木聚糖酶的研究進(jìn)展

陳洪洋，蔡俊，林建國(guó)，王常高，杜馨

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

木聚糖酶的研究進(jìn)展

陳洪洋，蔡俊*，林建國(guó)，王常高，杜馨

（湖北工業(yè)大學(xué)發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢430068）

木聚糖是僅次于纖維素的第二豐富的可再生資源，通過篩選出產(chǎn)木聚糖酶的菌株，利用基因工程技術(shù)，將木聚糖酶基因進(jìn)行異源表達(dá)，提高木聚糖酶產(chǎn)量。該文綜述了菌株產(chǎn)生的木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改善使木聚糖酶更符合應(yīng)用的條件，同時(shí)研究木聚糖酶分離純化的步驟，來提高木聚糖酶的酶活。文章重點(diǎn)介紹了木聚糖酶的產(chǎn)生菌和木聚糖酶在基因工程技術(shù)等方面研究進(jìn)展，并對(duì)木聚糖酶的分離純化方法做了簡(jiǎn)要地介紹。

木聚糖酶；基因工程；酶學(xué)性質(zhì)；分離純化

木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分，廣泛存在于玉米芯、甘蔗渣、麥麩、秸稈等農(nóng)作物廢棄物中，由于木聚糖酶能夠?qū)⒛揪厶欠纸獬刹煌L(zhǎng)度的低聚木糖和木糖，該產(chǎn)物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，通過木聚糖酶將這些可利用資源充分利用，發(fā)揮其潛在的應(yīng)用價(jià)值，木聚糖酶的研究也受到充分的重視?，F(xiàn)在木聚糖酶已廣泛應(yīng)用于造紙、食品、飼料和能源等領(lǐng)域，帶來了很大的經(jīng)濟(jì)效益。目前木聚糖酶的生產(chǎn)主要來源于微生物發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵得到的木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以便了解該酶的應(yīng)用范圍，使木聚糖酶在工業(yè)應(yīng)用中發(fā)揮其巨大的潛能，增加更多的經(jīng)濟(jì)效益，為各領(lǐng)域的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。本文主要從微生物產(chǎn)木聚糖酶的種類和木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，以及基因工程在木聚糖酶生產(chǎn)中的應(yīng)用做了綜述，對(duì)木聚糖酶的分離純化進(jìn)行了簡(jiǎn)要的介紹，旨在提高木聚糖酶的活力及擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。

1 木聚糖酶簡(jiǎn)介

木聚糖（xylan）是一種存在于植物細(xì)胞壁中的異質(zhì)多糖，約占植物細(xì)胞干質(zhì)量的15%～35%，是植物半纖維素（hemicellose）的主要成分，其含量非常豐富，是自然界中僅次于纖維素的多糖[1]。主要有O-乙酰基、4-O-甲基-D-葡糖醛酸殘基、L-阿拉伯糖殘基等[2]。

由于木聚糖組成的復(fù)雜性，木聚糖的生物降解也因此需要一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，通過其中各種組分的相互協(xié)同作用來降解木聚糖，因此木聚糖酶（xylanase，Xyl）是個(gè)復(fù)雜的酶系，主要包括β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶[3]，可降解自然界中大量存在的木聚糖類半纖維素，在木聚糖水解酶系中，β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶是最關(guān)鍵的水解酶，它通過水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷鍵，將木聚糖水解為小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。β-木糖苷酶通過水解低聚木糖的末端來催化釋放木糖殘基。另外，參與徹底降解木聚糖的還有α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖側(cè)鏈殘基與酚酸（如阿魏酸或香豆酸）形成的酯鍵的酚酸酯酶等側(cè)鏈水解酶，它們作用于木糖與側(cè)鏈取代基之問的糖苷鍵，協(xié)同主鏈水解酶的作用，最終將木聚糖轉(zhuǎn)化為它的組成單糖，各木聚糖酶的作用位點(diǎn)如表1所示[4]。

