氯化鋰抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡

李建立，朱喜春，崔紅賞，劉 銳

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氯化鋰抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡

李建立1，朱喜春1，崔紅賞2，劉 銳3

目的 探討氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡的影響及機(jī)制。方法 體外原代培養(yǎng)7 d的大鼠皮層神經(jīng)元，用MTT法檢測不同濃度氯化鋰(0.1、1、5、10 μmol/L)單獨(dú)作用皮層神經(jīng)元12 h后神經(jīng)元存活率的變化。神經(jīng)元隨機(jī)分為6組：溶劑對(duì)照組(給予等容積的20%脂肪乳)，丙泊酚組(終濃度為500 μmol/L)，氯化鋰+丙泊酚組(氯化鋰終濃度分別為0.1、1、5、10 μmol/L，丙泊酚終濃度為500 μmol/L)，藥物處理12 h后，MTT法檢測神經(jīng)元存活率的變化，Hoechst33258核染色法和流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元調(diào)亡，Western blot法測定神經(jīng)元磷酸化糖原合成酶激酶-3β(pGSK-3β)和裂解半胱天冬酶-3(cleaved-Caspase-3)蛋白水平。結(jié)果 與溶劑對(duì)照組比較，不同濃度氯化鋰單獨(dú)作用神經(jīng)元12 h后，神經(jīng)元存活率未見顯著變化。與溶劑對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率顯著下降(P<0.01)，神經(jīng)元凋亡率顯著增加(P<0.01)，pGSK-3β蛋白水平顯著下降(P<0.01), cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.01)。與丙泊酚組比較，氯化鋰可劑量依賴性增加神經(jīng)元存活率(P<0.01)，神經(jīng)元凋亡率顯著下降(P<0.01)，pGSK-3β蛋白水平顯著增加(P<0.01), cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降(P<0.01)。結(jié)論 氯化鋰可抑制丙泊酚誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡，其機(jī)制可能與提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平有關(guān)。

丙泊酚；氯化鋰；神經(jīng)凋亡；原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元；pGSK-3β；cleaved-Caspase-3

研究[1-2]表明出生7 d SD大鼠連續(xù)大劑量應(yīng)用丙泊酚可引起大腦多個(gè)腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，并引起大鼠成年后的學(xué)習(xí)記憶功能損傷。體外原代培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明丙泊酚可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡[3-4]。氯化鋰作為精神科的常用藥物，在臨床上被廣泛用于治療雙向情感障礙[5]。近年來研究[6-7]表明鋰劑可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和老年退行性疾病，如阿爾茨海默病等。以往有研究[8]表明氯化鋰可對(duì)抗麻醉藥氯胺酮和丙泊酚所引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞損傷，但具體機(jī)制目前還不清楚，該研究利用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，探討氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 丙泊酚(propofol，意大利AstraZeneca公司，批號(hào)：KW814)；20%脂肪乳(廣州百特公司)；Neurobasal培養(yǎng)液、B27促生長劑、DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)； DMSO、MTT、17β雌二醇(美國Sigma公司)； 胰蛋白酶和Hoechst33258染料(北京索來寶公司)； Annexin V-FITC 試劑盒(浙江聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phospho glycogen synthase kinase-3β,pGSK-3β)和裂解半胱天冬酶-3(cleaved-cysteine protease protein-3,cleaved-Caspase-3)(美國Cell signal Technology公司)。

1.2 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 新生1 d 內(nèi)的SD幼鼠取額葉皮質(zhì)，用冷PBS液沖洗，去除腦膜和血管后放入DMEM培養(yǎng)基中剪碎，然后放入37 ℃水浴鍋內(nèi)將皮層組織充分消化(0.125%胰蛋白酶)15 min，然后將皮層組織移入DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)終止胰蛋白酶的作用，然后把細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含DMEM培養(yǎng)基中(含10%胎牛血清)輕輕吹打制成細(xì)胞懸液。用100目鋼絲篩將細(xì)胞懸液過濾，計(jì)數(shù)后接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，放于5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換成Neurobasal+B27培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2 d半量換液1次。神經(jīng)元體外培養(yǎng)至7 d用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 觀察不同濃度氯化鋰對(duì)皮層神經(jīng)元存活率的影響，分為4組：溶劑對(duì)照組，氯化鋰處理組(終濃度分別為0.1、1、5、10 μmol/L)。 觀察氯化鋰對(duì)丙泊酚引起皮層神經(jīng)元損傷的影響時(shí)，分為6組：溶劑對(duì)照組(給予等容積的20%脂肪乳)，丙泊酚組(終濃度為500 μmol/L)，氯化鋰+丙泊酚不同濃度組(丙泊酚終濃度為500 μmol/L，氯化鋰終濃度分別為0.1、1、5、10 μmol/L)。

