阿司匹林抑制血小板源性生長因子BB引起的主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移研究

朱晉坤，毛 華，尹揚光，董 文，杜 峰，黎姍姍，鄧夢揚

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·論著·

阿司匹林抑制血小板源性生長因子BB引起的主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移研究

朱晉坤，毛 華，尹揚光，董 文，杜 峰，黎姍姍，鄧夢揚

目的 探討阿司匹林對由血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)引起的主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響及其機制。方法 2014年8月—2015年9月，選取人主動脈血管平滑肌細胞株(T/G HA-VSMC)，分為對照組(不添加任何試劑)、PDGF-BB組(添加10 ng/ml PDGF-BB)、阿司匹林組(添加5 mmol/L阿司匹林)、PDGF-BB+阿司匹林組(添加10 ng/ml PDGF-BB和5 mmol/L阿司匹林)，采用CCK-8法檢測4組不同培養(yǎng)時間(0、24、48、72 h)T/G HA-VSMC增殖吸光度(OD值)，Western blotting法檢測p21waf1、p27kip1相對表達量，流式細胞儀檢測細胞周期，細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率，Western blotting法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)相對表達量。結(jié)果 培養(yǎng)0 h時，4組T/G HA-VSMC增殖OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)24、48、72 h時，PDGF-BB組T/G HA-VSMC增殖OD值較對照組升高，阿司匹林組T/G HA-VSMC增殖OD值較對照組降低(P<0.05)；培養(yǎng)48、72 h時，PDGF-BB+阿司匹林組T/G HA-VSMC增殖OD值較對照組降低(P<0.05)；培養(yǎng)24、48、72 h時，阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組T/G HA-VSMC增殖OD值較PDGF-BB組降低(P<0.05)；培養(yǎng)24、48、72 h時，PDGF-BB+阿司匹林組T/G HA-VSMC增殖OD值較阿司匹林組升高(P<0.05)。PDGF-BB組培養(yǎng)24、48 h時p21waf1、p27kip1相對表達量較培養(yǎng)0 h時升高(P<0.05)；培養(yǎng)72 h時p21waf1、p27kip1相對表達量較培養(yǎng)0、24、48 h時降低(P<0.05)。培養(yǎng)24 h時，PDGF-BB組p21waf1、p27kip1相對表達量較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低(P<0.05)。PDGF-BB組G0/G1期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低，S期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組升高(P<0.05)。細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，PDGF-BB組細胞遷移率較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低(P<0.05)。PDGF-BB組MMP-1相對表達量較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組升高(P<0.05)；阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組MMP-1相對表達量較對照組降低(P<0.05)。結(jié)論 阿司匹林通過上調(diào)p21waf1、p27kip1，下調(diào)MMP-1而抑制由PDGF-BB引起的主動脈血管平滑肌細胞的增殖和遷移。

阿司匹林；血小板源性生長因子；主動脈；肌細胞，平滑??；細胞增殖；細胞運動

朱晉坤，毛華，尹揚光，等.阿司匹林抑制血小板源性生長因子BB引起的主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(36)：4467-4473.[www.chinagp.net]

ZHU J K,MAO H,YIN Y G，et al.Aspirin inhibition of PDGF-BB-induced proliferation and migration of vascular smooth muscle cells[J].Chinese General Practice，2016，19(36)：4467-4473.