表1 木聚糖酶系組成及作用位點(diǎn)Table 1 Composition and action site of xylanase system

2 木聚糖酶的微生物來源及酶學(xué)性質(zhì)

產(chǎn)木聚糖酶的微生物來源非常廣泛，而且種類眾多，用來生產(chǎn)木聚糖酶的微生物主要分為真菌和細(xì)菌（見表1）。真菌產(chǎn)木聚糖酶主要有曲霉菌（Aspergillus）、青霉菌（Penicillium）、木霉菌（Trichoderma）、酵母菌（Saccharomyces）等，細(xì)菌產(chǎn)木聚糖酶主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）、大腸桿菌（Escherichia coli）等。酵母和大腸桿菌則常用作基因克隆的表達(dá)菌株。

在真菌產(chǎn)木聚糖酶方面，HE H等[5]采用米曲霉（Aspergillus oryzae）HML366利用甘蔗渣生產(chǎn)木聚糖酶XynH1，由于該酶有較好的熱穩(wěn)定性和pH耐受性，在造紙和生物能源領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。ANG S K等[6]發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌SK1直接利用未經(jīng)處理的油棕的樹干，通過固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶和木聚糖酶，其中木聚糖酶活最高為418.70 U/g，通過這些酶的協(xié)同作用可以水解木質(zhì)纖維素原料。DORRA S等[7]利用絲狀真菌青霉occitanis Pol6產(chǎn)胞外的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶，該酶在酸性條件下的穩(wěn)定性，可以用在飼料和食品領(lǐng)域。ZHANGH等[8]發(fā)現(xiàn)黃青霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶和β-甘露聚糖酶，使用粗酶液水解氨水溶液預(yù)處理過的玉米芯得到木糖最高產(chǎn)量為236.63 mg/g，還原糖的含量為553.94 mg/g，可以用該酶處理玉米芯得到木糖和還原糖，使玉米芯這樣的農(nóng)作物殘?jiān)浞掷谩?/p>

表2 微生物來源的木聚糖酶及其酶學(xué)性質(zhì)Table 2 Xylanase from microorganism and its enzyme properties

除了上述的真菌產(chǎn)木聚糖酶，還有細(xì)菌中的鏈霉菌和芽孢桿菌等也能產(chǎn)木聚糖酶。LUO L等[9]發(fā)現(xiàn)異硫鏈霉菌（Streptomyces althioticus）LMZM利用玉米芯采用液體深層發(fā)酵，該內(nèi)切木聚糖酶，在pH 6.0～11.0和40～80℃范圍內(nèi)仍具有活性，在紙漿漂白過程中添加該酶后，提高了紙張亮度。MANDER P等[10]發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬CS624使用農(nóng)業(yè)殘?jiān)滬熥鳛榕囵B(yǎng)基底物，得到木聚糖酶EX624，該酶能將含有木質(zhì)纖維素的農(nóng)作物殘?jiān)獬傻途勰咎?。DEESUKONW等[11]發(fā)現(xiàn)從爛稻草中篩選得到的鏈霉菌屬SWU10，產(chǎn)生兩種形式的內(nèi)切木聚糖酶XynSW2A和XynSW2B，由于這兩種酶的pH和熱穩(wěn)定性，可以利用稻桿生產(chǎn)生物能源，可以在食品、紡織、廢水處理有廣泛的應(yīng)用。BAJAJ B K等[12]利用短小芽孢桿菌SS1以麥麩為唯一碳源，得到的木聚糖酶純化后的比酶活為12.7 U/mg，該酶能利用麥麩作為底物產(chǎn)生相當(dāng)大的木聚糖酶效價(jià)，表明麥麩可以使用作為一個(gè)廉價(jià)的底物生產(chǎn)木聚糖酶。GAUR R等[13]利用花域芽孢桿菌RSPP-15產(chǎn)生一種耐熱的木聚糖酶，由于該酶的耐熱性和耐堿穩(wěn)定性，可以用在紙漿漂白、皮革制造、清潔劑等領(lǐng)域。WALIAA等[14]通過纖維化纖維微細(xì)菌產(chǎn)生內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶，在50～60℃和pH 5～9范圍內(nèi)能保持穩(wěn)定，在制漿造紙領(lǐng)域有很廣泛的應(yīng)用。

