新疆4種林木腐爛病菌PCR快速檢測技術(shù)研究

郭開發(fā)，姚兆群，吳彩蘭，向本春，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

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新疆4種林木腐爛病菌PCR快速檢測技術(shù)研究

郭開發(fā)，姚兆群，吳彩蘭，向本春，趙思峰

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆石河子 832003)

【目的】建立新疆林木腐爛病菌的快速PCR檢測方法，為新疆林木腐爛病的早期測報和防治提供技術(shù)依據(jù)?！痉椒ā酷槍π陆帜靖癄€病菌主要種蘋果黑腐皮殼(Valsamali)，污黑腐皮殼(Valsa.sordida)，Leucostomaniveum和Valsa.malicola的rDNA-ITS特異性區(qū)段設(shè)計(jì)屬?；鸵锖头N特異性引物。【結(jié)果】屬?；鸵颲F/VR可以從腐爛病菌中擴(kuò)增一條424 bp的條帶，檢測靈敏度為10 pg/mL；設(shè)計(jì)的4對種特異性引物分別可對4種腐爛病菌V.mali,V.sordida,L.niveum,V.malicola檢測到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的條帶，檢測靈敏度均為10 pg/mL。【結(jié)論】采用腐爛病菌Valsa 的rDNA-ITS特異性區(qū)段設(shè)計(jì)的引物及PCR方法，可用于新疆林木腐爛病的快速分子檢測。

林木；腐爛病菌；rDNA-ITS；PCR檢測；特異性引物

0 引 言

【研究意義】新疆具有發(fā)展特色林果產(chǎn)業(yè)的地理氣候優(yōu)勢，截止到2014年底，特色林果種植面積已達(dá)167.67×104hm2，總產(chǎn)量650×104t，產(chǎn)值450×108多元，新疆已成為全國重要的“西域大果園”[1]。然而新疆冬季寒冷，林木受凍后易發(fā)生腐爛病，尤其近年來香梨優(yōu)斑螟在新疆南疆蘋果、梨、棗、楊樹等林木上普遍發(fā)生，進(jìn)一步加重了腐爛病為害[2,3]。由于腐爛病菌具有潛伏侵染特性，樹木受感染后早期不表現(xiàn)癥狀，待樹勢衰弱后開始擴(kuò)展并導(dǎo)致腐爛病發(fā)生，此時防治為時已晚[4]。若能在果園枯枝落葉以及樹皮上提前檢測到腐爛病菌的存在，并在其蔓延擴(kuò)散前進(jìn)行預(yù)防，可有效提高林木腐爛病的防治效果?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Zang[5]依據(jù)腐爛病菌rDNA-ITS的特異序列，設(shè)計(jì)3種特異性引物分別檢測三種蘋果樹腐爛病菌V.malivar.mali，V.malicola，V.persoonii，檢測靈敏度達(dá)到100 fg/μL?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】腐爛病的檢測采用傳統(tǒng)分離方法費(fèi)時費(fèi)力，且對潛伏侵染部位以及新感染部位分離效果不佳，基于腐爛病菌 rDNA-ITS 序列分析的PCR檢測技術(shù)則更為有效和準(zhǔn)確[5]。研究采用林木腐爛病菌的rDNA-ITS 序列設(shè)計(jì)特異性引物，為林木腐爛病菌的快速檢測提供技術(shù)支持。【擬解決的關(guān)鍵問題】以林木腐爛病在新疆已報道種Valsamali,Valsasordida,Leucostomaniveum和Valsamalicola[2]為研究對象，設(shè)計(jì)特異性引物，建立針對新疆林木腐爛病菌快速、準(zhǔn)確的PCR 檢測方法，為新疆林木腐爛病菌的早期監(jiān)測和防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用腐爛病菌菌株有4個種，分別是V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola，前期已通過形態(tài)學(xué)、ITS序列、β微觀蛋白基因等進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。列出菌株編號、來源、種名以寄主等。表1

表1 腐爛病菌分子快速檢測供試菌株
Table 1 The strains of valsa canker pathogens were used to rapid molecular detection