血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)最初在血清和血小板中被發(fā)現(xiàn)，能在體外誘導(dǎo)血管平滑肌細胞(VSMC)和成纖維細胞的分裂，因此被認為是一種分裂素[1-2]。PDGF有5種二聚體形式，分別為：PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD和PDGF-AB，其中PDGF-BB在促進細胞增殖、遷移以及血管外周細胞重建中起重要作用[3]。血管受到損傷后，血小板細胞被激活釋放PDGF-BB，進而加速血管內(nèi)皮細胞和VSMC增殖、遷移，達到加速血管重塑的目的。另一方面，有研究指出，PDGF-BB能加速VSMC增殖和遷移[4]，而VSMC過度增殖是血管再狹窄的主要原因[5]。血管再狹窄是影響心血管手術(shù)效果及預(yù)后的重要因素，這就意味著抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC過度增殖是提高心腦血管手術(shù)療效的重要保證。阿司匹林能抑制損傷血管釋放的細胞因子對血小板的激活作用[6]，因此阿司匹林是防止血栓形成、預(yù)防經(jīng)皮冠狀動脈介入術(shù)(PCI)和經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)后靶血管再狹窄的常用藥物。有研究證實，阿司匹林能抑制VSMC增殖及遷移[7-8]。本研究旨在利用外源性PDGF-BB研究PDGF-BB對體外人主動脈血管平滑肌細胞(T/G HA-VSMC)增殖和遷移的影響，同時觀察PCI后常用藥物阿司匹林對PDGF-BB引起的VSMC增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 抗體與試劑 細胞周期蛋白抑制因子p21waf1(3733-1,1∶1 000)、p27kip1(1591-1,1∶1 000)抗體購自Epitomics 公司；基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinases，MMP-1)(BM 1270，1∶500)抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；羊抗兔二抗-辣根過氧化物酶(HRP)由Epitomics公司贈送；八肽膽囊收縮素(CCK-8)購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所；細胞周期檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；人重組PDGF-BB(CYT-501)購自ProSpec公司；阿司匹林購自德國拜耳股份有限公司(藥品批號BJ16177)。

1.2 細胞培養(yǎng) 2014年8月—2015年9月，T/G HA-VSMC購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，由本院實驗室凍存。將T/G HA-VSMC接種于50 ml細胞培養(yǎng)瓶中，置于含10%胎牛血清(life technology，美國)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素(hyclone，美國)的RPMI 1640完全培養(yǎng)基(life technology，美國)中，于37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，飽和濕度，貼壁生長。

1.3 CCK-8法檢測T/G HA-VSMC增殖 將T/G HA-VSMC接種在96孔板中，4 000個/孔，每組4個復(fù)孔；在RPMI 1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)約24 h后分為4組，對照組、PDGF-BB組、阿司匹林組、PDGF-BB+阿司匹林組，對照組不添加任何試劑、PDGF-BB組添加10 ng/ml PDGF-BB、阿司匹林組添加5 mmol/L阿司匹林、PDGF-BB+阿司匹林組添加10 ng/ml PDGF-BB和5 mmol/L阿司匹林，培養(yǎng)24 h后，CCK-8和培養(yǎng)液1∶10混合溶液加入到各孔中，100 μl/孔，37 ℃溫育2～4 h，在酶標儀中490 nm處讀取吸光度(OD值)。磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，換成新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在48、72 h后重復(fù)以上實驗。

1.4 Western blotting法檢測p21waf1、p27kip1相對表達量 收集PDGF-BB組培養(yǎng)0、24、48、72 h時細胞，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒和分光光度計測定p21waf1、p27kip1相對表達量，并加入上樣緩沖液備用。將30 μg總蛋白于預(yù)先配制好的10%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中進行分離，每個樣本至少用2塊平行膠進行分離。通過“三明治”濕法轉(zhuǎn)印將已經(jīng)分離好的蛋白轉(zhuǎn)印于預(yù)先活化好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜(merck-millipore，美國)上。轉(zhuǎn)印完成后的PVDF膜用5%脫脂奶粉(Thermofisher，美國)封閉過夜。一抗(p21waf1、p27kip1抗體)室溫孵育2～4 h，PBST洗滌3×15 min，二抗-HRP室溫孵育1～2 h，PBST洗滌3×10 min后，顯色觀察，使用chemidoc XRS+影像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)采集蛋白條帶圖像，測定相對光密度進行蛋白表達分析，通過校準β-actin作為內(nèi)參進行內(nèi)部控制。實驗重復(fù)6次。PDGF-BB組培養(yǎng)24 h時p21waf1、p27kip1相對表達量明顯升高，采用Western blotting法檢測4組培養(yǎng)24 h時p21waf1、p27kip1相對表達量，方法同上，實驗重復(fù)6次。