通過這些微生物產(chǎn)木聚糖酶的研究，菌株利用的底物偏向廉價(jià)的、易獲得的原料來生產(chǎn)木聚糖酶，節(jié)省了生產(chǎn)成本，通過木聚糖酶水解農(nóng)作物殘?jiān)鼇砩a(chǎn)木糖或低聚木糖等，解決了資源浪費(fèi)和農(nóng)作物殘?jiān)斐傻沫h(huán)境污染等問題，同時(shí)使資源充分利用。對(duì)于木聚糖酶活較高的菌株可以進(jìn)一步的通過放大實(shí)驗(yàn)，用玉米芯、麥麩等原料來得到較理想的酶活和酶產(chǎn)量，為工業(yè)化大量生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。而那些能產(chǎn)生多種酶的菌株，則可以通過融合蛋白的方法，來提高酶催化木質(zhì)纖維素的效率。

3 木聚糖酶基因克隆及酶活力

隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，將木聚糖酶基因克隆到大腸桿菌、酵母和其他菌株中進(jìn)行高效表達(dá)也是研究的熱點(diǎn)，木聚糖酶基因工程表達(dá)菌株和載體的選擇情況見表3。

表3 木聚糖酶基因工程表達(dá)菌株和載體的選擇Table 3 Xylanase gene engineering strains and choice of carrier

ELGHARBI F等[15]將黑曲霉US368的內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶基因克隆到畢赤酵母（Pichia pastoris）SMD1168H中在組成型的GAP啟動(dòng)子下表達(dá)，得到木聚糖酶比原始菌株的酶活提高了3倍多。在面包制作過程中添加該酶后，降低了面團(tuán)的吸水性，增加了生面團(tuán)的延展性和體積。VERMA D等[16]將嗜熱地芽孢桿菌的的木聚糖酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）中表達(dá)，得到木聚糖酶的效價(jià)比野生型菌株高出了27倍。THOMAS L等[17]通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析，得到木聚糖酶的最高產(chǎn)量為200 IU/mL，酶活也有很大程度的提高。MIYAUCHI S等[18]將嗜熱網(wǎng)球菌的木聚糖酶基因xynB克隆到里氏木霉RUT-C30，在egl2和cbh2糖基水解酶基因啟動(dòng)子下進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果分析木聚糖酶有不同程度的N-聚糖和O-聚糖修飾。木聚糖酶基因在大腸桿菌和畢赤酵母中表達(dá)后，酶活都有明顯的提高，但是當(dāng)木聚糖酶在進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)，會(huì)遇到木聚糖酶的表達(dá)后修飾等問題。

