非常理想[2]，被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)定為“人類21世紀(jì)最佳保健品”和“未來超級(jí)營(yíng)養(yǎng)食品”[3-4]，但螺旋藻溶解性差、腥味濃重[5]的缺點(diǎn)使其在食品行業(yè)中的應(yīng)用受到限制。

經(jīng)蛋白酶適度水解后的螺旋藻粉，物化特性和生物效價(jià)改善的同時(shí)還提高了營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。與螺旋藻蛋白相比，其水解產(chǎn)物螺旋藻肽不僅具有較低的分子量和良好的物化特性，更容易被人體消化和吸收，而且還具有抗氧化能力，可消除并防止機(jī)體受到自由基的破壞等生理功能[6-8]。

目前，對(duì)螺旋藻肽生產(chǎn)工藝的優(yōu)化多以提高水解度為目標(biāo)，但這種單純追求高水解度的生產(chǎn)方式是不科學(xué)的，其原因是水解度與抗氧化能力之間并不是單純的線性關(guān)系[9]。本研究以螺旋藻粉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法來探究蛋白酶種類、水解溫度、pH值、固液比、酶底比(E/S)及水解時(shí)間等生產(chǎn)條件[10]對(duì)螺旋藻水解過程的影響，以提高螺旋藻肽的抗氧化能力與收率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

螺旋藻粉購(gòu)于山東省濱州市天健生物科技有限公司，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為59.875%。胰蛋白酶(2×105U/g)、堿性蛋白酶(2×105U/mL)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)和風(fēng)味蛋白酶(2×105U/g)分別由濟(jì)南亞康力諾生物工程有限公司、南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司與南寧龐博生物工程有限公司提供。1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)由Sigma公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平，上海恒平科技儀器有限公司；pHS- 3C 型數(shù)字酸度計(jì)，上海雷磁儀器廠；恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；UV2800型紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 水解度的測(cè)定

可用水解后生成的α-氨基態(tài)氮的量占總含氮量的百分比表示水解度(degree of hydrolysis, DH)的大小[11]。生成α-氨基態(tài)氮的量采用茚三酮法測(cè)定[12]，樣品總含氮量則采用凱氏定氮法測(cè)定[13]，水解度按照式(1)計(jì)算。

水解度=(水解后生成的α-氨基態(tài)氮的量/

樣品的總含氮量)×100%。

(1)

1.3.2 DPPH·清除能力的測(cè)定

采用Yamagucei等[14]的方法并稍有改動(dòng)：將2 mL一定質(zhì)量濃度 (0.5～2.5 g/L)的螺旋藻肽溶液與2 mL 0.2 mmol/L DPPH的95%乙醇溶液充分混勻后，室溫放置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。DPPH·清除能力的計(jì)算見式(2)。

(2)

式(2)中：A1為DPPH溶液與螺旋藻肽溶液測(cè)得的吸光值；A2為95%乙醇與螺旋藻肽溶液測(cè)得的吸光值；A3為DPPH溶液與蒸餾水測(cè)得的吸光值。

1.3.3 螺旋藻肽收率的測(cè)定

參考劉紅梅等[15]的方法并稍有改動(dòng):將抽濾酶解液得到的濾餅于80 ℃烘至恒重，稱重。螺旋藻肽的收率按照式(3)計(jì)算。

螺旋藻肽收率=

(3)

1.3.4 蛋白酶種類的選擇

稱取10 g螺旋藻粉置于裝有100 mL去離子水的250 mL三角瓶中，混勻后于90 ℃保溫10 min，待溫度降到55～60 ℃后，調(diào)節(jié)其pH值，并加入蛋白酶進(jìn)行水解。堿性蛋白酶的水解條件為pH值7.0、加酶量2.15%(E/S，以底物質(zhì)量計(jì))、水解溫度55 ℃、水解時(shí)間240 min；木瓜蛋白酶的水解條件為pH值6.0、加酶量0.6%(E/S，以底物質(zhì)量計(jì))、水解溫度60 ℃、水解時(shí)間210 min；胰蛋白酶的水解條件為pH值6.0、加酶量4%(E/S，以底物質(zhì)量計(jì))、水解溫度55 ℃、水解時(shí)間180 min；風(fēng)味蛋白酶的水解條件為pH值7.0、加酶量4%(E/S，以底物質(zhì)量計(jì))、水解溫度為55 ℃、水解時(shí)間240 min。待水解完成后于沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫、抽濾，計(jì)算酶解液的水解度、DPPH自由基清除率及收率。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