1.4 MTT法檢測神經(jīng)元存活率 按不同分組將神經(jīng)元給予藥物處理12 h，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。然后每孔加入10 μl MTT液，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，加入DMSO 200 μl/孔，震蕩5 min溶解甲臜，酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度值。以對(duì)照組平均吸光度值為100%，以各處理組吸光度值與對(duì)照組的比值計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5 Hoechst33258核染色法測定神經(jīng)元凋亡 體外培養(yǎng)7 d的神經(jīng)元，按分組分別給予不同藥物處理12 h后，顯微鏡下觀察神經(jīng)元成長情況。然后移去培養(yǎng)液，用冷PBS沖洗神經(jīng)元去除雜質(zhì)和死細(xì)胞， 每孔加入4%多聚甲醛200 μl將細(xì)胞固定30 min，去除多聚甲醛后，用冷PBS沖洗1次，然后每孔加入Hoechst33258染液1 ml處理神經(jīng)元8 min后，冷PBS漂洗。在熒光顯微鏡(日本奧林巴斯，型號(hào)B×41)下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算神經(jīng)元的凋亡率，凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元凋亡 體外培養(yǎng)至7 d給予不同干預(yù)措施處理神經(jīng)元12 h后，移去培養(yǎng)液，冷PBS液沖洗神經(jīng)元3次，加入0.125%胰酶，邊消化邊鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起回縮，胞體變圓時(shí)立即加入培養(yǎng)基終止消化。然后輕輕吹打混勻用PBS重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)使每管細(xì)胞數(shù)目不少于1× 109/ml,然后轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min離心5 min，去除上清液，收集細(xì)胞。PBS液沖洗細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，去除上清液， 暗室中加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，然后加入10 μl PI染色液，輕輕混勻，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用美國BD公司流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各處理組神經(jīng)元的凋亡率。

1.7 Western blot法測定神經(jīng)元pGSK-3β和cleaved-Caspase-3蛋白水平 體外培養(yǎng)至7 d給予不同干預(yù)措施處理神經(jīng)元12 h后，用0.25%胰酶將細(xì)胞消化收集后裂解，BCA法測定總蛋白含量。將蛋白加上樣緩沖液煮沸變性，以10% SDS二聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h分離, 經(jīng)過2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫下封閉1 h分別加入一抗pGSK-3β和cleaved-Caspase-3抗體(1 ∶2 000稀釋), 4 ℃孵育過夜, 常規(guī)洗滌，加入二抗(1 ∶5 000)37 ℃孵育60 min，洗滌，電化學(xué)法發(fā)光顯色，X線片曝光。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參照條帶吸光度的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次, 設(shè)β-actin蛋白為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度氯化鋰對(duì)皮層神經(jīng)元存活率的影響 與溶劑對(duì)照組(99.8±6.3)%比較，不同濃度氯化鋰(0.1、1、5、10 μmol/L)單獨(dú)作用皮層神經(jīng)元12 h后，神經(jīng)元存活率分別為(98.8±4.9)%、(99.1±5.2)%、(98.6±6.7)%、(99.2±7.2)%，未見顯著性變化(F=2.125,P>0.05)。

2.2 氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷的影響 與溶劑對(duì)照組(99.9±7.9)%比較，丙泊酚組神經(jīng)元存活率(57.3±4.5)%顯著下降(P<0.01)。不同濃度氯化鋰(0.1、1、5、10 μmol/L)處理后，神經(jīng)元存活率分別為(60.2±4.6)%、(70.3±6.1)%、(79.3±6.2)%、(85.7±6.7)%，與丙泊酚組比較，1、5、10 μmol/L氯化鋰處理組均顯著增加(F=65.095,P<0.01)，其中10 μmol/L氯化鋰保護(hù)作用最好。