序號No.編號IsolatesNo.來源Originsofstrains種名Species寄主Host16T4L-L新疆兵團(tuán)第一師6團(tuán)Regiment6ofDivisionNo.1ofXPCG,Akesu,XinjiangV.mali梨樹Pyrus229-1-6新疆兵團(tuán)第二師29團(tuán)Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.mali梨樹Pyrus328-Y-1-1新疆兵團(tuán)第二師28團(tuán)Regiment28ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.mali毛白楊Populustomentosa4cfcc84640中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心ChinaforestryculturecollectioncenterV.mali海棠Malusspectabilis5TMG-3新疆兵團(tuán)第二師29團(tuán)Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.sordida胡楊Populuseuphratica6Ks新疆喀什市Kashgar,XinjiangV.sordida毛白楊Populustomentosa7HS-2新疆巴州和碩縣HeshuocountyofXinjiangV.sordida沙棗Elaeagnusangustifolia8cfcc85445中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.sordida毛白楊Populustomentosa9cfcc84642中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.sordida刺槐Robiniapseudoacacia1022T-XL新疆兵團(tuán)第二師22團(tuán)Regiment22ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.malicola梨樹Pyrus1129-1-11新疆兵團(tuán)第二師29團(tuán)Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,Korla,XinjiangV.malicola梨樹Pyrus12TMG-8新疆兵團(tuán)第二師29團(tuán)Regiment29ofDivisionNo.2ofXPCG,KorlaXinjiangL.niveum新疆楊Populusalba13YQ-1新疆巴州焉耆縣YanqicountyofXinjiangL.niveum新疆楊Populusalba14cfcc86482中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心(Chinaforestryculturecollectioncenter)V.mali蘋果Malus15FCH-1新疆兵團(tuán)第六師芳草湖農(nóng)場FangcaohufarmofDivisionNo.6ofXPCG,Changji,XinjiangAlternariasp.毛白楊Populustomentosa16FCH-2新疆兵團(tuán)第六師芳草湖農(nóng)場FangcaohufarmofDivisionNo.6ofXPCG,Changji,XinjiangFusariumsp.毛白楊Populustomentosa

注：黑色字體為購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株; XPCG為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)(Xinjiang Production and Construction Group)簡寫

Note:Standard strains are presented with black font;XPCG are short for Xinjiang Production and Construction Group

1.2 方 法

1.2.1 特異性引物設(shè)計(jì)

采用 DNAStar 軟件中的 Seqman 程序，對V.mali,V.sordida,L.niveum和V.malicola的rDNA-ITS 序列和在 GeneBank 中找到的同屬其它種的 rDNA-ITS 序列進(jìn)行多重同源性比較，以這四個種的 rDNA-ITS保守區(qū)段和多態(tài)性豐富的特異性區(qū)段為靶標(biāo)，參考藏睿等[6]文獻(xiàn)報道的Valsa屬?；鸵颲F/VR，應(yīng)用Primer 5.0 軟件分別設(shè)計(jì)種特異性引物(Species-specific primers)，其中針對V.mali的是VmmF/VmmR，目標(biāo)片段263 bp，針對V.sordida的是VsF/ VsR，目標(biāo)片段423 bp，針對L.niveum的是VnF/ VnR，目標(biāo)片段307 bp，以及針對V.malicola的是VmF/VmR，目標(biāo)片段308 bp。引物委托北京華諾時代科技有限公司合成。表2

表2 林木腐爛病的保守引物和種特異性引物的序列與退火溫度
Table 2 The nucleotide sequences and annealing temperatures of universal primers and species-specific primers of tree Valsa canker

引物名稱(Primername)引物序列PrimerSequence(5’-3’)引物退火溫度Annealingtemperature(℃)VmmFGCCGGCGGCCCAATTAA52VmmRCGCCCGGAGGCGGTCTC59VsFTCGTAAAACACCTGGGGAAAA50VsRAAATTTTCAGAAGTTGGGGGT49VnFCTGGTCGTCAAAAGCCAGGGGA59VnRTTCTGTAAACAGTCAGGTAATGCCCC58VmFTTGGCTGCCTCTCCCCTCGG60VmRGGAAGGTAATGCCCCAACACC56VFGTTGCCTCGGCGCTGGCT57VRGCGAGGGTTTTACTACTGC51

