新疆吐魯番地區(qū)三種甜瓜病毒病的發(fā)生與分子鑒定

韓盛，韓成貴，玉山江·麥麥提，楊軍，楊渡

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3. 新疆葡萄瓜果開發(fā)研究中心 新疆鄯善 838201)

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新疆吐魯番地區(qū)三種甜瓜病毒病的發(fā)生與分子鑒定

韓盛1，韓成貴2，玉山江·麥麥提1，楊軍3，楊渡1

(1. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 國家農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3. 新疆葡萄瓜果開發(fā)研究中心 新疆鄯善 838201)

【目的】明確吐魯番地區(qū)西瓜花葉病毒(WMV)、小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)、南瓜蚜傳黃化病毒(CABYV)的發(fā)生情況及三種病毒不同來源分離物間的遺傳差異。【方法】采用分子檢測方法，確定吐魯番地區(qū)甜瓜CABYV、WMV、ZYMV的侵染比例，應(yīng)用序列比對及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析三種病毒，吐魯番分離物與國內(nèi)外其他分離物間遺傳差異。【結(jié)果】吐魯番地區(qū)40份病毒病樣中WMV、ZYMV、CABYV分子檢測陽性比例分別達(dá)87.5%、50%、30%。ZYMV吐魯番分離物等部分國內(nèi)外分離物NIB與CP蛋白之間存在蛋白切割位點Q/S， WMV、ZYMV吐魯番分離物等部分國內(nèi)外分離物DAG基序的氨基酸序列均為DAG。依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析將三種病毒吐魯番分離物分別劃分至不同的亞組。 【結(jié)論】WMV、ZYMV為吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的優(yōu)勢毒原，CABYV為吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的主要病毒之一。CABYV、WMV吐魯番分離物與國內(nèi)部分省份分離物親緣關(guān)系更近，ZYMV吐魯番分離物XJturufan2與東歐、中東國家的分離物親緣關(guān)系更近， ZYMV吐魯番分離物XJturufan與國內(nèi)部分省份分離物及美國、西班牙、日本等國分離物親緣關(guān)系更近。

西瓜花葉病毒；小西葫蘆黃化花葉病毒；南瓜蚜傳黃化病毒；系統(tǒng)發(fā)育樹；DAG基序

0 引 言

【研究意義】新疆獨特的地理位置以及氣候特征，使其成為國內(nèi)重要的甜瓜生產(chǎn)基地。近年來，新疆甜瓜種植面積逐年擴大，自2007年以來種植面積即穩(wěn)定在6×104hm2以上， 2007～2014年種植面積達(dá)6.28×104～8.67×104hm2，2009年達(dá)峰值8.67×104hm2[1]。隨著新疆甜瓜種植面積不斷增大，甜瓜產(chǎn)量日益增加，新疆甜瓜產(chǎn)業(yè)已成為新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要經(jīng)濟增長點。而病毒病一直是影響新疆甜瓜種植的重要病害，受病毒病侵染的甜瓜植株會出現(xiàn)葉片畸形、花葉、黃化等多種癥狀，最終導(dǎo)致甜瓜果實品質(zhì)嚴(yán)重下降、產(chǎn)量大大降低，病重年份部分甜瓜種植區(qū)甚至面臨絕收的境況。2007～2015年，受環(huán)境氣候影響，新疆南北疆各主要甜瓜種植區(qū)甜瓜作物上病毒病發(fā)病嚴(yán)重，分別于2007、2013、2014年在不同甜瓜種植主產(chǎn)區(qū)發(fā)生病毒病暴發(fā)流行，其中2014年6～8月期間新疆吐魯番地區(qū)0.066 7×104hm2(1萬多畝)復(fù)播甜瓜因病毒病暴發(fā)流行而毀種。研究分析吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病流行區(qū)致病病毒種類，對于根據(jù)不同致病病毒的流行、傳播特性制定合適的防治策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】20世紀(jì)80年代，國內(nèi)許多學(xué)者對新疆侵染瓜類作物的病毒采用生物學(xué)、血清學(xué)及電鏡觀察相結(jié)合的方法進(jìn)行了研究鑒定，認(rèn)為當(dāng)時新疆侵染哈密瓜的病毒主要有西瓜花葉病毒2號(WMV-2，即PRSV-W),黃瓜花葉病毒(CMV)、南瓜花葉病毒(SqMV),煙草壞死病毒(TNV), 甜瓜葉脈壞死病毒(MVNV)，哈密瓜葉脈壞死病毒(HmVNV)，哈密瓜花葉病病毒(HMMV)，但優(yōu)勢病毒為WMV-2(即PRSV-W)，CMV和SqMV[2-13]。1991年魏寧生等[14]對新疆、甘肅兩省(區(qū))厚皮甜瓜病毒病樣進(jìn)行鑒定認(rèn)為兩地病毒種類有CMV、WMV和SqMV，其中WMV是優(yōu)勢病毒。1991年鄭光宇等[15]報道了小西葫蘆黃化花葉病毒(ZYMV)在新疆瓜類作物上的侵染發(fā)生，隨后，趙榮樂等[16]和劉衛(wèi)榮等[17]分別于1998年、2008年對新疆不同瓜類作物ZYMV分離物進(jìn)行了研究報道。2004年趙榮樂等[18]對侵染新疆甜瓜的SqMV分離物的部分生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。2008年，劉衛(wèi)榮等[19]對從新疆南瓜病樣上分離得到的WMV-2(即PRSV-W)新疆昌吉分離物的CP基因序列進(jìn)行了研究分析?！颈狙芯壳腥朦c】課題組前期研究確定了新疆喀什地區(qū)大面積暴發(fā)流行的甜瓜"黃葉病"病原主要為CABYV(該研究結(jié)果由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)韓成貴教授合作研究證實)，研究證實了新疆喀什地區(qū)大面積暴發(fā)流行的甜瓜“黃葉病”病原主要為CABYV，吐魯番產(chǎn)區(qū)CABYV的發(fā)生情況尚不明確。此外吐魯番地區(qū)WMV、ZYMV等Potyvirus屬主要瓜類作物病毒的發(fā)生情況及侵染比例也不清楚。研究調(diào)查吐魯番地區(qū)表現(xiàn)明顯黃化癥狀或畸形、花葉癥狀的甜瓜病毒病發(fā)生情況，同時采集相關(guān)病樣，采用分子鑒定的方法檢測Polerovirus屬病毒CABYV及Potyvirus屬WMV、ZYMV的侵染情況，并分析相關(guān)病毒不同分離物間的遺傳差異。【擬解決的關(guān)鍵問題】確定吐魯番地區(qū)WMV、ZYMV、CABYV等病毒的侵染情況，初步確定WMV、ZYMV、CABYV等病毒吐魯番分離物與國內(nèi)外其他分離物間的遺傳差異。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 毒 源

