EIF2AK2和NLRP3相互作用影響細(xì)胞分泌IL-1β的研究

鞠小麗，王 強(qiáng)

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EIF2AK2和NLRP3相互作用影響細(xì)胞分泌IL-1β的研究

鞠小麗1，王 強(qiáng)2

目的 研究真核細(xì)胞翻譯起始因子2AK2(EIF2AK2)蛋白對(duì)Nod樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥體激活及細(xì)胞分泌IL-1β的影響。方法 在HEK-293細(xì)胞中，通過(guò)轉(zhuǎn)染凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、NLRP3、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和促白細(xì)胞介素-1β(pro-IL-1β)基因構(gòu)建NLRP3炎癥體，并檢測(cè)EIF2AK2蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞分泌炎癥性細(xì)胞因子IL-1β的影響；通過(guò)免疫共沉淀研究EIF2AK2蛋白和NLRP3蛋白相互作用。最后在人單核THP-1細(xì)胞中通過(guò)siRNA干擾驗(yàn)證EIF2AK2對(duì)IL-1β分泌水平的影響。結(jié)果 在HEK-293細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)EIF2AK2蛋白能激活NLRP3炎癥體后誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β，并且IL-1β分泌水平隨EIF2AK2表達(dá)水平提高而增加。免疫共沉淀結(jié)果顯示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白發(fā)生相互作用。THP-1細(xì)胞中siRNA干擾抑制EIF2AK2表達(dá)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌IL-1β減少。結(jié)論 EIF2AK2蛋白能調(diào)控NLRP3炎癥體的激活從而影響細(xì)胞分泌促炎癥因子IL-1β。

NLRP3炎癥體; EIF2AK2; IL-1β分泌; 蛋白相互作用

先天免疫系統(tǒng)通過(guò)各種模式識(shí)別相關(guān)分子(pathogen-associated molecular patterns, PAMP)識(shí)別各種病原體后抵抗病原體入侵[1]。炎癥體是一種由模式識(shí)別相關(guān)分子組成的大分子復(fù)合物。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎癥體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白 (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)和天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-containing aspartate-specific proteases-1，caspase-1)組成的分子量約為700 ku的大分子復(fù)合物[2-3]。目前研究[4]顯示多種PAMP如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)、單鈉尿酸鹽晶體(monosodium urate,MSU)、 膽固醇結(jié)晶、 β淀粉樣蛋白等內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)都能引起 NLRP3炎癥體的激活。NLRP3炎癥體異常激活參與多種代謝異常疾病如Ⅱ型糖尿病、阿爾茨海默病和動(dòng)脈粥樣硬化等[5]。NLRP3炎癥體激活3種模型：線(xiàn)粒體 DNA 假說(shuō)、活性氧假說(shuō)和溶酶體破裂假說(shuō)[4]。已報(bào)道SGT1和Hsp90[6]、TXNIP、TRIM30[7]和GPSM3等蛋白能和NLRP3相互作用從而調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體激活。真核細(xì)胞翻譯起始因子2AK2(eukaryotic translation initiation factors 2AK2, EIF2AK2)最初發(fā)現(xiàn)是一個(gè)病原識(shí)別分子, 該蛋白N末端能和雙鏈RNA結(jié)合誘導(dǎo)C末端催化區(qū)域活化[8]。該研究通過(guò)在HEK-293細(xì)胞中重構(gòu)NLRP3炎癥體研究EIF2AK2在NLRP3炎癥體激活中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚腎細(xì)胞HEK-293和人單核細(xì)胞 THP-1購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)；DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；人IL-1β ELISA 試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司；MSU和ATP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HA和Flag抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司; 二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 NLRP3炎癥體在HEK-293細(xì)胞中構(gòu)建 通過(guò)基因特異性引物分別從人的cDNA中擴(kuò)增ASC、 NLRP3、 Caspase-1和促白細(xì)胞介素-1β(pro-interleukin-1β, pro-IL-1β)基因并克隆到pMD18-T載體上。隨后分別用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切后連接到用相同酶切的真核表達(dá)載體pcDNA3，分別得到pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β重組體。按1×105個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μl培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。 第2天分別將10 ng pcDNA3-ASC、20 ng pcDNA3-NLRP3、 5 ng pcDNA3-Caspase-1和100 ng pcDNA3-pro-IL-1β重組體通過(guò)X-tremeGENE HP共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h分別收集的上清液，通過(guò)ELISA法檢測(cè)HEK-293細(xì)胞分泌IL-1β水平。在研究EIF2AK2對(duì)IL-1β分泌影響實(shí)驗(yàn)中，除了按上面將pcDNA3-ASC、pcDNA3-NLRP3、pcDNA3-Caspase-1和pcDNA3-pro-IL-1β共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞外，還將25～200 ng的pcDNA3-HA-EIF2AK2的共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后 24 h分別收集細(xì)胞上清液并檢測(cè)HEK-293細(xì)胞分泌IL-1β水平。