1.2.2 DNA提取及PCR反應(yīng)

病原菌DNA的提取采用Edwards[7]的方法：挑取少量腐爛病菌菌絲體加入1.5 mL離心管中，加入500 μL的buffer提取液(200 mM Tris HCl pH 7.5，250 mM NaCl，25 mM EDTA，0.5% SDS)，用研磨棒進(jìn)行研磨，室溫靜置2 h，13 000 r/min離心2 min，取上清液400 μL加入新的離心管中；加入400 μL的異丙醇，靜置5 min后，13 000 r/min離心5 min后，棄上清液；加入75%乙醇進(jìn)行洗滌，晾干后加入40 μL的TE溶液，-20℃保存。也可采用市售DNA提取試劑盒提取病原菌的DNA。

PCR反應(yīng)體系：PCRTaqMix 10 μL，10 μmol/L引物各1 μL，病原物DNA 0.5 μL，ddH2O 12.5 μL，終體積為25 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30s，引物退火30s，72℃延伸40s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應(yīng)產(chǎn)物。表2

1.2.3 引物特異性檢測

以在林木腐爛病菌分離過程中出現(xiàn)頻率最高的其它屬分離物：1株鏈格孢菌(Alternariasp.)和1株鐮刀菌(Fusariumsp.)為陰性對照。用合成引物對參試菌株的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測其特異性條帶的有無來分析引物的特異性。

1.2.4 引物靈敏度檢測

用紫外分光光度計(jì)測量所提取腐爛病菌基因組DNA 的OD260值，將濃度調(diào)整為1 μg/mL，并按10倍梯度稀釋為1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL備用。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同上。

“學(xué)為中心”要求教師盡量減少對學(xué)生學(xué)習(xí)時間的占領(lǐng)，把學(xué)習(xí)的大部分時間交給學(xué)生，讓學(xué)生自己“生發(fā)”知識。只有學(xué)生自已“生發(fā)”出來的浸潤著學(xué)生自己血脈的知識才有生命，才是刻骨銘心的。

2 結(jié)果與分析

2.1 屬?；砸餀z測

屬?；砸锏臋z測，旨在快速檢測枯枝落葉以及樹皮上是否攜帶腐爛病菌，而非腐爛病菌則不能擴(kuò)增出特異性條帶。研究表明，VF/VR引物對4個種均可以檢測到約為350 bp的條帶，而鏈格孢菌(Alternariasp.)和鐮刀菌(Fusariumsp.)及對照均未檢測到特異性條帶。圖1

注：泳道1～4為V.mali菌株；5～9為V.sordida菌株；10～11 為L.niveum菌株；12～13為V.malicola菌株；14為V.mali菌株；15～17分別為Alternariasp、Fusarium sp.和陰性對照；M表示2 000 DNA Marker，下同

Note:Lane 1-4 isV.mali, lane 5-9 isV.sordida, lane 10-11 isL.niveum, lane 12-13 isV.malicola,lane 14 isV.mali，line 15 to 17 isAlternariasp.,Fusariumsp.and CK (no DNA template), M represents 2,000 DNA Marker, the same as below

圖1 屬?；鸵颲F/VR對不同病原物檢測結(jié)果
Fig.1 Specificity test of genus-specific primers VF/VR by PCR from different strains

2.2 種特異性引物檢測

對種特異性引物特異性的檢測，檢測所設(shè)計(jì)的引物是否只具有靶向的唯一性，即只對其所檢測的靶標(biāo)菌進(jìn)行擴(kuò)增，而不能對非靶標(biāo)菌進(jìn)行擴(kuò)增。

研究表明，菌株6T4L-L，29-1-6，28-Y-1-1，cfcc84640和cfcc86482共5株為V.mali，僅6T4L-L，29-1-6，28-Y-1-1，cfcc84640檢測到約為250 bp左右的目的片段，cfcc86482和其他菌株均未檢測到目標(biāo)片段。表明引物VmmF /VmmR對V.mali具有相對專一性，可用于腐爛病菌V.mali的快速分子檢測。圖2

圖2 VmmF/VmmR 對不同病原菌特異性檢測
Fig.2 Specificity test of species-specific primersVmmF/VmmR by PCR from different isolates

