直接貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞

方 曉,王康康,高維陸,張 輝,尹宗生

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直接貼壁法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞

方 曉,王康康,高維陸,張 輝,尹宗生

取90 g SPF級SD大鼠的雙后肢骨髓，分別使用直接貼壁法和密度梯度離心法獲得大鼠骨髓單個核細胞，用內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)基進行定向誘導(dǎo)分化7～14 d獲得大鼠內(nèi)皮祖細胞。免疫熒光染色和細胞功能學(xué)鑒定內(nèi)皮祖細胞，觀察內(nèi)皮祖細胞出現(xiàn)的時間和數(shù)量，CCK-8法鑒定細胞的增殖能力。與密度梯度離心法相比，直接貼壁法在內(nèi)皮祖細胞出現(xiàn)的時間、數(shù)量和增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。因此，相對于密度梯度離心法，直接貼壁法培養(yǎng)出的內(nèi)皮祖細胞分化時間更短、數(shù)量更多且增殖能力更強。

內(nèi)皮祖細胞；骨髓；直接貼壁法；密度梯度離心法

Asahara et al[1]于1997年首次成功從人外周血中分離出內(nèi)皮祖細胞，并指出這種細胞是血管生成的前體細胞，參與出生后血管生成，此后對內(nèi)皮祖細胞的研究不斷深入。內(nèi)皮祖細胞作為內(nèi)皮細胞的前體細胞，有向缺血區(qū)定向歸巢并分化為成熟內(nèi)皮細胞、遲發(fā)的高增殖潛能等特性，在維持血管內(nèi)皮完整性、修復(fù)受損血管內(nèi)皮細胞、促進新生血管形成及組織修復(fù)等方面起重要作用[2]。內(nèi)皮祖細胞對心腦血管疾病[3]、外周血管疾病[4]及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[5]等的治療有重要意義，并為缺血性疾病的治療提供了新思路。因此，內(nèi)皮祖細胞的生物學(xué)特性在臨床疾病上的應(yīng)用成為了醫(yī)學(xué)界研究的熱點。內(nèi)皮祖細胞主要存在于骨髓中，由骨髓中單個核細胞分化而來，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是使用密度梯度離心法，該研究主要使用直接貼壁法分離培養(yǎng)獲得目的細胞，并與密度梯度離心法進行多方面的比較。

1 材料與方法

1.1 材料 90 g健康SD大鼠，雄性，SPF級，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；EGM-2完全培養(yǎng)基購自瑞士LONZA公司；大鼠淋巴細胞分離液購自天津灝洋科技有限公司；鼠纖維聯(lián)接蛋白(rat fibronectin,FN )購自瑞士Gene Operation公司；CD133抗體購自美國 Biorbyt公司；DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-ac-LDL)購自美國 Invitrogen公司；異硫氰酸熒光素荊豆凝集素-1(FITC-UEA-1)購自美國Sigma公司；TRITC-羊抗兔IgG和FITC-羊抗小鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng) SD大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后采用頸椎脫臼法處死，75%酒精浸泡消毒5～10 min，將處死后的大鼠置入無菌彎盤中，超凈臺內(nèi)嚴格行無菌操作原則，組織剪剪開大鼠雙后肢皮膚，分離肌肉組織，暴露并離斷股骨、脛骨，去除骨四周附著的軟組織，注意盡可能多保留骨髓含量最豐富的兩側(cè)干骺端。用注射器抽吸10 ml PBS緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔，骨髓沖洗液不銹鋼濾網(wǎng)過濾，移液管吹打，得到均勻的骨髓懸液。將所得骨髓懸液分成兩份，一份加入紅細胞裂解液后離心重懸制成1×106/ml的細胞懸液，接種到提前鋪有FN的6孔板中；另一部分按照淋巴細胞分離液說明書使用密度梯度離心法獲得單核細胞并制成1×106/ml的細胞懸液，接種到鋪有FN的6孔板中。每孔加入含EGM-2培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。接種48 h后首次換液，棄未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2～3 d換液，加入新鮮培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)的變化；接種10～20 d，待原代細胞逐漸融合至80%，按1 ∶2或1 ∶3比例進行細胞傳代。

1.2.2 大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 首次換液后，每日在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照記錄。待每孔細胞形態(tài)變?yōu)樗笮巍⒎只蓛?nèi)皮祖細胞時，用細胞計數(shù)板統(tǒng)計每孔細胞數(shù)量。