1.3 免疫沉淀反應(yīng) 將克隆到pMD18-T載體的EIF2AK2和NLRP3基因分別通過(guò)BamH I和Xho I位點(diǎn)克隆到pEAK-HA和pCMV-Tag 2，隨后克隆到pcDNA3上形成含HA標(biāo)簽的pcDNA3-HA-EIF2AK2重組體和Flag標(biāo)簽的cDNA3-Flag-NLRP3重組體。按1×106個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜。將pcDNA3-HA-EIF2AK2和pcDNA3-Flag-NLRP3重組體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS液沖洗細(xì)胞2遍后，用1 ml 含1% NP-40的細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min。收集細(xì)胞上清液后加入1 μg小鼠抗 Flag單克隆抗體,4 ℃旋轉(zhuǎn)混合2 h , 加入 20 μl蛋白A繼續(xù)混合過(guò)夜, 離心后去上清液, 用細(xì)胞裂解液洗滌沉淀 3遍, 加入 20 μl的SDS-PAGE上樣緩沖液, 煮沸 5 min,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。

1.4 Western blot法檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解液裂解后收集上清液獲得細(xì)胞總蛋白，并通過(guò)BCA方法進(jìn)行蛋白定量。將20 μl蛋白樣品上樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后用半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜, 5%脫脂奶粉封閉 1 h , 然后加入1 ∶2 000稀釋的兔抗 HA 多克隆抗體,4 ℃孵育過(guò)夜, 用 0.5% TBST洗膜3次, 加入 1 ∶10 000稀釋的羊抗兔二抗, 室溫孵育1 h,用0.5% TBST洗膜3次, 按照操作說(shuō)明, 加入化學(xué)發(fā)光液, 進(jìn)行凝膠成像顯影。

1.5 siRNA干擾EIF2AK2及對(duì)IL-1β的分泌 根據(jù)人的EIF2AK2基因序列，按照siRNA 的設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)兩對(duì)siRNA(正義引物: 5′-CAGGTTTCTTCATGGAGGAACTTAA-3′; 反義引物: 5′- GGACCTCCACATGATAGGAGGTTTA- 3′)，并交由美國(guó)Invitrogen公司合成。按1×106個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入500 μl培養(yǎng)基。將20 mol/L的siRNA 用Invitrogen細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀Neon Transfection System(MPK5000)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞并提取RNA進(jìn)行半定量PCR檢測(cè)EIF2AK2表達(dá)水平。同時(shí)將5×104個(gè)細(xì)胞/孔將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，分別用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L的ATP刺激6 h和3 h后，收集細(xì)胞上清液，通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞分泌IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1 HEK-293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EIF2AK2誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β Western blot結(jié)果顯示EIF2AK2能在HEK-293細(xì)胞中過(guò)表達(dá)(圖1A)。將10 ng ASC、20 ng NLRP3、5 ng Caspase-1和100 ng pro-IL-1β共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24 h后，ELISA結(jié)果顯示炎癥體復(fù)合物能誘導(dǎo)IL-1β分泌(圖1B)。為了研究EIF2AK2是否影響NLRP3炎癥體激活和IL-1β的分泌，將 EIF2AK2、 ASC、NLRP3、 Caspase-1和pro-IL-1β共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，結(jié)果顯示EIF2AK2能顯著誘導(dǎo)細(xì)胞分泌IL-1β(圖1B)。