研究表明，采用特異性引物對TMG-3，KS，HS-2，cfcc84642和cfcc95445共5株均為V.sordida菌株，可以檢測到約為400 bp左右的目的片段，其他腐爛病菌、鐮刀菌和鏈格孢屬均未檢測到特異性目標(biāo)條帶。表明引物VsF /VsR對V.sordida具有相對專一性，可用于腐爛病菌V.sordida的快速分子檢測。圖3

圖3 VsF/VsR 對不同病原菌特異性檢測
Fig.3 Specificity test of species-specific primersVsF/VsR by PCR from different isolates

研究表明，22T-xl和29-1-11共2株均為L.niveum，通過PCR檢測均擴(kuò)增出約為300 bp左右的目的片段，而其他的均未檢測到。說明引物VnF/VnR對L.niveum具有相對專一性，可用于腐爛病菌V.nivea的快速分子檢測。圖4

研究表明，TGM-8、YQ-1共2株為V.malicola，通過檢測到約為300 bp左右的目的片段，其他的均未檢測到。表明引物VmF /VmR對V.malicola具有相對專一性，可用于腐爛病菌V.malicola的分子檢測。圖5

圖4 VnF/VnR 對不同病原菌特異性檢測
Fig.4 Specificity test of species-specific primersVnF/VnR by PCR from different isolates

圖5 VmF/VmR 對不同病原菌特異性檢測
Fig.5 Specificity test of species-specific primersVmF/VmR by PCR from different isolates

以稀釋為1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL作為模板，選用屬專化型引物VF/VR進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，均可以檢測出一條400 bp左右的條帶，條帶較為清晰。圖6

注：泳道1～6分別為稀釋濃度為1 μg/mL，100 ng/mL，10 ng/mL，1 ng/mL，100 pg/mL，10 pg/mL，泳道7為對照，M表示2 000 DNA Marker

Note:Lanes 1-6：Amplified products using DNA at concentrations of 1 μg/mL,100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL,100 pg/mL, 10 pg/mL，respectively, lane 7 for control, M represents 2,000 DNA Marker.

圖6 屬專化型引物對腐爛病菌靈敏性檢測
Fig.6 Sensitivity of PCR with specific primers for detection of Valsa Canker

4種腐爛病菌V.mali、V.sordida、L.niveum、V.malicolaDNA濃度稀釋后，選擇對應(yīng)種特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后電泳條帶。4種病原物DNA濃度稀釋為10 pg/mL時均可以檢測到條帶。圖7

注：泳道1～6分別為稀釋濃度分別為1 μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL，泳道7為對照，M表示2 000 DNA Marker(A :V.mali; B:V.sordida; C: L.niveum; D:V.malicola)

Note:Lanes 1-6：Amplified products using DNA at concentrations of 1 μg/mL,100 ng/mL,10 ng/mL,1 ng/mL,100 pg/mL, 10 pg/mL respectively, lane 7 for control, M represents 2,000 DNA Marker

圖7 種特異性引物對腐爛病菌靈敏性檢測
Fig.7 Sensitivity of PCR with specific primers for detection of Valsa Canker

3 討 論

隨著分子檢測技術(shù)的發(fā)展，建立基于 rDNA-ITS區(qū)段的分子檢測技術(shù)已得到了廣泛應(yīng)用[8-10]。Feau[11]利用種特異性的引物，成功的從楊樹上檢測到了三種殼針孢屬(Septoria)病原菌的存在。Zang[5]利用蘋果樹腐爛病菌的 rDNA-ITS 的特異區(qū)段為靶標(biāo)設(shè)計(jì)特異性的引物，區(qū)分蘋果樹腐爛病菌V.malicola，V.persoonii和V.malivar.mali，檢測靈敏度達(dá)到100 fg/μL。周曉云等[12]設(shè)計(jì)特異性引物SF1/SR2對華麗腐霉(A.andraeanum)進(jìn)行快速檢測，檢測靈敏度在 DNA 水平上可達(dá)1 pg。