1.5 流式細胞儀檢測細胞周期 將6×104個T/G HA-VSMC接種于6孔板，貼壁后分為對照組、PDGF-BB組、阿司匹林組、PDGF-BB+阿司匹林組，72 h后用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌2次，棄上清液；加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上。PBS洗滌去乙醇，0.5 ml PBS重懸細胞，加入碘化丙啶(PI)和核糖核酸酶A(RNaseA)至終濃度50 g/ml，37 ℃溫浴30 min。流式細胞儀測定細胞周期。實驗重復(fù)6次。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率 用標記筆在6孔板底部均勻劃上3～4條橫線，將適量T/G HA-VSMC〔(1～2)×105個/孔〕種植于6孔板內(nèi)，分為對照組、PDGF-BB組、阿司匹林組、PDGF-BB+阿司匹林組,貼壁轉(zhuǎn)染24 h或未轉(zhuǎn)染48 h后藍色無菌1 ml槍尖在6孔板內(nèi)劃線；PBS清洗，除去漂浮細胞后用低血清培養(yǎng)基，并加入1 nmol絲裂霉素C(sigma公司，美國)抑制細胞分裂。以橫線為參照物，顯微鏡下觀察照相，在橫線上下取景，作為0 h圖；24 h后觀察細胞遷移情況，細胞遷移使用Image Pro Plus軟件進行處理，細胞遷移率=邊緣距離(0 h)-邊緣距離(24 h)/邊緣距離(0 h)。實驗重復(fù)6次。

1.7 Western blotting法檢測MMP-1相對表達量 收集對照組、PDGF-BB組、阿司匹林組、PDGF-BB+阿司匹林組貼壁轉(zhuǎn)染24 h的細胞，采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒和分光光度計測定MMP-1相對表達量，并加入上樣緩沖液備用。將30 μg總蛋白于預(yù)先配制好的10%聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中進行分離，每個樣本至少用兩塊平行膠進行分離。通過“三明治”濕法轉(zhuǎn)印將已經(jīng)分離好的蛋白轉(zhuǎn)印于預(yù)先活化好的PVDF膜上。轉(zhuǎn)印完成后的PVDF膜用5%的脫脂奶粉封閉過夜。一抗(MMP-1抗體)室溫孵育2～4 h，PBST洗滌3×15 min，二抗-HRP室溫孵育1～2 h，PBST洗滌3×10 min后，顯色觀察，使用chemidoc XRS+影像系統(tǒng)采集蛋白條帶圖像，測定相對光密度進行蛋白表達分析，通過校準β-actin作為內(nèi)參進行內(nèi)部控制。實驗重復(fù)6次。

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測T/GHA-VSMC增殖 培養(yǎng)0h時，4組T/GHA-VSMC增殖OD值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。培養(yǎng)24、48、72h時，4組T/GHA-VSMC增殖OD值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中培養(yǎng)24、48、72h時，PDGF-BB組T/GHA-VSMC增殖OD值較對照組升高，阿司匹林組T/GHA-VSMC增殖OD值較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)48、72h時，PDGF-BB+阿司匹林組T/GHA-VSMC增殖OD值較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24、48、72h時，阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組T/GHA-VSMC增殖OD值較PDGF-BB組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)24、48、72h時，PDGF-BB+阿司匹林組T/GHA-VSMC增殖OD值較阿司匹林組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2Westernblotting法檢測PDGF-BB組不同培養(yǎng)時間p21waf1、p27kip1相對表達量PDGF-BB組培養(yǎng)0、24、48、72h時p21waf1、p27kip1相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，培養(yǎng)24、48h時p21waf1、p27kip1相對表達量較培養(yǎng)0h時升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；培養(yǎng)72h時p21waf1、p27kip1相對表達量較培養(yǎng)0、24、48h時降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖1)。

2.3Westernblotting法檢測4組培養(yǎng)24h時p21waf1、p27kip1相對表達量 培養(yǎng)24h時，4組p21waf1、p27kip1相對表達量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，PDGF-BB組p21waf1、p27kip1相對表達量較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖2)。

Table 1 Comparison of T/G HA-VSMC proliferation OD value among four groups in different culture time

組別0h24h48h72h對照組049±003052±002086±002121±004PDGF?BB組047±001059±001a092±002a141±002a阿司匹林組045±002048±003ab055±003ab081±003abPDGF?BB+阿司匹林組048±001052±002bc068±003abc096±003abcF值2621286231133513P值02640012<0001<0001

注：PDGF-BB=血小板源性生長因子BB；與對照組比較，aP<0.05；與PDGF-BB組比較，bP<0.05；與阿司匹林組比較，cP<0.05

Table 2 Comparison of the relative expression of p21waf1and p27kip1at different cultivation times of PDGF-BB group

