右美托咪定不同處理方式對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的干預研究

唐春永，王 瑛，夏樂強

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右美托咪定不同處理方式對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的干預研究

唐春永，王 瑛，夏樂強

目的 通過大鼠右側(cè)大腦中動脈阻閉再灌注模型，探討右美托咪定(Dex) 3種不同干預方式對大鼠局灶性腦缺血再灌注腦損傷的影響、機制及差異性。方法 將100只健康雄性SD大鼠隨機分為5組：假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、Dex預處理組(Dex1組)、Dex后處理組(Dex2組)和Dex預處理聯(lián)合后處理組(Dex3組)，每組20只。應用Dex對動物模型做預處理、后處理、預處理聯(lián)合后處理3種方式的干預，并檢測各組大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量以及血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量。結果 ①與Sham組比較，其他4組大鼠腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，血清NSE含量升高(P<0.05)。②與I/R組比較，3個Dex組腦組織SOD活性均顯著升高，MDA含量降低，血清NSE含量降低(P<0.05)。③Dex1組、Dex3組腦組織MDA含量和血清NSE含量低于Dex2組(P<0.05)；Dex3組腦組織MDA和血清NSE含量低于Dex1組(P<0.05)；Dex3組腦組織SOD活性高于Dex2組(P<0.05)。結論 三種不同干預方式的Dex處理均能減輕局灶性腦缺血再灌注損傷。Dex預處理聯(lián)合后處理能夠產(chǎn)生效果更佳的腦缺血再灌注損傷保護作用。Dex抑制過度氧化應激反應，減少過量氧自由基生成，可能是其腦缺血再灌注損傷的保護作用機制之一。

右美托咪定；腦缺血再灌注損傷；預處理；后處理

0 引言

大腦是對缺氧最敏感的人體器官，而腦缺血后再灌注是一把雙刃劍，一方面可以恢復血供，使缺血區(qū)的機能得到一定程度的恢復；另一方面，是由再灌注引發(fā)的氧自由基蓄積、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、鈣超載等引發(fā)并加重了缺血腦細胞的進一步損傷[1-2]。右美托咪定(Dexmedetomidine，Dex)作為一種新型的α2腎上腺素能受體(α2-AR)激動劑，激動α2-AR具有高效和高選擇性。Dex對腦缺血再灌注損傷(CIRI)有一定保護作用，可能的機制包括：降低兒茶酚胺水平，減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放以及調(diào)節(jié)細胞凋亡途徑等[3-7]，但其確切的保護作用機制仍未完全闡明，而且臨床用藥最佳劑量、時間和方式也不明確，仍有待進一步的研究。

本實驗通過改良線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈阻閉(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型，模擬人體急性腦缺血再灌注損傷病理生理過程，同時應用Dex預處理、后處理、預處理聯(lián)合后處理3種方式作為干預措施，從相關分子水平探討Dex 3種不同干預方式處理對大鼠局灶性CIRI的影響、機制及其差異性，推測其可能具有的保護作用機制，為Dex能夠更安全可靠地應用于臨床腦血管疾病患者和圍術期腦缺血高危患者提供一種明確有效的治療方法及安全用藥參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇100只日齡為49～63 d、體重為250～300 g的健康雄性SD大鼠。所有大鼠于動物手術室內(nèi)適應性喂養(yǎng)7 d，均給予自由飲水和標準動物飼料喂養(yǎng)。將手術室空調(diào)溫度設置維持在23 ℃左右。術前12 h禁食，不禁水。試劑：右美托咪定注射液(2 mL，200 μg，批號：2014030732，配制Dex濃度為10 μg/mL)，ELISA試劑盒等。

1.2 方法 所有大鼠稱重、編號后，查取隨機數(shù)表，分為5組，每組20只。參照改良 Zea Longa[8]方法，采用線栓技術進行大鼠MCAO模型制作。模型制作成功后，按實驗方案繼續(xù)進行。若有大鼠出現(xiàn)死亡，或者栓線插入深度過短(<16 mm)，并且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)、手術時出血過多、癥狀較重等情況，均予以剔除，并以同批次預留SD大鼠隨機補充制作模型。