2014年分別由吐魯番地區(qū)鄯善縣魯克沁鎮(zhèn)沙坎爾鄉(xiāng)、沙坎爾農(nóng)場、吐峪溝鄉(xiāng)、迪卡爾鄉(xiāng)、哈密瓜研究中心采集表現(xiàn)明顯黃化癥狀或畸形、花葉癥狀的甜瓜植株葉片，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 載體與菌株

MMLV反轉(zhuǎn)錄酶購自PROMEGA公司，pEASY-T1 Cloning Kit和Trans10 Chemically Competent Cell 均購自全式金公司。

1.1.3 酶及化學(xué)試劑

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；TaqDNA聚合酶、2×EasyTaqPCR SuperMix (購自北京全式金公司)；RNase抑制劑(Ribonuclease Inhibitor,RRI)、T4DNA ligase、pMD19-TVector Ligation Kit購自TAKARA公司， Agarose Gel DNA Purification Kit購自AXYGEN公司；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 植物總RNA的提取

取樣品液氮研磨后，先加入800 μL水飽和酚，再加入830 μL RNA buffer于2.0 mL EP管中；劇烈震蕩混勻后，靜置一會于離心機上12 000 r/m離心10 min，取上清600 μL于新管中，加等體積的水飽和酚，上下顛倒輕柔混勻靜置后，12 200 r/m離心15 min；取上清300 μL于新管中，加入等體積的4MliCL,輕柔混勻后-20℃沉淀1 h(注意此步最好使用新滅的槍頭和EP管)； 4℃離心機12 000 r/m離心15 min；棄上清，加70%無水乙醇1 000 μL，洗2次(每洗一次后12 000 r/m離心3 min，棄上清), 第二次洗后空轉(zhuǎn)一次，吸出廢液；置于37℃吹干，約7～8 min；加入30 μL ddH2O。

1.2.2 RT-PCR擴增目的片段

RT體系：在30 μL RT反應(yīng)體系中加入8.5 μL DEPC水、6 μL 5×反轉(zhuǎn)錄酶Buffer、3 μL d NTPs(5 mmol/l)、1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、0.5 μL RNase抑制劑(40 U/μL)、Polerovirus屬病毒與Potyvirus屬病毒通用反向引物PococpR(-)和M4T(-)各3.0 μL(0.1 ug/ul)，6 μL植物總RNA提取液，于42℃反轉(zhuǎn)錄60 min，70℃ 變性10 min，4℃保持。

PCR體系：25 μL PCR擴增反應(yīng)體系中加入8.5 μL ddH2O、2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、1 μL(10 umol/L)正向引物、1 μL(10 umol/L)反向引物、2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，反應(yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。表2

表1 不同病毒分子檢測使用的引物序列及目標(biāo)基因
Table 1 Primer sequences and target genes for detection of different viruses