培養(yǎng)時間p21waf1p27kip10h034±003042±00224h052±005a058±005a48h056±007a051±003a72h013±006abc014±004abcF值761643P值00080012

注：與培養(yǎng)0 h時比較，aP<0.05；與培養(yǎng)24 h時比較，bP<0.05；與培養(yǎng)48 h時比較，cP<0.05

Table3Comparisonofrelativeexpressionofp21waf1andp27kip1aftercultivated24hamongfourgroups

組別p21waf1p27kip1對照組091±003034±006PDGF?BB組043±005a013±007a阿司匹林組104±007b087±003bPDGF?BB+阿司匹林組096±003b058±004bF值14372137P值00340014

注：與對照組比較，aP<0.05；與PDGF-BB組比較，bP<0.05

圖1 Western blotting法檢測PDGF-BB組不同培養(yǎng)時間p21waf1、p27kip1相對表達量

Figure 1 The relative expression of p21waf1and p27kip1detected by the Western blotting in PDGF-BB group

注：PDGF-BB=血小板源性生長因子BB

圖2 Western blotting法檢測4組培養(yǎng)24 h時p21waf1、p27kip1相對表達量

Figure 2 The relative expression of p21waf1and p27kip1after cultivated 24 h detected by the Western blotting in the four groups

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 4組G2/M期細胞所占比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；4組G0/G1、S期細胞所占比例比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中PDGF-BB組G0/G1期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低，S期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖3)。

2.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移率 細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時，4組細胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，PDGF-BB組細胞遷移率較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表5、圖4)。

2.6 Western blotting法檢測MMP-1相對表達量 4組MMP-1相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其中，PDGF-BB組MMP-1相對表達量較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組MMP-1相對表達量較對照組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表6、圖5)。

表4 4組細胞周期比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與PDGF-BB組比較，bP<0.05

圖3 流式細胞儀檢測4組細胞周期

圖4 細胞劃痕實驗檢測4組細胞遷移

組別細胞遷移率對照組095±005PDGF?BB組017±007a阿司匹林組072±005bPDGF?BB+阿司匹林組076±004bF值1589P值0021

注：與對照組比較，aP<0.05；與PDGF-BB組比較，bP<0.05

Table6ComparisonoftherelativeexpressionofMMP-1amongthefourgroups

組別MMP?1相對表達量對照組043±005PDGF?BB組076±007a阿司匹林組009±003abPDGF?BB+阿司匹林組014±004abF值1045P值0001

注：MMP-1=基質(zhì)金屬蛋白酶1；與對照組比較，aP<0.05；與PDGF-BB組比較，bP<0.05

注：MMP-1=基質(zhì)金屬蛋白酶1

圖5 Western blotting法檢測4組MMP-1相對表達量

Figure 5 The relative expression of MMP-1 detected by Western blotting in the four groups

3 討論

本研究首先利用CCK-8法檢測PDGF-BB對T/G HA-VSMC增殖的影響，結(jié)果顯示，培養(yǎng)0 h時，4組T/G HA-VSMC增殖OD值間無明顯差異，培養(yǎng)24 h開始PDGF-BB組T/G HA-VSMC增殖OD值較對照組升高。利用Western blotting法檢測周期蛋白抑制因子發(fā)現(xiàn)，PDGF-BB組p21waf1、p27kip1相對表達量在整個處理過程中呈現(xiàn)兩個階段：第一個階段，培養(yǎng)24、48 h時，p21waf1、p27kip1相對表達量明顯升高，培養(yǎng)72 h時p21waf1、p27kip1相對表達量明顯降低。因此檢測4組培養(yǎng)24 h時p21waf1、p27kip1相對表達量，顯示PDGF-BB組p21waf1、p27kip1相對表達量較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低。隨后利用流式細胞儀檢測各組細胞周期變化，發(fā)現(xiàn)PDGF-BB組G0/G1期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組降低，S期細胞所占比例較對照組、阿司匹林組和PDGF-BB+阿司匹林組升高。