①假手術組(Sham組)：假手術操作前30 min腹腔注射0.9% NS 5 mL/kg，分離出血管后經(jīng)右側(cè)頸內(nèi)動脈置入線栓9 mm，不進入大腦中動脈。假手術操作完成后8 h，腹腔注射0.9% NS 5 mL/kg，再觀察19 h。②缺血再灌注組(I/R組)：于MCAO模型制作前30 min腹腔注射0.9% NS 5 mL/kg，然后制備MCAO模型，完成右側(cè)大腦中動脈阻閉缺血3 h，于恢復再灌注后5 h給予腹腔注射0.9% NS 5 mL/kg，再灌注共24 h。③Dex預處理組(Dex1組)：于MCAO模型制作前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg，然后制備MCAO模型，完成右側(cè)大腦中動脈阻閉缺血3 h，于恢復再灌注后5 h給予腹腔注射0.9%NS 5 mL/kg，再灌注共24 h。④Dex后處理組(Dex2組)：于MCAO模型制作前30 min腹腔注射0.9% NS 5 mL/kg，然后制備MCAO模型，完成右側(cè)大腦中動脈阻閉缺血3 h，于恢復再灌注后5 h給予腹腔注射Dex 50 μg/kg，再灌注共24 h。⑤Dex預處理聯(lián)合后處理組(Dex3組)：于MCAO模型制作前30 min腹腔注射Dex 50 μg/kg，然后制備MCAO模型，完成右側(cè)大腦中動脈阻閉缺血3 h，于恢復再灌注后5 h給予腹腔注射Dex 50 μg/kg，再灌注共24 h。

1.3 觀察指標 采用ELISA法測定各組大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量以及血清神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)含量。

2 結果

2.1 五組大鼠一般情況比較 各組大鼠的體重、日齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 5組大鼠體重和日齡情況

2.2 動物模型存活情況及剔除結果 Zea等[8]于1989年對大鼠MCAO的模型制作進行了改進，以制作更簡便、創(chuàng)傷更小、不開顱、易掌控、重復性好、模擬度高以及腦損傷穩(wěn)定等優(yōu)勢，成為目前最主要的動物CIRI模型制作方法。本研究中，I/R組1例死亡，Dex3組1例栓線插入深度過短，予以剔除并做補充。

2.3 各組實驗大鼠術后NSE、SOD和MDA情況 與Sham組比較，I/R組、Dex1組、Dex2組和Dex3組腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，血清NSE含量升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與I/R組比較，Dex 3種不同干預方式處理組的腦組織SOD活性顯著升高，MDA含量降低，血清NSE含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Dex1組和Dex3組腦組織MDA含量和血清NSE含量低于Dex2組(P<0.05)；Dex3組腦組織MDA和血清NSE含量低于Dex1組(P<0.05)，腦組織SOD活性高于Dex2組(P<0.05)；但Dex2組、Dex3組的腦組織SOD活性與Dex1組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 五組大鼠NSE含量、SOD活性和MDA含量比較

注：*與Sham組比較，P<0.05；#與I/R組比較，P<0.05；△與Dex2組比較，P<0.05；▲與Dex1組比較，P<0.05

3 討論

人體大腦作為一個高灌注、高氧耗、高代謝和能量低儲備的重要生命器官，對缺血缺氧的耐受能力十分有限[9]。因此，尋找一種能夠更安全可靠地應用于臨床腦血管疾病患者和圍術期腦缺血高危患者的治療方法，對有效防治CIRI、降低患者傷殘率及死亡率具有重要意義。