2.2 EIF2AK2促進(jìn)IL-1β分泌具有濃度依賴(lài)性 將0～100 ng 的EIF2AK2和NLRP3炎癥體復(fù)合物共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示EIF2AK2表達(dá)水平隨著轉(zhuǎn)染pcDNA3-HA-EIF2AK2重組體的量增加而增加(圖2A)。 ELISA檢測(cè)顯示25～100 ng的EIF2AK2能促進(jìn)細(xì)胞分泌IL-1β，并且細(xì)胞分泌IL-1β水平隨著EIF2AK2濃度的增加而增加(圖2B)。

2.3 EIF2AK2和NLRP3蛋白相互作用 將Flag標(biāo)簽的NLRP3蛋白和HA標(biāo)簽的EIF2AK2蛋白共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，通過(guò)免疫共沉淀顯示EIF2AK2蛋白能和NLRP3蛋白發(fā)生相互作用(圖3)。而對(duì)照IgG并未檢測(cè)到條帶，說(shuō)明EIF2AK2和NLRP3發(fā)生特異的相互作用。

圖1 HEK-293細(xì)胞過(guò)表達(dá)EIF2AK2對(duì)IL-1β分泌影響

A：Western blot法檢測(cè)EIF2AK2表達(dá)水平；B：ELISA法檢測(cè)IL-1β分泌水平；1：空載體；2：pcDNA3-HA-EIF2AK2

圖2 HEK-293細(xì)胞中EIF2AK2蛋白表達(dá)水平對(duì)IL-1β分泌的影響

A：Western blot法檢測(cè)EIF2AK2表達(dá)水平；B: ELISA法檢測(cè)IL-1β分泌水平；1～4：細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染0、25、50、100 ng pcDNA3-HA-EIF2AK2載體

圖3 HEK-293細(xì)胞中EIF2AK2和NLRP3免疫共沉淀結(jié)果

2.4 siRNA干擾EIF2AK2表達(dá)后抑制IL-1β的分泌 在人單核THP-1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染EIF2AK2(#1和#2)和對(duì)照siRNA，轉(zhuǎn)染48 h后RT-PCR結(jié)果顯示EIF2AK2基因表達(dá)水平被顯著抑制(圖4A)。將這些細(xì)胞分別用0.5 mg/ml MSU和5 mol/L 的ATP刺激6 h和3 h后， EIF2AK2干擾的THP-1細(xì)胞比對(duì)照細(xì)胞分泌的IL-1β明顯減少(圖4)。

圖4 THP-1細(xì)胞中siRNA干擾EIF2AK2后RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平(A)及ELISA法檢測(cè)IL-1β分泌水平(B)