參考孫宜君等[16]、武萌萌等[17]酶解螺旋藻粉的實(shí)驗(yàn)并稍有改動(dòng)，酶解的基本條件為：堿性蛋白酶的添加量為4 300 U/g 螺旋藻粉，固(g)液(mL)比為1∶10，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間240 min。選擇溫度、pH值、固液比及酶用量4個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以溫度、pH值、固液比3個(gè)因子為研究對(duì)象，DPPH·清除能力和收率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，各因素與水平見表1。用Design Expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析并構(gòu)建DPPH自由基清除能力和收率與3個(gè)因子的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，見式(4)。

(4)

式(4)中，Y為響應(yīng)值(收率與DPP4·消除能力；xi，xj為自變量偏碼值；αα為常系數(shù)；αi為線性系數(shù)；αii為二次項(xiàng)系數(shù)；αij為交互項(xiàng)系數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 水解用酶的確定

蛋白酶種類對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響如圖1。堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解物的水解度、DPPH·清除能力與收率均高于胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。雖然堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶水解物的水解度、DPPH·清除能力與收率相差不大，但堿性蛋白酶的成本低于木瓜蛋白酶。因此，本研究采用堿性蛋白酶對(duì)螺旋藻粉進(jìn)行水解。

圖1 蛋白酶種類對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響Fig.1 Effect of different proteases on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.2 溫度的確定

酶解溫度對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響見圖2。溫度較低時(shí)，螺旋藻肽的收率、水解度均隨著溫度的升高而增大，并在55 ℃時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，水解度及收率均明顯下降，而DPPH·清除能力是隨著溫度的升高逐漸增大的，這與水解度的變化規(guī)律不同。水解度對(duì)螺旋藻肽的抗氧化能力有顯著影響，但并不是水解度越高，其抗氧化能力越強(qiáng)。綜合考慮溫度對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率影響，本研究選擇55 ℃為酶解反應(yīng)的較適宜溫度。

圖2 溫度對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響Fig.2 Effect of temperature on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.3 pH值的確定

圖3 pH值對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響Fig.3 Effect of different pH on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

pH值對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響見圖3。pH值較低時(shí)，水解度、DPPH·清除能力與收率均隨pH值的增大而增大，并且在pH值為7.0時(shí)達(dá)到最大，隨后再增加pH值，三者均明顯下降。通常，堿性蛋白酶的最適作用pH值為8.0～9.0，這與本研究結(jié)果不同，原因是酶促反應(yīng)的最適pH值受底物種類的影響，與堿性環(huán)境相比，藻膽蛋白在pH值為7.0時(shí)的溶解性更好，更有利于底物與酶接觸，因此，pH值7.0為較佳酶解溫度。

2.4 固液比的確定

固液比對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響如圖4。固液比從1∶5減小到1∶10時(shí)，螺旋藻肽的DPPH·清除能力、收率與水解度均明顯增大，隨后再減小固液比，三者均明顯下降。這主要是因?yàn)椋诠桃罕容^小時(shí)，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小，酶與底物接觸的機(jī)會(huì)少，反應(yīng)速率慢，導(dǎo)致了螺旋藻肽的水解度、抗氧化能力與收率較低。但當(dāng)固液比太大時(shí)，蛋白之間發(fā)生交聯(lián)聚合，溶解性變差，黏度增大，酶與底物分子之間接觸的機(jī)會(huì)減少，水解速度降低，從而使得螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率降低。

圖4 固液比對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響Fig.4 Effect of solid liquid ratio on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.5 酶用量的確定

酶用量對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響見圖5。當(dāng)?shù)鞍酌噶繌? 300 U/g增加到4 300 U/g時(shí)，水解度、DPPH·清除能力與收率增加較快，此后，再增加酶用量，三者上升緩慢。其原因是當(dāng)加酶量較少時(shí)，增大加酶量可以增加酶與底物接觸的機(jī)會(huì)，從而加快水解速度，螺旋藻肽的水解度、DPPH·清除能力與收率迅速增大；但當(dāng)加酶量較高時(shí)，酶用量不再是酶解反應(yīng)的限制因素，并且，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，加酶量過大會(huì)增大生產(chǎn)成本。因此，本研究選擇4 300 U/g為最適加酶量。