2.3 氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響 Hoechst33258核染色法檢測神經(jīng)元凋亡，結(jié)果顯示：與溶劑對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率顯著增加(P<0.01)。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元凋亡率顯著下降(F=34.636,P<0.01)。見圖1。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了氯化鋰抑制丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡。見圖2。

圖1 Hoechst33258核染色法檢測氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的影響±s) ×400

A:溶劑對(duì)照組；B:丙泊酚組；C:氯化鋰+丙泊酚組；與溶劑對(duì)照組比較：**P<0.01；與丙泊酚組比較：##P<0.01

2.4 不同處理對(duì)皮層神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平的影響 與溶劑對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平顯著降低(P<0.01)。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平顯著增加(F=98.546,P<0.01)。見圖3。

2.5 不同處理對(duì)皮層神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響 與溶劑對(duì)照組比較，丙泊酚組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.01)。與丙泊酚組比較，氯化鋰+丙泊酚組神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平顯著下降(F=76.329,P<0.01)。見圖4。

A:溶劑對(duì)照組；B:丙泊酚組；C:氯化鋰+丙泊酚組

圖3 不同處理對(duì)皮層神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平的影響

與溶劑對(duì)照組比較：**P<0.01；與丙泊酚組比較：##P<0.01

3 討論

丙泊酚是否適用于新生兒和嬰幼兒的全身麻醉，目前觀點(diǎn)不一。研究[1-4]表明丙泊酚具有發(fā)育期神經(jīng)毒性，大劑量長時(shí)間應(yīng)用可對(duì)發(fā)育期動(dòng)物大腦廣泛腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞和原代培養(yǎng)神經(jīng)元產(chǎn)生凋亡樣損傷，因此丙泊酚對(duì)嬰幼兒大腦產(chǎn)生損傷的機(jī)制以及尋找藥物防治其損傷引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。

圖4 不同處理對(duì)皮層神經(jīng)元cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響

與溶劑對(duì)照組比較：**P<0.01；與丙泊酚組比較：##P<0.01

動(dòng)物試驗(yàn)研究[8]表明氯化鋰可抑制丙泊酚引起的發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡，但作用機(jī)制還不十分清楚。為進(jìn)一步研究氯化鋰抑制丙泊酚引起的發(fā)育期大腦損傷的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元，顯示氯化鋰可通過提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平進(jìn)而抑制丙泊酚誘導(dǎo)原代培養(yǎng)皮層神經(jīng)元凋亡。

研究[9-11]表明以GSK-3β為中心的信號(hào)通路在麻醉藥誘導(dǎo)發(fā)育期大腦神經(jīng)損傷中發(fā)揮著重要作用。GSK-3β在大腦分布廣泛，主要定位于神經(jīng)元樣細(xì)胞，是細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，其活化與神經(jīng)元的凋亡直接相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GSK-3β通過激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活與凋亡，參與神經(jīng)系統(tǒng)的多種病理生理過程，GSK-3β活性異常會(huì)引起下游信號(hào)通路的異常，進(jìn)而引起許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[12]。以往研究[11]顯示丙泊酚可降低發(fā)育期大鼠大腦pGSK-3β蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而引起大鼠大腦廣泛腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡是麻醉藥引起發(fā)育期大腦神經(jīng)損傷的主要機(jī)制之一。凋亡受凋亡調(diào)節(jié)基因的控制，Bcl-2是調(diào)控凋亡的主要基因，可抑制凋亡過程中起重要作用的因子如Caspase-3和Caspase-9的活化。Caspase-3是凋亡發(fā)生的最終執(zhí)行者，是凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，隨著Caspase-3蛋白的活化，細(xì)胞將發(fā)生不可逆性凋亡。GSK-3β誘導(dǎo)Caspase-3活化可能是引起凋亡的重要機(jī)制。本研究結(jié)果表明丙泊酚作用皮層神經(jīng)元12 h，降低了神經(jīng)元GSK-3β Ser9 位點(diǎn)的磷酸化水平，引起神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平的顯著性下降，同時(shí)使cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著性增加，提示丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡可能與pGSK-3β蛋白水平下降和cleaved-Caspase-3蛋白水平增加有關(guān)。