p27是KIP家族成員，主要通過抑制周期蛋白D、周期蛋白E、周期蛋白A激酶相關(guān)的復(fù)合物來調(diào)控細胞周期進程[9]。p21waf1的最初報道是腫瘤抑制基因p53的下游因子，主要抑制周期蛋白激酶(CDK)[9]。p21waf1直接綁定在周期蛋白以及CDK復(fù)合物上，在G1末期抑制細胞進程[9]。p27kip1的功能和p21waf1相似，p21waf1和p27kip1的降低可釋放二者綁定的細胞周期蛋白(cyclin)-E、cyclin-2復(fù)合物，釋放的復(fù)合物能高度磷酸化成視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Rb蛋白)，Rb蛋白啟動細胞G1期向S期轉(zhuǎn)化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[10]。許多研究證實，p21waf1和p27kip1在VSMC增殖和遷移中起著重要的作用[11-12]；在球囊損傷實驗動物模型中，p21waf1過表達能抑制VSMC的增殖，預(yù)防血管內(nèi)壁增生[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB處理72 h后的T/G HA-VSMC p21waf1和p27kip1相對表達量均有不同程度的降低；但短期的刺激(24～48 h)p21waf1和p27kip1相對表達量明顯上調(diào)。前人研究對p21waf1和p27kip1的變化有不同的認定，有研究認為PDGF-BB處理后的VSMC p27kip1下調(diào)，但是p21waf1上調(diào)[13]；同時也有研究認為PDGF-BB處理后的VSMC p21waf1和p27kip1均明顯下調(diào)[7]。但這兩項研究PDGF-BB刺激的時間不同，因此本研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB刺激的時間對p21waf1和p27kip1的表達有一定影響，長時間的刺激(>48 h)會上調(diào)p21waf1和p27kip1，但短時間的刺激能明顯下調(diào)p21waf1和p27kip1。在24 h前空白對照組和PDGF-BB組的增殖速度無明顯差異，24～72 h后PDGF-BB組的增殖速度明顯快于空白對照組。流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)PDGF-BB組的S期細胞所占比例較對照組增加而G0/G1期細胞所占比例較對照組降低。

高濃度水楊酸鹽(>1 mmol/L)和多聚膠原通過誘導(dǎo)p21waf1和p27kip1表達抑制VSMC的增殖[7]，同時，阿司匹林也能阻抑VSMC于G0/G1期而抑制細胞的增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)5 mmol/L的阿司匹林能明顯抑制由PDGF-BB引起的細胞增殖，阿司匹林能誘導(dǎo)p21waf1和p27kip1的表達，逆轉(zhuǎn)由PDGF-BB引起的p21waf1和p27kip1的下調(diào)。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)阿司匹林組G0/G1期細胞所占比例較對照組增加了0.13。

金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)是一組同源的Zn2+依賴的肽鏈內(nèi)切酶，目前為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18個不同的亞型。在細胞的遷移過程中細胞必須與相鄰的細胞和周圍的基質(zhì)細胞分離，而分離的整個過程中MMPs起著不可替代的作用[15]。MMPs可以降解膠原，層粘連蛋白、蛋白多糖等幫助遷移的細胞從周圍環(huán)境中分離出來。有研究指出PDGF-BB能通過上調(diào)MMPs促進VSMC的遷移[16-18]。其中MMP-1主要降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原，研究表明MMP-1在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中起了重要的作用[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)PDGF-BB能通過上調(diào)MMP-1促進T/G HA-VSMC的增殖和遷移。阿司匹林能明顯抑制MMP-1的表達，并拮抗由PDGF-BB誘導(dǎo)的T/G HA-VSMC的遷移。

PCI和PTCA后防止VSMC過度增殖，是手術(shù)成功的關(guān)鍵。前文提到，血管受損后血小板釋放的PDGF-BB能誘導(dǎo)T/G HA-VSMC的增殖和遷移[16-18]。本研究從體外角度觀察了PDGF-BB對T/G HA-VSMC的增殖和遷移的作用，并深入研究了PDGF-BB誘導(dǎo)T/G HA-VSMC增殖和遷移的機制。同時還發(fā)現(xiàn)了阿司匹林對PDGF -BB誘導(dǎo)的T/G HA-VSMC增殖和遷移的抑制作用。從研究結(jié)果來看，利用阿司匹林對周期蛋白抑制因子的上調(diào)，以及對MMP-1的表達抑制作用來治療VSMC過度增殖，防止血管內(nèi)壁增厚有著重要的意義。同理，本研究能對在已知機制的作用下開發(fā)新生藥物，更好地治療血管狹窄有一定的指導(dǎo)作用。

作者貢獻：朱晉坤、毛華進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責(zé)；朱晉坤、尹揚光、董文、杜峰、黎姍姍進行實驗實施、評估、資料收集；毛華、鄧夢揚進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Aspirin Inhibition of PDGF-BB-induced Proliferation and Migration of Vascular Smooth Muscle Cells

ZHU Jin-kun,MAO Hua,YIN Yang-guang,DONG Wen,DU Feng,LI Shan-shan,DENG Meng-yang.