為了讓木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)更加符合我們的期望，滿足應(yīng)用需求，在改善木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)方面，SOOZANIPOUR A等[19]將木聚糖酶共價(jià)連接在功能性的磁性納米顆粒表面，酶活力、可重復(fù)利用性、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、儲(chǔ)存穩(wěn)定性都優(yōu)于原始的木聚糖酶。RAKOTOARIVONINAH等[20]從玉米秸稈中分離出的木聚糖酶（Tx-Xyn11），將該酶表面的疏水殘基突變成非疏水性的，該酶的熱穩(wěn)定性和非特異性吸附率都大大的降低了，從側(cè)面說明木聚糖酶表面的疏水殘基和酶的熱穩(wěn)定性是密切相關(guān)的，為改善木聚糖的酶學(xué)性質(zhì)提供了另一條途徑。LI F等[21]對(duì)來自黑曲霉的木聚糖基因進(jìn)行定點(diǎn)突變向堿性pH方向改造，與初始酶相比有0.5 pH單位的改變。HE L等[22]研究高溫高壓條件下的嗜熱網(wǎng)球菌木聚糖酶二硫鍵突變后的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)該酶在500 MPa、80℃相當(dāng)穩(wěn)定。陳亞文等[23]在黑曲霉XZ-3S木聚糖酶的N-端區(qū)域引入半胱氨酸，定點(diǎn)突變后在大腸桿菌中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)突變酶的最適溫度比原始提高了5℃，在40℃和45℃時(shí)的半衰期都有延長(zhǎng)了。RIBEIRO L F等[24]發(fā)現(xiàn)將木聚糖酶插入到木糖結(jié)合蛋白中，在有木糖存在時(shí)，酶活性提高了20%，原始的酶活性則被抑制了。李同彪等[25]通過在黑曲霉木聚糖酶XynZF-2α-螺旋催化活性中心位點(diǎn)處引入疏水性氨基酸，該酶的熱穩(wěn)定性得到大大提高。所以對(duì)木聚糖酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變和固定化等方法，來改善木聚糖酶學(xué)性質(zhì)，使木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)滿足應(yīng)用需求。

通過上述研究報(bào)道，可以通過酶的固定化、定點(diǎn)突變引入疏水性殘基、二硫鍵和中性氨基酸等方法，來改善木聚糖酶的性質(zhì)是有效的和可行性的，不同程度的改善了酶學(xué)性質(zhì)，為以后的研究提供了理論依據(jù)和方法。而且將木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到益生菌細(xì)胞中，作為食品和飼料添加劑，也會(huì)有較大的利用潛能。

4 木聚糖酶分離純化方法及酶學(xué)性質(zhì)

通過菌株發(fā)酵得到木聚糖酶后，由于木聚糖降解酶系比較復(fù)雜，有的菌株還同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶等其他酶，這些酶的性質(zhì)相近，給木聚糖酶的分離純化帶來較多的困難。隨著分離技術(shù)的發(fā)展，木聚糖酶的分離純化方法由非特異性方法發(fā)展為特異性。非特異性分離純化方法包括硫酸銨分級(jí)沉淀，脫鹽后經(jīng)過離子交換、凝膠過濾層析和疏水層析等的方法，有的還要經(jīng)過超濾濃縮等步驟。特異性分離純化方法，主要是根據(jù)木聚糖酶與底物的特異性結(jié)合而發(fā)展的親和層析方法（見表4）。

表4 木聚糖酶分離純化方法及其酶學(xué)性質(zhì)Table 4 Methods of xylanase separation and purification and its enzyme properties

續(xù)表

硫酸銨分級(jí)沉淀常用做分離純化木聚糖酶第一步，但是高濃度的硫酸銨對(duì)木聚糖酶活力的測(cè)定存在干擾，測(cè)定酶活時(shí)可以通過透析或稀釋的方法來降低鹽的濃度，排除干擾。經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉淀后得到的木聚糖酶沉淀，有的先要經(jīng)過緩沖液溶解、透析、脫鹽，然后進(jìn)行凝膠過濾層析和離子交換層析。當(dāng)使用凝膠過濾分離純化木聚糖酶時(shí)，要考慮酶與凝膠介質(zhì)（瓊脂糖或葡聚糖）的相互作用，木聚糖酶結(jié)構(gòu)中可能含有纖維素結(jié)合區(qū)，而葡聚糖是由α-葡聚糖殘基構(gòu)成的，兩者可以相互結(jié)合，使凝膠過濾后的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測(cè)定分子質(zhì)量可能出現(xiàn)異常[26]。超濾在生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮時(shí)，能較好地保持生物大分子活性的優(yōu)點(diǎn)，但是KOCABAS D S等[27]在分離純化嗜熱色串孢（Scytalidium thermophilum）ATCC No.16454產(chǎn)生的木聚糖酶時(shí)采用超濾濃縮，但是發(fā)現(xiàn)纖維素超濾膜有部分的降解，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)粗酶液中含有較低的纖維素酶活為0.42 IU/mL，使超濾濃縮在木聚糖酶的分離純化中的使用受到影響。雙水相萃取體系條件溫和、沒有有機(jī)溶劑的殘留問題、可按比例放大和連續(xù)操作等優(yōu)點(diǎn)，KOCABAS D S等[27]分離純化嗜熱色串孢ATCC No.16454產(chǎn)生的木聚糖酶時(shí)，采用的是TX-114/水體系。FU G等[28]在分離純化黑曲霉XZ-3S的木聚糖酶基因在大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)的木聚糖酶，采用的就是Ni2+-螯合劑親和層析，經(jīng)過該步驟的純化后的酶液在SDS-PAGE顯示的是單一的條帶，說明木聚糖酶已高度純化，經(jīng)過親和層析后即達(dá)到了精制純化的目的，說明該方法具有高效性。木聚糖酶除了采用上述常用的分離純化方法外，還有電洗脫、三相萃取、反微團(tuán)萃取和置換層析[29]等不常用的分離純化方法。