與促凋亡作用相反，抑制GSK-3β活性提高pGSK-3β蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生抗凋亡作用，對(duì)細(xì)胞存活發(fā)揮著重要作用。氯化鋰作為一種GSK-3β活性抑制劑，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在精神障礙性疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。近年來氯化鋰的神經(jīng)保護(hù)作用受到廣泛重視。研究[13]表明氯化鋰通過抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，可治療腦缺血和慢性神經(jīng)退行性病變。另有研究[14]表明氯化鋰可抑制新生鼠缺血缺氧引起的大腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步觀察氯化鋰對(duì)丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元損傷的影響，結(jié)果表明不同濃度氯化鋰單獨(dú)作用皮層神經(jīng)元12 h未發(fā)現(xiàn)對(duì)皮層神經(jīng)元存活率產(chǎn)生影響，但可抑制丙泊酚引起的皮層神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元存活率顯著增加和神經(jīng)元凋亡率顯著下降。同時(shí)結(jié)果表明氯化鋰可通過抑制丙泊酚引起的神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平下降，降低cleaved-Caspase-3蛋白水平，抑制丙泊酚誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元凋亡，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用。

綜上所述，氯化鋰具有抑制丙泊酚誘導(dǎo)皮層神經(jīng)元凋亡的作用，其機(jī)制可能是通過提高神經(jīng)元pGSK-3β蛋白水平和降低cleaved-Caspase-3蛋白水平實(shí)現(xiàn)的。本研究為圍術(shù)期應(yīng)用氯化鋰預(yù)防丙泊酚對(duì)嬰幼兒大腦產(chǎn)生神經(jīng)損傷提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Lithium chloride ptotects against propofol-induced apoptosis on primary cultured neurons

Li Jianli1, Zhu Xichun1, Cui Hongshang2, et al

(1DeptofAnesthesiology,2DeptofThoracicSurgery,HebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051)

ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsandthemechanismsoflithiumchlorideonthepropofol-inducedneuroapoptosisonprimaryculturedcorticalneurons.MethodsCorticalneuronswereprimarilyculturedforsevendays,andtreatedwithdifferentconcerntrationsoflithiumchloride(0.1,1,5,10μmol/L),andtheneuronviabilitywasmeasuredbyMTTassayafter12htreatments.Corticalneuronsweredividedintothreegroups:vehicle-controlgroup(treatedwithequalvolumeofintralipid),propofol-treatedgroup(treatedwith500μmol/Lpropofol),propofol+lithiumchloridetreatedgroup(treatedwith500μmol/Lpropofoland10μmol/Llithiumchloride).Theneuronsweretreatedfor12h;theneuronviabilitywasmeasuredbyMTTassay;neuroapoptosiswasdetectedbyHoechst33258stainingandFCMassay,andpGSK-3βandcleaved-Caspase-3proteinsweredetectedbyWesternblot.ResultsTheneuronviabilitywasnotaffectedbyvariousconcentrationsoflithiumchloride.Comparedwiththevehicle-controlgroup,theneuronviabilitydecreasedgreatly(P<0.01),theneuroapoptosisincreasedgreatly(P<0.01),thepGSK-3βproteinleveldecreased(P<0.01),andcleaved-Caspase-3proteinlevelincreased(P<0.01)inpropofol-treatedgroup.Comparedwiththepropofol-treatedgroup,lithiumchlorideincreasedneuronviabilityindose-dependentmanner(P<0.01),theneuroapoptosisdecreasedgreatly(P<0.01),thepGSK-3βproteinlevelincreased(P<0.01),andcleaved-Caspase-3proteinleveldecreased(P<0.01)inpropofol+lithiumchloridetreatedgroup.ConclusionLithiumchloridecanprotectagainstpropofol-inducedneuroapoptosisonprimaryculturedneuronsbyincreasingthelevelofpGSK-3βanddecreasingthelevelofcleaved-Caspase-3.

propofol;lithiumchloride;neuroapoptosis;primaryculturedcorticalneuron;pGSK-3β;cleaved-Caspase-3

河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號(hào)：ZL20140095)；2015年政府資助臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才培養(yǎng)和基礎(chǔ)課題研究項(xiàng)目(編號(hào)：361003-6)

河北省人民醫(yī)院1麻醉科、2胸外科，石家莊 0500513河北省胸科醫(yī)院呼吸內(nèi)科，石家莊 050000

李建立，男，副教授，博士，責(zé)任作者，E-mail:hblijianli@163.com

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.012.html

R 971.2;R 965

A

1000-1492(2016)11-1608-05

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.012

2016-06-27接收