圖5 酶用量對(duì)螺旋藻肽水解度、DPPH·清除能力與收率的影響Fig.5 Effect of dosage of proteases on DH,DPPH· scavenging ability and yield of Spirulina peptides

2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.0軟件對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，可得到式(5)、式(6)兩個(gè)回歸方程。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Y1=76.81+1.01X1-5.05X2+3.05X3-3.22X1X2+

(5)

Y2=58.31-0.49X1-0.88X2+2.79X3-3.08X1X2-

(6)

式(5)、(6)中，X1、X2、X3分別為自變量的編碼；Y1為DPPH·清除能力，%；Y2為收率，%。

表3 二次回歸方程的方差分析結(jié)果

*顯著(p<0.05)，**極顯著(p<0.01)

圖6 溫度和pH值對(duì)螺旋藻肽DPPH·清除能力與收率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface analysis of influence of temperature and pH on DPPH· radical scavenging ability and yield

3 結(jié) 論

水解溫度、pH值、固液比、蛋白酶種類、酶底比(E/S)以及水解時(shí)間等因素均對(duì)螺旋藻肽的抗氧化能力與收率有影響，其抗氧化能力與收率的提高可通過優(yōu)化酶解過程的某些條件實(shí)現(xiàn)。以螺旋藻粉為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)法與響應(yīng)面法對(duì)堿性蛋白酶水解螺旋藻生產(chǎn)螺旋藻肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，與木瓜蛋白酶、胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶相比，堿性蛋白酶對(duì)螺旋藻肽有較強(qiáng)的水解能力，其優(yōu)化水解條件為55.46 ℃、pH值6.71、固液比為1∶10.83，在此條件下酶解240 min，螺旋藻肽的收率為58.50%；螺旋藻肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.86 g/L時(shí)，其DPPH·清除能力為77.60%，與優(yōu)化前相比，DPPH·清除能力與收率分別提高了7.62%和15.61%。水解度對(duì)螺旋藻肽的抗氧化能力有影響，但是水解度與抗氧化能力之間并不是單純的線性關(guān)系，因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)合理地控制水解度，以提高產(chǎn)品的抗氧化能力與收率。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Antioxidative Peptides fromSpirulinaUsing Alcalase

MA Yanfang1, LI Yuyang1, LIU Jinlong1, ZHENG Minggang2, SUN Zhongtao1,*

(1.CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China;2.KeyLabofMarineBioactiveSubstanceandModernAnalyticalTechnique,Qingdao266000,China)

The hydrolysis conditions of antioxidant peptides fromSpirulinapowder using alcalase were optimized by single factor methods and the Box-Behnken experiments, in order to improve the antioxidant abilities and the yield ofSpirulinapeptides.The results showed that alcalase has the highest hydrolysis ability compared with other commercial proteases, incluing papain, trypsase and flavourzyme, and it’s optimum hydrolysis conditions were 55.46 ℃, pH 6.71 and the solid liquid ratio was 1∶10.83. When theSpirulinapowder were hydrolyzed for 240 min under the optimized conditions, the yield of theSpirulinapeptides was 58.50%, increasing by 15.61% compared with the control. The DPPH radical scavenging ability ofSpirulinapeptides reached 77.597%, at the mass fraction ofSpirulinapeptides was 0.86 g/L, increased by 7.62% compared with the control.

Spirulina; alcalase; antioxidant peptides; DPPH radical scavenging ability

葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.05.004

2095-6002(2016)05-0026-07

馬艷芳，李玉洋，劉金龍，等. 堿性蛋白酶水解螺旋藻制備抗氧化活性肽的工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2016,34(5):26-32. MA Yanfang,LI Yuyang,LIU Jinlong, et al. Optimization of hydrolysis conditions for antioxidative peptides fromSpirulinausing alcalase[J]. Journal of Food Science and Technology, 2016,34(5):26-32.

2015-11-26

國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)與現(xiàn)代分析技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(MBSMAT- 2014- 05)。

馬艷芳，女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程與酶工程；

*孫中濤，男，副教授，博士，主要從事發(fā)酵工程與酶工程方面的研究。通信作者。

TS201.4； Q556

A