引物名稱及序列Primernameandsequences目標(biāo)基因Targetgenes目標(biāo)片段大小Sizeoftargetgene(bp)M4T:5'GTTTTCCCAGTCACGAC(T)153'Potyvirus屬病毒反向通用引物[20]PCCOCPR:5'CGTCTACCTATTTSGGRTTN3'PCCONF: 5'TGYTCYGGTTTTGACTGG3'Polerovirus屬病毒CP基因,參考自尚巧霞博士論文引物序列[21]1300WMV1F:5'-ACGTAGCAAAGAACAGACAAA-3'WMV1R:5'-ACATAAACAGTACGAAGGTGA-3'WMVCP基因序列參考自何丹論文引物序列[22]1300ZYMV1F5'-CACGAAGGACAAGGATGTGA-3'ZYMV1R5'-ACATTGCTAAGAGCTGCTGC-3'ZYMVCP基因序列參考自李繼洋論文引物序列[23]596ZYMVF:5’AGCTCCATACATAGCTGAGACAG3’ZYMVR:5’GCTTGCAAACGGAGTC3'ZYMV NIB-CP基因參考自劉衛(wèi)榮等文獻(xiàn)引物序列[17]1100WMVF:5’GGTTGCTGYGARTCAGTGTC3'(注Y=C/T,R=A/G)WMVR:5’CGACCCGAAATGCTAACT3'WMV CP基因參考自劉衛(wèi)榮等文獻(xiàn)引物序列[19]1000

表2 不同目標(biāo)片段的PCR擴增反應(yīng)程序
Table 2 PCR amplification reaction procedure for different target segments

目標(biāo)片段TargetsegmentsPCR反應(yīng)程序PCRamplificationreactionprocedureWMV、ZYMV94℃預(yù)變性4min,94℃變性30s,53℃退火45s,72℃延伸1min30s,35個循環(huán),最后72℃延伸10min,4℃保持。Polerovirus屬病毒VirusesbelongstoPolerovirusgenus95℃預(yù)變性4min,95℃變性30s,52℃退火45s,72℃延伸1min30s,35個循環(huán),最后72℃延伸10min,4℃保持。

1.2.3 DNA片段的回收純化

采用試劑盒法-AxyPrepTM DNAgel extraction kit(Axygen biosciences)

參照試劑盒使用說明。將切下的凝膠稱重，加入3倍體積(質(zhì)量體積比)的溶膠緩沖液A，75℃加熱約10 min至膠完全融化，加入緩沖液A1/2體積的緩沖液B，混勻轉(zhuǎn)移至回收柱中，12 000 r/min離心1 min；棄溶液，在柱中加入500 μL洗滌緩沖液W1，12 000 r/min離心洗滌30s；棄溶液，在柱中加入700 μL洗滌緩沖液W2，12 000 r/min離心洗滌30s，再加700 μL洗滌緩沖液W2，12 000 r/min離心1 min，棄溶液，12 000 r/min離心1 min；之后再12 000 r/min離心1.5 min，回收柱放入新的1.5 mL離心管中，加入25～30 μL預(yù)熱至65℃的dd H2O或TE，室溫靜置1 min，12 000 r/min，離心1.5 min，得到回收片段。

1.2.4 目的片段與載體質(zhì)粒的連接

使用全式金Peasy-T1 Cloning kit，PCR 純化產(chǎn)物4 μL，Peasy-T1 Cloning Vector 1 μL，輕輕混合，干式恒溫儀中25℃ 反應(yīng)15 min，可放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化

參照全式金Peasy-T1 Cloning kit方法進(jìn)行。加連接產(chǎn)物(最多5 μL)于50 μL Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中(在感受態(tài)細(xì)胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物)，輕彈混勻，冰浴20～30 min；42℃熱激30s，立即置冰上2 min；加入250 μL平衡至室溫的SOC或 LB液體培養(yǎng)基，200RPM，37℃1 h；取8 μL 500 mMIPTG和40 μL 20 mg/mL X-gal 混合，涂于LB固體平板(含50 μg/mL的Amp或Kan)，37℃培養(yǎng)30 min；待IPTG 和X-gal被吸收后，取全部300 μL菌液4 000 r/min離心1 min，棄部分上清，保留150 μL，輕彈懸浮菌體，將剩余全部菌液涂板，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.6 重組質(zhì)粒的菌落PCR鑒定

用滅菌的牙簽挑單菌落于LB固體平板(含50 μg/mL的Amp)上劃線后，挑少許菌落涂布于200 μL PCR管的底部。在上述離心管中加入25 μL在PCR擴增反應(yīng)體系，8.5 μL ddH2O、2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、1 μL(10 μmol/L)正向引物M13F、1 μL(10 μmol/L)反向引物M13R、2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。擴增條件為：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保持。復(fù)性溫度根據(jù)所用引物的Tm值確定，延伸時間根據(jù)所擴增片段的長度確定(1 kb/min)，反應(yīng)擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 序列測定和分析比較

挑取陽性克隆的菌種接到2 mL LB(含50 μg/mL Amp)液體培養(yǎng)基中，于搖床中37 ℃150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取1.5 mL菌液送交北京英俊科技有限公司進(jìn)行序列測定。在NCBI上進(jìn)行序列相似性檢索獲得國內(nèi)外已報道的相關(guān)序列比對結(jié)果，并利用DNAMAN、MEGA6.0等序列分析軟件分析比較，同時應(yīng)用MEGA6.06軟件采用近鄰分析法依據(jù)各病毒具有一定代表性的不同地區(qū)或寄主來源分離物間CP或NIB-CP基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析各病毒不同分離物間的遺傳進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 吐魯番鄯善縣甜瓜病毒病發(fā)生情況