CIR時，正常體內(nèi)的自由基產(chǎn)生和清除平衡被打破，體內(nèi)自由基清除系統(tǒng)功能障礙，導致氧自由基大量產(chǎn)生并蓄積，而且病理性連鎖式地引發(fā)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量有毒性的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，是導致IRI的主要機制之一[10]，其中以產(chǎn)生的MDA毒性最大。SOD作為人體內(nèi)最主要的自由基清除劑和抗氧化酶，能夠確保機體及時有效地清除過量的氧自由基，保護器官組織[11]。因此，SOD活力可間接反映機體清除氧自由基的能力[12-13]，而MDA含量可間接反映機體組織細胞受到自由基攻擊損傷的程度、脂質(zhì)過氧化以及氧自由基水平[14]。本研究中，除Sham組之外，I/R組、Dex1組、Dex2組和Dex3組腦組織SOD活性降低，MDA含量升高，推測為MACO模型在CIR后，大量氧自由基產(chǎn)生并蓄積，同時SOD也反應性地產(chǎn)生增加，而后不斷受到消耗、抑制以及代謝合成功能障礙，導致SOD的質(zhì)和量降低。

NSE特異性定位于神經(jīng)元內(nèi)，神經(jīng)元損傷、壞死主要引起初期NSE血清水平的急性增高，NSE持續(xù)增高可能與繼發(fā)性的腦損傷有關，其釋放水平的值與神經(jīng)元損傷數(shù)量和程度相關[15]。本研究中，3個Dex組大鼠的血清NSE水平高于Sham組，但均較I/R組降低，并以Dex3組降低最為明顯，證實Dex具有神經(jīng)保護作用。Dex組的腦組織SOD活性高于I/R組，MDA含量低于I/R組，并以Dex3組最為明顯，表明Dex神經(jīng)保護作用機制之一可能是通過抑制過量氧自由基生成、減少氧自由基蓄積、減輕脂質(zhì)過氧化反應等實現(xiàn)的。預處理組和預處理聯(lián)合后處理組的NSE低于后處理組，其原因可能在于：后處理雖然能夠通過模擬缺血后處理(IPostC)效應，激發(fā)機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護機制，可以使腦組織產(chǎn)生缺血缺氧耐受，減輕CIRI，但本實驗給予Dex后處理時，CIRI已經(jīng)歷8 h，已經(jīng)造成了一定的腦損傷，而預處理是在CIRI之前給予Dex，提前通過模擬缺血預處理(IPC)效應激發(fā)機體產(chǎn)生內(nèi)源性保護機制，使腦組織產(chǎn)生缺血缺氧耐受，從而更有利于減輕CIRI。預處理聯(lián)合后處理則可能是在二者CIRI保護作用的協(xié)同或者疊加之下共同發(fā)揮保護作用。

本研究中大鼠MCAO模型的阻閉時間為3 h。有研究表明，對于大鼠腦缺血再灌注模型，若MCAO模型的阻閉缺血時間較短(<1 h)，恢復再灌注后，大鼠腦梗死面積存在較大的個體差異；如果給予MCAO模型的阻閉缺血時間較長(>3 h)，恢復血液灌注后，在神經(jīng)缺損癥狀和腦梗死面積方面與無血液再灌注的大鼠相比無明顯差異[16-17]。研究證實，腦梗死體積與缺血時間存在顯著的相關性。通常認為，腦梗死出現(xiàn)的時間點為缺血后1 h，隨著血液再灌注的恢復以及再灌注損傷的發(fā)生和發(fā)展，腦損傷達峰時間點約為72 h[18]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，大鼠CIRI所致的神經(jīng)細胞凋亡高峰時間為24～48 h[19]，故本實驗選擇MCAO模型阻閉再灌注24 h后進行血清NSE含量、腦組織SOD活性和MDA含量的測定。有研究發(fā)現(xiàn)，在動物腦缺血模型中，Dex的神經(jīng)保護作用具有一定劑量依賴性，產(chǎn)生神經(jīng)保護效應的有效劑量范圍為1～100 μg/kg[20-22]，故本實驗選取的應用劑量為50 μg/kg。Dex的神經(jīng)保護作用在研究機械性腦創(chuàng)傷的動物模型中同樣得到證實，研究表明，Dex可能通過激活細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)產(chǎn)生神經(jīng)保護性作用，而加入ERK的抑制劑后該作用則被拮抗[23]。Degos等[24]研究證實，Dex可以通過作用于星型膠質(zhì)細胞上的α2受體，促進星型膠質(zhì)細胞對谷氨酸的攝取及降解。侯冠峰等[25]同樣在大鼠CIRI模型實驗中發(fā)現(xiàn)，預先給予小劑量Dex可使CIRI減輕，而大劑量Dex則不具備此作用。在星形細胞培養(yǎng)模型研究中，Dex可通過激動α2A-AR刺激GDNF的釋放，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用[26]。在臨床上，柏曉漫等[27]將Dex應用于頸內(nèi)動脈瘤夾閉手術患者，發(fā)現(xiàn)Dex可提供穩(wěn)定的血液動力學，提高腦氧攝取率并改善腦氧合功能。Dong等[28]發(fā)現(xiàn)，應用Dex可以減輕止血帶所引起的IRI，認為Dex具有抑制脂質(zhì)過氧化作用，同時提高內(nèi)源性抗氧化酶水平。