1.2.2.2 免疫熒光鑒定 取第三代分離培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光法鑒定Flk-1和CD133的表達。將第三代分離培養(yǎng)的細胞制成細胞懸液，以1×106/ml的細胞濃度接種于已行FN包被的24孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中約24 h，使內(nèi)皮祖細胞貼壁良好，完成爬片。用4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，0.2% Triton X-100作用10 min后，PBS洗3次，加入羊血清室溫封閉30 min，傾去羊血清，PBS沖洗3次，加入兔抗大鼠Flk-1抗體(1 ∶50)和小鼠抗大鼠CD133抗體(1 ∶50)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗3次，空白對照用PBS代替一抗。加入TITC標記的山羊抗兔抗體和FITC標記的山羊抗小鼠抗體，避光室溫放置2 h，PBS洗3次。每孔加入DAPI 100 μl，避光室溫放置5 min，PBS洗3次，在載玻片上滴加抗熒光淬滅液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.2.3 細胞功能學(xué)鑒定 同以上方法獲得貼壁的內(nèi)皮祖細胞，每孔加入DiI-ac-LDL濃度為10 μg/ml的EGM-2完全培養(yǎng)基500 μl，37 ℃避光孵育4 h后棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次，每孔中加入FITC-UEA-1，37 ℃避光孵育1 h后棄去多余染料，PBS洗3次。每孔加入DAPI 100 μl，避光室溫放置5 min，PBS洗3次，在載玻片上滴加抗熒光淬滅液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 內(nèi)皮祖細胞增殖能力的鑒定 自首次換液后，每日倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。記錄出現(xiàn)梭形細胞的時間和細胞鋪滿瓶底的時間。分別取生長狀態(tài)良好的第3代細胞胰酶消化后制作成單細胞懸液，以1×105/ml的密度接種在5個96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。從第2天開始，每24 h隨機取一塊板，每孔加入CCK-8試劑10 μl，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后置酶標儀上空白孔調(diào)零，選擇490 nm波長下測各孔光密度(opticaldensity，OD)值，連續(xù)測5 d，以時間為橫軸，OD值為縱軸繪制細胞生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 剛分離獲得的細胞為圓形(圖1A)，體積較小,懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)48 h后,棄去未貼壁細胞，直接貼壁組鏡下可見貼壁細胞呈梭形或多角形(圖1B,箭頭所指為梭形細胞)，核呈橢圓形, 部分細胞形成集落，也有部分長梭形細胞首尾相連排列成直線狀。梯度密度離心組鏡下見大量小而圓的貼壁細胞，未見明顯梭形或多角形細胞，直至培養(yǎng)96 h后見貼壁的梭形或多邊形細胞。直接貼壁法首次出現(xiàn)梭型形態(tài)細胞的時間為(49±1.55)h，而密度梯度離心法首次出現(xiàn)梭型形態(tài)細胞的時間為(95.5±2.26) h，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=41.59，P<0.01)。培養(yǎng)1周后，直接貼壁組細胞匯合度約80%(圖1D)，密度梯度離心組細胞匯合度小于50%(圖1C)。待貼壁細胞完全分化成內(nèi)皮祖細胞時，直接貼壁組細胞數(shù)量為(82.17±1.48)×104個每孔，密度梯度離心組細胞數(shù)量為(62.08±0.92)×104個每孔，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.25，P<0.01)。

圖1 內(nèi)皮祖細胞生長情況 ×200

A：剛分離獲得的單核細胞；B：48 h已開始分化的內(nèi)皮祖細胞；C：7 d密度離心組內(nèi)皮祖細胞；D：7 d直接貼壁組內(nèi)皮祖細胞

2.2 內(nèi)皮祖細胞的細胞表型鑒定 將獲得細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后行免疫熒光染色，直接貼壁法和密度梯度離心法獲得的細胞染色皆為Flk-1和CD133雙陽性，紅色為Flk-1陽性，綠色為CD133陽性，藍色為DAPI對核的染色(圖2)，符合內(nèi)皮祖細胞的免疫熒光鑒定。

圖2 內(nèi)皮祖細胞免疫熒光鑒定結(jié)果 ×200

2.3 細胞功能學(xué)鑒定 將獲得細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后行Dil-ac-LDL及FITC-UEA-1熒光檢測，倒置熒光顯微鏡下觀察經(jīng)過兩種不同方法獲得的細胞攝取Dil-ac-LDL在565 nm波長激發(fā)光激發(fā)時呈現(xiàn)紅色熒光，而其結(jié)合FITC-UEA-1在525 nm波長激發(fā)光激發(fā)時呈現(xiàn)綠色熒光，藍色為DAPI對細胞核的染色(圖3)，雙熒光標記的細胞被認為是可以分化為內(nèi)皮細胞的前體細胞。