2014年6月中旬后，吐魯番地區(qū)0.066 7×104hm2(1萬多畝)秋茬復(fù)播甜瓜病毒病逐漸加重，7月中上旬達(dá)發(fā)病高峰，大部分地塊因病毒病嚴(yán)重發(fā)生而毀種。于7月16日和8月21日調(diào)查鄯善縣魯克沁鎮(zhèn)沙坎爾鄉(xiāng)、沙坎爾農(nóng)場、吐峪溝鄉(xiāng)、迪卡爾鄉(xiāng)、哈密瓜研究中心等地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)刂饕悬S化類型及畸形、花葉類型兩種類型病毒病發(fā)生。畸形、花葉類型病毒病發(fā)生最為普遍，凡是發(fā)生病毒病的地塊該類型病毒病均有發(fā)生，黃化類型病毒病發(fā)生程度僅次于畸形、花葉類型病毒病，但部分地塊僅有畸形、花葉類型而無黃化類型病毒病發(fā)生，而畸形、花葉類型與黃化類型病毒病均有發(fā)生的地塊大部分病株兩種癥狀同時存在，表明多數(shù)病株為復(fù)合侵染。

播種時間與病毒病發(fā)病程度具有一定相關(guān)性，研究中調(diào)查的 6月10～25日復(fù)播的甜瓜畸形花葉類型病毒病發(fā)病率為87%～100%，平均發(fā)病率96.17%，黃化類型病毒病發(fā)病率0～100%，平均發(fā)病率62%，7月1～24日復(fù)播甜瓜畸形花葉類型病毒病發(fā)病率為0～75%，平均發(fā)病率12.22%，黃化類型病毒病發(fā)病率0～8%，平均發(fā)病率2.11%，整體來看，6月復(fù)播甜瓜發(fā)病程度明顯重于7月復(fù)播甜瓜，發(fā)病程度與播種時間存在播種越晚發(fā)病程度越輕的趨勢。 表3

2.2 黃化類型病樣及畸形花葉類型病樣的分子檢測結(jié)果

應(yīng)用WMV、ZYMV特異性引物及Polerovirus屬病毒通用引物分別檢測吐魯番鄯善地區(qū)29份畸形、花葉類型病毒病樣和11份黃化類型病樣， 畸形、花葉類型病毒病樣和黃化類型病樣均能檢測到WMV、ZYMV及Polerovirus屬病毒，并且部分樣品存在多種病毒復(fù)合侵染情況。 圖1～5，表4

供試29份畸形、花葉類型病毒病樣中25個病樣WMV檢測陽性、2個病樣CABYV檢測陽性、10個病樣ZYMV檢測陽性，以病毒復(fù)合侵染樣本統(tǒng)計所有供試樣品中2個病樣為WMV、ZYMV、CABYV復(fù)合侵染，7個病樣為WMV、ZYMV復(fù)合侵染。供試11份黃化類型病毒病樣中，含有WMV、ZYMV、CABYV侵染的病樣均為10份，并且9個樣本W(wǎng)MV、CABYV復(fù)合侵染數(shù)為，9個樣本為ZYMV、CABYV復(fù)合侵染，8個樣本為WMV、ZYMV、CABYV復(fù)合侵染。表4

表3 吐魯番鄯善縣甜瓜病毒病發(fā)生情況
Table 3 the occurrence of melon virus disease in Shanshan county, Turpan city

地點Place調(diào)查時間Surveytime(M/D)黃化類型病毒病發(fā)病率Theincidenceofyellowtypevirusdisease(%)畸形花葉類型病毒病發(fā)病率Theincidenceofmalformationmosaictypevirusdisease(%)播種時間Sowingdate(M/D)魯克沁鎮(zhèn)殺坎爾鄉(xiāng)Skanrcountry,Lukeqintown7/16901006/20魯吐峪溝鄉(xiāng)楊海村Yanghaivillage,Tuyugoucountry7/160926/20哈密瓜研究中心品種試驗地VarietytestfieldinHamimelonresearchcenter7/161001006/25哈密瓜研究中心試驗地TestfieldinHamimelonresearchcenter7/1682876/25哈密瓜研究中心試驗地TestfieldinHamimelonresearchcenter7/160986/25魯克沁鎮(zhèn)迪卡爾鄉(xiāng)Dekarcountry,Lukeqintown8/211001006/10沙坎爾農(nóng)場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/214177/1魯吐峪溝鄉(xiāng)Tuyugoucountry8/21277/4沙坎爾農(nóng)場Sakanrfarm8/218757/5魯吐峪溝鄉(xiāng)Tuyugoucountry8/21127/14沙坎爾農(nóng)場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21日347/15沙坎爾農(nóng)場Sakanrfarm8/21007/15魯吐峪溝鄉(xiāng)Tuyugoucountry8/21127/15移栽沙坎爾農(nóng)場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21007/20沙坎爾農(nóng)場北大荒BeidahuanginSakanrfarm8/21037/24平均發(fā)病率(%)Averageincidence(%)26.0745.8