由于木聚糖酶是一個(gè)復(fù)雜的酶系組成的，而且菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶不是單一的，所以在分離純化過程中，會(huì)將一些可能有協(xié)同作用的酶去除掉，反而使酶的回收率和酶活降低。KOKCHANG L等[30]在分離純化青霉rolfsii c3-2（1）IBRL產(chǎn)生的木聚糖酶時(shí)，采用了四步分離純化方法（硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換層析、凝膠過濾、疏水層析）經(jīng)過陰離子交換層析時(shí)顯示的有多個(gè)活性的峰，但是經(jīng)過凝膠過濾層析只出現(xiàn)單一的木聚糖酶活性峰，可能使與木聚糖酶有協(xié)同作用的酶被去除掉，使酶的回收率降低了[31]，這對(duì)完全水解木聚糖是不利的。在分離純化木聚糖酶時(shí)，純化步驟最好不要超過三步，而且要盡可能選擇合適的分離純化方法，使木聚糖酶的回收率和酶活保持較高的水平。

5 展望

由于現(xiàn)在生產(chǎn)的木聚糖酶多來自于菌株發(fā)酵，所得的木聚糖酶力較低，酶活性范圍窄，限制了木聚糖酶的廣泛應(yīng)用?？梢酝ㄟ^篩選高產(chǎn)木聚糖酶菌株和優(yōu)化培養(yǎng)基提高木聚糖酶的生產(chǎn)水平，在此基礎(chǔ)上選擇成本較低的原料，減少生產(chǎn)成本。也可以通過基因工程技術(shù)提高木聚糖酶的表達(dá)水平，結(jié)合定點(diǎn)突變技術(shù)改善木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)，使木聚糖酶更適合不同領(lǐng)域的應(yīng)用要求。除此之外，研究分離純化對(duì)木聚糖酶的活性和回收率的影響，選擇合適的分離純化方法，對(duì)提高木聚糖酶活有很大幫助。

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Research progress of xylanase

CHEN Hongyang,CAI Jun*,LIN Jianguo,WANG Changgao,DU Xin
(Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation,Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Abstarct:Xylan is the second most abundant renewable resources after cellulose.By screening of xylanase-producing strains,using the genetic engineering technology and the heterologous expression of xylanase gene,the production of xylanase was improved.The enzymatic properties of xylanase produced by the strain were researched and improved to make xylanase more suitable for application conditions.In the meantime,the steps of separation and purification of xylanase were researched to increase the xylanase activity.The xylanase-producing bacteria and the research progress of xylanase in genetic engineering technology were introduced emphatically,and the separation and purification of xylanase were introduced briefly.

xylanase;genetic engineering;enzymatic property;separation and purification

Q814.9

0254-5071（2016）11-0001-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.11.001

2016-05-18

國(guó)家自然科學(xué)基金（31401807）

陳洪洋（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：蔡俊（1968-），男，博士，教授，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。