2.4 細胞增殖能力鑒定 在原代培養(yǎng)中，直接貼壁組在首次48 h換液即可見梭形或多角形形態(tài)的細胞，密度梯度離心組在96 h才開始出現(xiàn)梭形形態(tài)細胞。根據(jù)CCK-8法所繪制的生長曲線顯示，直接貼壁組OD值為0.251±0.067，密度梯度離心組OD值為0.225±0.049，細胞原代培養(yǎng)后兩組細胞增殖能力比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.37，P<0.05)，見圖4。

圖3 細胞功能學(xué)鑒定 ×200

A：攝取Dil-ac-LDL的細胞；B：結(jié)合FITC-UEA-1；C：DAPI標記的細胞核；D：合成圖像

圖4 CCK8法檢測內(nèi)皮祖細胞增殖能力

3 討論

分離獲得內(nèi)皮祖細胞可以有很多來源部位，成人外周血、臍血、脾臟及骨髓等組織中均存在內(nèi)皮祖細胞，其中，骨髓中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量最多[6]，大約是外周血中的內(nèi)皮祖細胞數(shù)量的500倍。由于目前內(nèi)皮祖細胞表面缺乏特異性表面標志物，學(xué)術(shù)界對內(nèi)皮祖細胞的鑒定有較大爭議，但是大多數(shù)人認為Flk-1和CD133雙陽性和吞噬Dil-ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-1實驗雙陽性的細胞可以被認為是內(nèi)皮祖細胞[7]，本實驗采用該方法來鑒定內(nèi)皮祖細胞。

目前,在體外分離內(nèi)皮祖細胞的方法有很多種，主要有密度梯度離心法和免疫磁珠分選法[8]。免疫磁珠分選法主要采用CD34或CD133抗體，此方法最大的優(yōu)點是可以收集到純度較高的內(nèi)皮祖細胞[9]。但是目前內(nèi)皮祖細胞缺乏特異性的表面標志物，同時免疫磁珠分選法要求實驗條件較高、操作復(fù)雜、價格昂貴、獲得細胞量少，因此難以推廣。然而密度梯度離心法相對于免疫磁珠分選法操作簡單，使用方便[10]，但可能獲得的細胞純度低，只能將骨髓中整個單核細胞(包括內(nèi)皮祖細胞)分離出來，并包括部分血小板、成纖維細胞等。雖然密度梯度離心法操作相對簡單，但是在操作過程中需要對細胞進行反復(fù)離心，對細胞損傷較大。相對于其他原代細胞，內(nèi)皮祖細胞非常脆弱，在后期誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中貼壁分化需要較長時間、增殖緩慢，這些可能和在提取過程中反復(fù)離心有很大關(guān)系。因此先使用紅細胞裂解液去除骨髓中的大量紅細胞，然后將獲得的標本直接接種在6孔板里進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過多次的傳代純化得到純度較高的內(nèi)皮祖細胞。通過免疫熒光鑒定和細胞功能學(xué)檢測，由此兩種方法獲得的細胞皆是內(nèi)皮祖細胞。并且直接貼壁法實驗操作更加簡單，獲得的細胞增殖能力更強，可以為后期實驗方便快捷的提供更多優(yōu)質(zhì)的內(nèi)皮祖細胞。

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Isolation and culture of endothelial progenitor cell by direct adherent methodinvitro

Fang Xiao, Wang Kangkang, Gao Weilu,et al

(DeptofOrthopaedics,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230022)

The bone marrow taken from both hindlimbs of SD rats was divided into two parts, mononuclear cell was obtained by direct adherent method and density gradient centrifugation, respectively. Endothelial progenitor cell(EPC) was induced to differentiate from mononuclear cell when cultured 7 to 14 days in EGM-2. EPC was identified by immunofluorescence staining and experimental study of cell function; number of EPC and the time of EPC appeared were recorded; proliferation ability was examined by CCK-8 method. The time when EPC first emerged, number of EPC, and proliferation ability in direct adherent group were significantly than those in density gradient centrifugation group. Therefore, compared with density gradient centrifugation, the cell isolated by direct adherent method could get more cells, need less time to differentiate into EPC and have bigger proliferation potential.

endothelial progenitor cell；bone marrow；direct adherent method；density gradient centrifugation

國家自然科學(xué)基金(編號：81171173)

安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)與骨腫瘤科，合肥 230022

方 曉，男，碩士研究生； 尹宗生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：yinzongsheng1961@sina.com

時間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.034.html

R 394.26

A

1000-1492(2016)11-1696-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.034

2016-06-27接收