Department of Cardiovascular Medicine，the First People′s Hospital of Guiyang，Guiyang 550002,China

ZHU Jin-kun，Department of Cardiovascular Medicine，the First People′s Hospital of Guiyang，Guiyang 550002,China；E-mail：zjk369@sohu.com

Objective To explore the influence and mechanism of aspirin on proliferation and migration of aortic vascular smooth muscle cells caused by platelet-derived growth factor BB(PDGF-BB). Methods From August 2014 to September 2015,aortic vascular smooth muscle cell strains (T/G HA-VSMC) were selected and divided into four groups:control group (no other reagent),PDGF-BB group (with 10 ng/ml PDGF-BB),aspirin group (with 5 mmol/L aspirin),and PDGF-BB+aspirin group (with 10 ng/ml PDGF-BB and 5 mmol/L aspirin). OD value of T/G HA-VSMC proliferation at different cultivation times (0,24,48,and 72 h) was tested by CCK-8 method,and relative expression quantity of p21waf1and p27kip1was tested by Western blotting. Cell cycles were tested by flow cytometry,and cell migration was tested by wound-healing assay. Relative expression quantity of matrix metalloproteinase 1 (MMP-1) in four groups was tested by Western blotting. Results When cultivated at 0 h,differences of OD value of T/G HA-VSMC proliferation in four groups showed no statistical significance (P>0.05). When cultivated at 24,48,and 72 h,OD value of T/G HA-VSMC proliferation in PDGF-BB group was higher than that in control group(P<0.05). In aspirin group,OD value of T/G HA-VSMC proliferation was lower than that in control group (P<0.05);when cultivated at 48 and 72 h,OD value of T/G HA-VSMC proliferation in PDGF-BB+aspirin group was lower than that in control group (P<0.05);when cultivated at 24,48,and 72 h,OD value of T/G HA-VSMC proliferation in aspirin group and PDGF-BB+aspirin group was lower than that in PDGF-BB group (P<0.05);when cultivated at 24,48,and 72 h,OD value of T/G HA-VSMC proliferation in PDGF-BB+aspirin group was higher than that in aspirin group (P<0.05). Relative expression quantities of p21waf1and p27kip1in PDGF-BB group at 24 and 48 h were higher than those at 0 h (P<0.05);when cultivated at 72 h,relative expression quantities of p21waf1and p27kip1were lower than those at 0,24,and 48 h (P<0.05). When cultivated at 24 h,relative expression quantities of p21waf1and p27kip1in PDGF-BB group were lower than those in other three groups (P<0.05). G0/G1ratio of PDGF-BB group was lower than that in control group,aspirin group,and PDGF-BB+aspirin group,while ratio of S period was higher than that in other three groups (P<0.05). Wound-healing assay showed that,when cultivated at 24 h,cell migration rate in PDGF-BB group was lower than that in other three groups (P<0.05). MMP-1relative expression quantity in PDGF-BB group was higher than that in other three groups (P<0.05);MMP-1relative expression quantitiy in aspirin group and PDGF-BB+aspirin group was lower than that in control group (P<0.05). Conclusion Aspirin inhibits proliferation and migration of aortic vascular smooth muscle cells caused by PDGF-BB via increasing p21waf1and p27kip1and reducing MMP-1 expression.

Aspirin；Platelet-derived growth factor；Aorta；Myocytes，smooth muscle；Cell proliferation；Cell movement

貴州省科技廳社會發(fā)展資助項目(黔科合SY[2010]3087號)

550002貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科(朱晉坤，毛華，董文，杜峰，黎姍姍)；第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科(尹揚光，鄧夢揚)

朱晉坤，550002貴州省貴陽市第一人民醫(yī)院心血管內(nèi)科；E-mail：zjk369@sohu.com

R 329.28

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2016.36.013

2016-06-06；

2016-10-05)