1：對(duì)照siRNA；2：siRNA EIF2AK2#1；3：siRNA EIF2AK2#2

3 討論

NLRP3炎癥體激活是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到一系列事件。不同的微生物和代謝產(chǎn)物激活NLRP3炎癥體的機(jī)制也不同[4]。如尿酸鈉晶體和二氧化硅通過(guò)鈣離子外流激活NLRP3炎癥體[9-10]， 胰島淀粉樣多肽則通過(guò)活性氧激活NLRP3炎癥體[11]，而β淀粉樣蛋白則通過(guò)溶酶體破裂激活炎癥體[12]。目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)NLRP3能直接識(shí)別這些配體而激活炎癥體。推測(cè)可能通過(guò)不同上游信號(hào)激活NLRP3炎癥體，因此研究調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體激活的蛋白具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)兩類(lèi)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體的蛋白。一類(lèi)包括熱蛋白、POP 和病毒熱蛋白(vPYDs)等具有PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白；另一類(lèi)為包括 Iceberg、COP1、INCA和 Caspase-12 等含有CARD結(jié)構(gòu)域的蛋白。本研究中顯示的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白雖然不含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，但已有的研究[13]顯示EIF2AK2是一個(gè)病原識(shí)別受體，該蛋白的N末端能和雙鏈RNA病毒相結(jié)合后激活C末端催化區(qū)域。同時(shí)亦顯示該蛋白N末端還能識(shí)別許多非病毒類(lèi)刺激，如脂肪酸、細(xì)胞外ATP和二氧化硅晶體等[13]。本研究顯示在THP-1細(xì)胞中，抑制EIF2AK2表達(dá)后能促進(jìn)ATP誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞中IL-1β分泌，推測(cè)ATP可能通過(guò)激活EIF2AK2從而影響炎癥激活，最終影響細(xì)胞分泌IL-1β。具體的機(jī)制將在以后的研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

NLRP3炎癥體由NLRP3蛋白、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白 Caspase-1 組成復(fù)合體。本研究顯示EIF2AK2蛋白能和炎癥體的NLRP3蛋白相互作用，然而并不清楚該蛋白是否和炎癥體中其它蛋白如ASC等相互作用，今后的研究方向?qū)?huì)進(jìn)一步研究該蛋白調(diào)節(jié)炎癥體激活的具體機(jī)制。NLRP3 炎癥體和一系列的代謝疾病有關(guān)，雖然對(duì)NLRP3炎癥體激活有了較多的認(rèn)識(shí)，但針對(duì)NLRP3炎癥體仍有許多問(wèn)題需要研究解決，其中重要的問(wèn)題之一就是炎癥體如何被精確的調(diào)控，本研究顯示EIF2AK2蛋白能調(diào)節(jié)NLRP3炎癥體將為炎癥體相關(guān)的疾病預(yù)防提供新的思路。

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Investigation of EIF2AK2 interaction with NLRP3 and effect on the release of IL-1β

Ju Xiaoli1,Wang Qiang2

(1SchoolofMedicine,2InstituteofLifeSciences,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofEIF2AK2ontheactivationofNLRP3inflammasomeandthereleaseofIL-1β.MethodsNLRP3inflammasomewasre-constructedinHEK-293cellstoexaminethereleaseofIL-1βbyoverexpressionofEIF2AK2.Theco-immunoprecipitationwasperformedtoinvestigatetheinteractionbetweenEIF2AK2andNLRP3.FinallysiRNAofEIF2AK2inTHP-1cellswasperformedtoexaminethereleaseofIL-1β.ResultsOverexpressionofEIF2AK2inHEK-293cellsactivatedNLRP3inflammasomeandincreasedIL-1βrelease.IL-1βreleaseincreasedgreatlywhenexpressionlevelofEIF2AK2increased.Theco-immunoprecipitationresultsdemonstratedthatEIF2AK2interactedwithNLRP3inHEK-293cells.IL-1βreleasewasreducedwhenEIF2AK2expressionwasinhibitedbysiRNAinTHP-1cells.ConclusionTheseresultssuggestthatEIF2AK2regulatestheactivationofNLRP3inflammasomeandthenaffectsIL-1βrelease.

NLRP3inflammasome;EIF2AK2;IL-1βrelease;proteininteraction

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：81502621、81502088)，江蘇省自然科學(xué)基金(編號(hào)：BK20140539)，江蘇大學(xué)高級(jí)人才啟動(dòng)基金項(xiàng)目((編號(hào)：14JDG065、15JDG021)，中國(guó)博士后科學(xué)基金(編號(hào)：2015M571677)

江蘇大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理教研室、2生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江 212013

鞠小麗，女，講師； 王 強(qiáng)，男，助理研究員，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，wanqqiang@ujs.edu.cn

時(shí)間：2016-10-12 13:23:00

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20161012.1323.003.html

R 392.11

A

1000-1492(2016)11-1565-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.11.003

2016-06-12接收