1～11：Polerovirus屬病毒檢測結(jié)果，目標(biāo)基因片段1 300 bp左右；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

1-11:Polerovirusvirus detection results,the length of target fragment is 1,300 bp.M:DNA molecule marker

圖1 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣Polerovirus屬病毒分子檢測結(jié)果

Fig. 1 The molecule detection results ofPolerovirusvirus from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

圖2 鄯善縣甜瓜部分畸形、花葉類型病樣Polerovirus屬病毒檢測結(jié)果

Fig.2 The molecule detection results ofPolerovirusvirus from melon virus samples with deformity mosaic symptom in Shanshan County

1～11：WMV擴增結(jié)果，目標(biāo)基因片段1 000 bp (WMVF/WMVR引物對擴增)；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

1-11:WMV detection results,the length of target fragment is 1,000 bp(Amplified gene by ZYMVF/ZYMVR primer).M:DNA molecule marker

圖3 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣WMV分子檢測結(jié)果
Fig.3 The molecule detection results of wmv from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

1～11： ZYMV擴增結(jié)果，目標(biāo)基因片段約1 100 bp (ZYMVF/ZYMVR引物對擴增);M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)

1-11:ZYMV detection results,the length of target fragment is 1,100 bp(Amplified gene by ZYMVF/ZYMVR primer).M:DNA molecule marker

圖4 鄯善縣甜瓜黃葉類型病樣ZYMV分子檢測結(jié)果

Fig.4 The molecule detection results of ZYMV from melon virus samples with yellow systom in Shanshan County

1～29號為WMV檢測結(jié)果，目標(biāo)片段1 300 bp左右(WMV1F/WMV1R引物對擴增)；30～58號為ZYMV檢測結(jié)果，目標(biāo)片段596 bp左右(ZYMV1F/ZYMV1R引物對擴增)

1-29: WMV detection results, the length of target fragment is 1,300 bp(Amplified gene by WMV1F/WMV1R primer); 30-58:ZYMV detection results, the length of target fragment is 596 bp (Amplified gene by ZYMV1F/ZYMV1R primer)

圖5 鄯善縣甜瓜部分畸形、花葉類型病樣 WMV和ZYMV 檢測結(jié)果
Fig.5 The molecule detection results of WMV and ZYMV from melon virus samples with deformity mosaic symptom in Shanshan County

2.3 WMV、ZYMV、CABYV測序結(jié)果

將鄯善縣病樣以WMV、ZYMV兩種病毒特異性引物及Polerovirus屬病毒通用引物擴增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化克隆后以菌液送交上海英俊公司測序,測序結(jié)果在GENEBANK數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對, WMV新疆鄯善分離物(暫命名為XJturufan和XJturufan2)與WMV新疆SO3-21分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KP406644) 同源性達(dá)100%。ZYMV新疆鄯善分離物(暫命名為XJturufan和XJturufan2)與ZYMV斯洛文尼亞SE04T分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KF976713)同源性達(dá)99%。CABYV新疆分離物(暫命名為XJturufan)與CABYV韓國HS1分離物CP基因序列(NCBI 序列登錄號KR231952 )同源性達(dá)98%。測序結(jié)果表明經(jīng)PCR擴增得到了PCR產(chǎn)物分別為WMV、ZYMV、CABYV對應(yīng)基因序列，證明供試病樣分別為WMV、ZYMV、CABYV侵染。

2.4 兩種類型病樣不同病毒的侵染比例

供試29份畸形、花葉類型病毒病樣中25個病樣WMV檢測陽性、2個病樣CABYV檢測陽性、10個病樣ZYMV檢測陽性，以病毒復(fù)合侵染樣本統(tǒng)計所有供試樣品中2個病樣為WMV、ZYMV、CABYV復(fù)合侵染，7個病樣為WMV、ZYMV復(fù)合侵染。供試11份黃化類型病毒病樣中，含有WMV、ZYMV、CABYV侵染的病樣均為10份，并且9個樣本W(wǎng)MV、CABYV復(fù)合侵染數(shù)為，9個樣本為ZYMV、CABYV復(fù)合侵染，8個樣本為WMV、ZYMV、CABYV復(fù)合侵染。表4

2.5 WMV與ZYMV不同地區(qū)分離物間氨基酸序列比較

根據(jù)包括新疆吐魯番分離在內(nèi)的16個來源于不同地區(qū)的ZYMV分離物DNA序列推導(dǎo)其蛋白質(zhì)氨基酸序列并進(jìn)行序列比對，表明16個分離物NIB蛋白3’端與CP蛋白5’端之間均存在蛋白切割位點Q/S，并且所有分離物CP蛋白N端均存在DAG基序，但是新加坡分離物該基序突變?yōu)镚AG,法國和以色列分離物該基序突變?yōu)镈TG。

根據(jù)包括新疆吐魯番分離在內(nèi)的15個來源于不同地區(qū)的WMV分離物DNA序列推導(dǎo)其蛋白質(zhì)氨基酸序列并進(jìn)行序列比對，表明15個分離物CP蛋白5’端之間同樣存在DAG基序，但除澳大利亞分離物該基序突變?yōu)镈TG外，其余分離物該基序序列均為DAG。圖6，圖7