4 展望

CIRI是多種損傷因子、多個病理性損傷連鎖反應以及多條信號級聯(lián)通路彼此關聯(lián)、共同作用的綜合結果，參與損傷的途徑和相關因子眾多，過程復雜，而本研究只對個別因子進行不完全定量檢測，因此，要闡明Dex對CIRI確切完整的保護作用機制，使Dex更安全可靠地應用于臨床腦血管疾病患者和圍術期腦缺血高?；颊?，仍有待進一步研究。

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Effect of different treatments with dexmedetomidine on focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats

TANG Chun-yong,WANG Ying,XIA Le-qiang

(Department of Anesthesiology,Deyang People′s Hospital,Deyang 618000,China)

Objective To discuss the effects of different treatments with dexmedetomidine (Dex) on focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats through the right middle cerebral artery occlusion-reperfusion model.Methods Totally 100 healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups:sham operation group (sham group),cerebral ischemic-reperfusion group (I/R group),dexmedetomidine preconditioning group (Dex1 group),dexmedetomidine post-conditioning group (Dex2 group) and dexmedetomidine preconditioning combined with post-conditioning group (Dex3 group),20 rats in each group.All the rats were treated by different ways of dexmedetomidine.The superoxide dismutase (SOD) activity and malonaldehyde (MDA) content in brain tissue and the neuron specific enolase (NSE) content in serum were measured by ELISA method.Results Compared with sham group,the SOD activity in I/R group,Dex1 group,Dex2 group and Dex3 group decreased significantly,the MDA content increased,and the content of serum NSE increased (P<0.05).Compared with I/R group,the SOD activity in the three Dex groups significantly increased,and the content of MDA and serum NSE decreased significantly (P<0.05).The contents of MDA in brain tissue and serum NSE in Dex1 group and Dex3 group were lower than those of Dex2 group (P<0.05),and the contents in Dex3 group were lower than those of Dex1 group (P<0.05).The activity of SOD in brain tissue of Dex3 group was higher than that of Dex2 group (P<0.05).Conclusion All the three different interventions with dexmedetomidine can relieve the focal cerebral ischemia reperfusion injury in rats.Dexmedetomidine preconditioning combined with post-conditioning has better protective effects on cerebral ischemia reperfusion injury.Dex can inhibit the excessive oxidative stress response and reduce the excessive oxygen free radicals,which may be one of the protection mechanisms of Dex for cerebral ischemia reperfusion injury.

Dexmedetomidine;Cerebral ischemia reperfusion injury;Preconditioning;Post-conditioning

2016-04-04

德陽市人民醫(yī)院麻醉科，四川 德陽 618000

10.14053/j.cnki.ppcr.201611006