新疆林木腐爛病有逐年加重的趨勢，已成為新疆林木主要的病害之一[13,14]。腐爛病菌危害寄主種類較多，且病菌種類復(fù)雜多樣[15-18]。傳統(tǒng)的生物學(xué)形態(tài)鑒定就顯得十分困難。因此建立快速PCR檢測技術(shù)對于腐爛病病害的早期診斷、預(yù)防顯得十分重要。研究中采用的屬?；鸵颲F/VR能準(zhǔn)確的區(qū)別出林木腐爛病菌和其他病菌，檢測靈敏度達(dá)到10 pg/mL。設(shè)計(jì)的四對種特異性引物，可準(zhǔn)確的區(qū)分四種林木腐爛病菌V.mali、V.sordida、L.niveum、V.malicola。檢測濃度達(dá)到10 pg/mL。

研究建立方法只對新疆林木腐爛病進(jìn)行快速定性檢測，并且可滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大量樣品批量檢測的需求。很多文獻(xiàn)報道蘋果腐爛病菌V.mali存在異名[19-21]。研究設(shè)計(jì)的VcF/VcR特異性引物中，購買的菌株V.mali(cfcc86482)沒有被檢測出來，具體原因還需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行確認(rèn)。同時新疆林木腐爛病菌是否存在其他種類，也需要進(jìn)一步進(jìn)行分離鑒定。

4 結(jié) 論

建立了一種基于DNA分析的新疆林木腐爛病菌的PCR快速檢分子測檢測體系，該體系可以快速檢測出枯枝落葉以及潛伏侵染的腐爛病菌，設(shè)計(jì)的屬?；鸵飳?種腐爛病菌均檢測到424 bp的條帶，檢測靈敏度為10 pg/mL；設(shè)計(jì)的4對種特異性引物分別對4種腐爛病菌V.mali，V.sordida，L.niveum，V.malicola檢測到263 bp、423 bp、307 bp、308 bp的條帶，檢測靈敏度均為10 pg/mL。該方法具有高通量、快捷、靈敏度高的特點(diǎn)，用于新疆林木腐爛病預(yù)測預(yù)報、田間診斷，越冬場所、傳播途徑等研究有重要意義。

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Fund project:The science and technology aid project of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(201491150); The project of the introduction of the higher-grade talented persons of the Xinjiang Uygur Autonomous Region(2015-2017)

Rapid PCR Detection Technology for Four Species of Valsa Canker Pathogens of Trees in Xinjiang

GUO Kai-fa，YAO Zhao-qun，WU Cai-lan，XIANG Ben-chun，ZHAO Si-feng

(CollegeofAgronomy,ShiheziUniversity/KeyLaboratoryforOasisAgriculturalPestManagementandPlantResourceUtilizationatUniversitiesofXinjiangUygurAutonomousRegion,ShiheziXinjiang832003,China)

【Objective】 To develop a rapid PCR assay for detection of trees Valsa canker in Xinjiang and provide the technical support for forecast and prevention of treesValsacanker.【Method】Based on rDNA-ITS conservative sequence of theValsagenus, a pair of genus-specific primers and four pairs of species-specific primers were designed forValsamali,Valsasordida,LeucostomaniveumandValsamalicola.【Result】Using genus-specific primers VF/VR to amplify a unique 424 pb band from Valsa and using four pairs of species-specific primers to amplify 263 bp,423 bp, 307 bp and 308 bp band fromV.mali,V.sordida,L.niveumandV.malicolarespectively. And the detection sensitivity was 10 pg/mL.【Conclusion】The results suggested that developed rapid molecular detection method in this study based on rDNA-ITS conservative sequence of theValsagenus can be used in the Xinjiang treesValsacanker.

tree;Valsacanker；rDNA-ITS；PCR detection；specificity primers

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.010

2016-12-30

新疆維吾爾自治區(qū)科技援疆項(xiàng)目(201491150)；新疆維吾爾自治區(qū)高層次人才引進(jìn)項(xiàng)目(2015-2017)

郭開發(fā)(1985-)，男，甘肅威武人，博士研究生，研究方向?yàn)橹参锞锊『Γ?E-mail)andygkf@126.com

向本春(1958-)，男，四川宣漢人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，(E-mail)xbc@shzu.edu.cn 趙思峰(1975-)，男，四川巴中人，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锞锊『捌渖锓乐危?E-mail)zhsf_agr@shzu. edu.cn

S436.6

A

1001-4330(2016)10-1843-07