表4 鄯善縣黃化類型和畸形花葉類型病毒病樣三種病毒的檢測結(jié)果
Table 4 The detection result of yellow types virus disease samples and malformation mosaic types three virus disease samples in Shanshan county

癥狀類型Symptomtype統(tǒng)計項目Statisticalitems樣本數(shù)(個)SamplenumberWMVZYMVCABYVWMVZYMV共侵染InfectedbybothWMV、ZYMVWMVCABYV共侵染InfectedbybothWMV、CABYVZYMVCABYV共侵染InfectedbybothZYMV、CABYVZYMVWMVCABYV共侵染InfectedbybothZYMV、WMV、CABYV黃化類型Yellowtype樣本數(shù)(個)111010109998侵染比例(%)90.9190.9190.9181.8281.8281.8272.73畸形花葉類型Malformationmosaictype樣本數(shù)(個)29251027002侵染比例(%)86.2134.486.9024.140.000.006.90總計Total樣本數(shù)(個)40352012169910侵染比例(%)87.5050.0030.0040.0022.5022.5025.00

圖6 ZYMV 不同地區(qū)分離物NIB-CP基因氨基酸序列比對
Fig.6 NIB-CP gene amino acid sequence alignment between different ZYMV isolates from different regions

圖7 WMV 不同地區(qū)分離物CP基因氨基酸序列比對
Fig.7 CP gene amino acid sequence alignment between different ZYMV isolates from different regions

CABYV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自西班牙、法國、泰國、菲律賓、韓國、日本、烏茲別克斯坦等國分離物的CP基因序列應(yīng)用MEGA6.06軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。供試所有28個分離物可分為三個大組，CABYV吐魯番分離物、菲律賓、韓國、日本、烏茲別克斯坦以及包括大部分中國分離物在內(nèi)的亞洲國家分離物劃分至組Ⅰ，來自泰國的四個分離物及中國云南、廣西的分離物被劃分至組Ⅱ，西班牙、法國、臺灣及菲律賓的分離物被分組Ⅲ。研究獲得的CABYV新疆分離物與來自中國國內(nèi)省份的分離物親緣關(guān)系更近，大部分亞洲國家分離物與歐洲來源分離物間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但臺灣與菲律賓部分分離物與歐洲國家分離物親緣關(guān)系較近。圖8

WMV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自歐洲、亞洲、中東、北美、南美、澳洲等不同地區(qū)具有代表性國家的分離物CP基因序列應(yīng)用MEGA6.06軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，供試25個分離物可分為四個大組，WMV吐魯番分離物與法國、韓國、阿根廷、日本及大部分中國分離物劃分至組Ⅰ，來自中國新疆西瓜的分離物與意大利分離物單獨劃分至組Ⅱ，伊朗、以色列、西班牙、澳大利亞、土耳其分離物劃分至組Ⅲ，印度、新西蘭、委內(nèi)瑞拉、美國、智利、湯加分離物劃分至組Ⅳ。研究獲得的WMV吐魯番分離物與來自中國不同省份的分離物間親緣關(guān)系最近，同時其與法國、韓國、阿根廷、日本分離物間也具有一定的親緣關(guān)系。圖9

注：系統(tǒng)發(fā)育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖8 依據(jù)28個CABYV分離物CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.8 The Phylogenetic tree were constructed using nucleotide sequence of CP gene from 28 CABYV isolates

注：系統(tǒng)發(fā)育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖9 根據(jù)25個WMV分離物CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.9 The Phylogenetic tree were constructed using according to nucleotide sequence of CP gene from 25 WMV isolates

注：系統(tǒng)發(fā)育樹上分離物信息為GENEBANK登錄號-地理來源-分離物名稱-寄主來源，Bootstrap 值(%)大于50%顯示

Note: the phylogenetic tree isolate information include genebank accession number - geographic origin - isolate name - host source, Bootstrap value (%) showed greater than 50%

圖10 根據(jù)36個ZYMV分離物NIB-CP基因核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
Fig.10 The Phylogenetic tree were constructed according to nucleotide sequence of NIB-CP gene from 36 ZYMV isolates

ZYMV吐魯番分離物Xjturufan、Xjturufan2與來自亞洲、歐洲、美洲、大洋洲不同國家分離物的NIB-CP基因序列應(yīng)用MEGA6.06軟件采用近鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，供試36個分離物可被劃分至六個大組，研究獲得的新疆吐魯番分離物XJturufan2與斯洛伐克、捷克、匈牙利、敘利亞、伊拉克、法國、以色列、巴基斯坦、波蘭等歐洲及中東國家分離物與劃分至組Ⅰ，新疆吐魯番分離物XJturufan與中國浙江、河南、聊城、臺灣等地區(qū)分離物和美國、西班牙、日本等國分離被劃分至組Ⅱ，中國山西分離物99/193與韓國分離物Cu被劃分至組Ⅲ，中國臺灣THML1、TN3、PT5、TC1等4個分離物、中國浙江杭州P、SG等2個分離物、中國海南HN-01分離物被劃分至組Ⅳ，新加坡與留尼汪島分離物被劃分至組Ⅴ，中國山西BJ-03分離物、中國浙江杭州西瓜、南瓜、甜瓜三種作物來源分離物被單獨劃分至組Ⅵ。研究獲得的兩個分離物均來自新疆吐魯番地區(qū)甜瓜，但分屬于兩個不同的組，分離物XJturufan2與來自東歐、中東國家的分離物親緣關(guān)系更近，而分離物XJturufan與同屬組Ⅱ的中國浙江、河南、聊城、臺灣等地區(qū)分離物和美國、西班牙、日本等國分離物親緣關(guān)系更近。劃分的6個組群中，除組Ⅴ不含來自中國的分離物外，其余5組均包含中國分離物，表明ZYMV中國不同地區(qū)的分離物間分子變異比較大。圖10

3 討 論

3.1 經(jīng)調(diào)查2014年度吐魯番地區(qū)0.066 7×104hm2(1萬多畝)秋茬復(fù)播甜瓜病毒病以黃化癥狀和畸形、花葉癥狀兩種癥狀類型為主，兩種癥狀類型的病毒病發(fā)病率最高可達(dá)100%，但以畸形、花葉癥狀類型病毒病的平均發(fā)病率較高。從播種時間與病毒病發(fā)病程度相互關(guān)系來看，6月復(fù)播的甜瓜發(fā)病程度明顯重于7月復(fù)播甜瓜，發(fā)病程度與播種時間存在播種越晚發(fā)病程度越輕的趨勢，這種發(fā)病規(guī)律可能與吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病傳毒介體傳毒特性、當(dāng)?shù)夭煌瑫r間段田間寄主結(jié)構(gòu)變化和氣候條件等多重因素共同作用相關(guān)，其病害流行機制需通過進(jìn)一步試驗研究予以解析。

3.2 研究檢測的40個供試病毒病樣本中，WMV、ZYMV、CABYV侵染比例依次為87.5%、50%、30%，WMV、ZYMV兩種病毒在黃化癥狀和畸形、花葉癥狀的病毒病樣中的侵染比例均很高，因此WMV、ZYMV為吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的優(yōu)勢病毒。CABYV病毒已在全國多數(shù)地區(qū)均有分布[21, 24]，但是國內(nèi)相關(guān)研究中新疆地區(qū)的檢測樣本均來自南疆喀什地區(qū)，北疆地區(qū)的發(fā)生情況尚不明確，研究結(jié)果表明，吐魯番地區(qū)已有CABYV病毒病發(fā)生危害。2014年度采集自吐魯番甜瓜病毒病暴發(fā)流行區(qū)病毒病樣的檢測結(jié)果表明，黃化類型病毒病樣CABYV的侵染比例高達(dá)90%以上，畸形花葉類型病樣CABYV的侵染比例也達(dá)6.9%，因此CABYV已成為引起吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的主要病毒之一。黃化類型病樣中存在嚴(yán)重的WMV、ZYMV、CABYV復(fù)合侵染情況，上述兩種或兩種以上病毒在黃化類型病樣中復(fù)合侵染比例高達(dá)70%以上，但是從癥狀來看供試病樣均為黃化，而WMV、ZYMV單獨侵染的情況下甜瓜發(fā)病癥狀主要為畸形、皰斑、花葉，因此WMV、ZYMV、CABYV三種病毒間可能存在一定的互作而影響癥狀表現(xiàn)。CABYV是造成黃化癥狀的主要病毒，據(jù)調(diào)查吐魯番地區(qū)部分地塊黃葉癥狀病毒病發(fā)病率可達(dá)100%，因此CABYV的發(fā)生危害應(yīng)引起種植者的重視。

3.3 ZYMV等馬鈴薯Y病毒屬基因組的翻譯策略是先翻譯一個多聚蛋白,再經(jīng)自我催化切割成不同的蛋白質(zhì)。3’端CP蛋白與Nib切割位點一般為Q/G,QS/,Q/A。研究表明ZYMV兩個新疆吐魯番分離物的CP與NIB蛋白之間的切割位點為Q/S,而參與比較的其他國家分離物也表現(xiàn)相同的遺傳特征。

3.4 馬鈴薯Y病毒屬CP基因氨基酸序列中含有一段蚜傳所必需的DAG基序，該基序任意一個氨基酸殘基發(fā)生改變，該病毒分離物均會喪失蚜傳能力[25]。研究表明WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物該基序的氨基酸序列同樣為DAG,推測其應(yīng)具備蚜傳能力。但是參與比較的ZYMV新加坡分離物、法國分離物、以色列分離物及WMV澳大利亞分離物該基序分別突變?yōu)镚AG、DTG、DTG、 DTG，理論推測上述四個分離物失去蚜傳能力，劉衛(wèi)榮等[19]也曾報道WMV新疆昌吉分離物該基序突變?yōu)镈AE，表明不同地區(qū)WMV、ZYMV分離物蚜傳特征結(jié)構(gòu)域DAG存在一定的突變頻率，該突變也有可能影響不同地區(qū)分離物的致病傳播能力。

3.5 CABYV新疆吐魯番分離物與來自中國國內(nèi)省份的分離物親緣關(guān)系更近，而大部分亞洲國家分離物與歐洲來源分離物間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，尤其是地理位置較為相近的來自泰國的四個分離物與來自中國云南、廣西的分離物被劃分至一組，上述分析結(jié)果表明CABYV不同分離物間的遺傳差異與其地理來源相關(guān)。這主要是由于CABYV為非種傳病毒且以蟲傳為主，其相對于其他種傳病毒較難發(fā)生快速高頻率的遠(yuǎn)距離傳播，不同地理來源分離物間發(fā)生病毒基因重組的機率較低。

3.6 WMV、ZYMV吐魯番分離物均與來自中國不同省份的分離物間親緣關(guān)系最近，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明兩種病毒不同地理來源分離物間遺傳差異與地理分布間相關(guān)性不顯著。供試WMV、ZYMV不同地理來源分離物分別可劃分為4個亞組和6個亞組，表明兩種病毒不同地理來源分離物間分子變異較大。ZYMV除組Ⅴ不含來自中國的分離物外，其余5組均包含中國分離物，表明ZYMV中國不同地區(qū)的分離物間分子變異比較大。

4 結(jié) 論

吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病以黃化癥狀和畸形、花葉癥狀兩種癥狀類型為主，兩種癥狀類型的病毒病發(fā)病率最高可達(dá)100%，但以畸形、花葉癥狀類型病毒病的平均發(fā)病率較高。WMV、ZYMV為吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的優(yōu)勢病毒，CABYV已成為引起吐魯番地區(qū)甜瓜病毒病的主要病毒之一。ZYMV新疆吐魯番分離物的CP與NIB蛋白之間的切割位點為Q/S，WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物CP基因蚜傳特征結(jié)構(gòu)域DAG基序的氨基酸序列均為DAG。CABYV、WMV、ZYMV新疆吐魯番分離物與來自國內(nèi)省份的分離物親緣關(guān)系更近。

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Occurrence and Molecular Identification of Three Kinds of Melon Virus Diseases in Turpan Area, Xinjiang

HAN Shen1，HAN Cheng-gui1，Yushanjiang Maimaiti1，YANG Jun2, YANG Du1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.China/ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China；2.CollegeofAgricultureandBiotechnologyandStateKeyLaboratoryforAgro-Biotechnology/ChinaAgriculturalUniversity;Beijing100193,China；3.DevelopmentResearchCenterforGrapes,MelonsandFruitsofXinjiangUygurAutonomousRegion，ShanshanXinjiang838200,China)

【Objective】 To determine the occurrence situation of WMV, ZYMV, CABYV in Turpan area, and find out genetic differences between these virus isolates from different place.【Method】The Infection proportion of CABYV, WMV, ZYMV that infected melons in Turpan area were determined by the method for molecular detection. The genetic differences between the three kinds of viruses from Turpan and these isolates from different domestic and overseas place was analyzed by the method for sequence alignment and construction of phylogenetic trees.【Result】The positive rates of WMV, ZYMV and CABYV in 40 samples of virus disease in Turpan area were 87.5%, 50% and 30%, respectively. There was a protein cleavage site Q/S between NIB protein 3 'terminal and CP protein 5' ends of ZYMV isolates that were isolated from Turpan and other domestic and foreign places. The acid sequences of aphid transmission characteristic domains DAG motif of WMV isolates isolated from Turpan and other domestic and foreign places are DAG separation. The three viruses were divided into different subgroups according to phylogenetic tree.【Conclusion】WMV, ZYMV were the dominant viruses that infected muskmelon in Turpan area, CABYV has become one of the major virus causing muskmelon virus disease in Turpan area. CABYV, WMV Turpan isolates were closer to the isolates from China's domestic provinces, the ZYMV Turpan isolate XJturufan2 is closer to the isolates from Eastern Europe and the Middle East countries, But ZYMV Turpan isolates XJturufan are closer to the isolates from Zhejiang, Henan, Liaocheng, Taiwan in China and other isolates from The United States, Spain and Japan.

WMV; ZYMV; CABYV; phylogenetic tree; DAG motif

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.10.009

2016-03-10

新疆維吾爾自治區(qū)科研機構(gòu)創(chuàng)新發(fā)展專項資金項目“新疆甜瓜主要病害監(jiān)測與系統(tǒng)防控技術(shù)研究”(2014006)；新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才基金項目“新疆甜瓜Polerovirus屬與Potyvirus屬病毒鑒定與分子變異研究”(xjnky-2012-038)；農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室開放研究課題項目“新疆瓜類作物Polerovirus屬與Potyvirus屬病毒鑒定與分子變異研究”(2012SKLAB06-3)

韓盛(1981-)，男，河北海興人，助理研究員，碩士，研究方向為瓜類作物病害防治，(E-mail)hanshen_1981@163.com

楊渡(1964-)，男，新疆烏魯木齊人，研究員，研究方向為瓜類作物病害防治，(E-mail)zbsyangdu@ sina.cn

S436.5

A

1001-4330(2016)10-1829-14