精神分裂癥錨蛋白重復(fù)序列3基因多態(tài)性及表達(dá)研究☆

冉柳毅　程宇琪　董成龍　姜紅燕　吳桂霞　楊舒然　許秀峰

·論 著·

精神分裂癥錨蛋白重復(fù)序列3基因多態(tài)性及表達(dá)研究☆

冉柳毅*程宇琪*董成龍*姜紅燕*吳桂霞△楊舒然*許秀峰*

目的 探討錨蛋白重復(fù)序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）基因多態(tài)性和基因表達(dá)與精神分裂癥的關(guān)系。方法 采用TaqMan探針等位基因分型技術(shù)對(duì)456例中國(guó)漢族精神分裂癥患者（患者組）和495名正常對(duì)照者（對(duì)照組）ANK3基因多態(tài)性位點(diǎn)rs10994336、rs10994359進(jìn)行基因分型，并對(duì)基因型、等位基因、單體型頻率進(jìn)行比較；然后采用TaqMan探針及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)另外30例急性期精神分裂癥患者和26名正常對(duì)照外周血ANK3基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 患者組與對(duì)照組rs10994336和rs10994359基因型、等位基因頻率分布的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。單體型分析顯示，由rs10994336-rs10994359組成單體型C-C、C-T、T-C的頻率分布在患者組與對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組相比，急性期精神分裂癥患者外周血ANK3基因的mRNA表達(dá)水平略高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 本研究未發(fā)現(xiàn)ANK3基因位點(diǎn)rs10994336、rs10994359多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)，急性期精神分裂癥患者外周血中ANK3基因的表達(dá)水平未見(jiàn)異常。

精神分裂癥 錨蛋白重復(fù)序列3基因 多態(tài)性 基因表達(dá)

目前認(rèn)為精神分裂癥是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致大腦發(fā)育異常[1]。遺傳因素在精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，該病具有很高的遺傳度，雙生子研究顯示其遺傳度約80%[2]。位于10q21的錨蛋白重復(fù)序列3（ankyrin repeat 3，ANK3）基因編碼的Ankyrin-G在大腦中廣泛表達(dá)且參與神經(jīng)發(fā)育過(guò)程[3]。2011年全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome wide association study，GWAS）發(fā)現(xiàn)ANK3基因多態(tài)性位點(diǎn)rs10994359與精神分裂癥和雙相情感障礙均具有關(guān)聯(lián)[4]，2012年中國(guó)上海YUAN等[5]發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs10994336與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)，但是北歐、德國(guó)的研究未能驗(yàn)證這一關(guān)聯(lián)[6-7]。ROUSSOS等[8]在尸檢研究中發(fā)現(xiàn)精神分裂癥患者大腦顳上回ANK3基因mRNA水平降低，WIRGENES等[9]在精神分裂癥患者外周血中發(fā)現(xiàn)ANK3基因mRNA水平增高。為進(jìn)一步明確ANK3基因與中國(guó)漢族精神分裂癥的關(guān)系，本研究在中國(guó)漢族樣本中分析ANK3基因的2個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）位點(diǎn)rs10994336和rs10994359，并對(duì)急性期精神分裂癥患者外周血ANK3基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

1.1.1基因多態(tài)性研究對(duì)象 患者組來(lái)自2013年3月至2014年11月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科、云南省精神衛(wèi)生中心精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，并由2名精神科副主任醫(yī)師或以上職稱醫(yī)師診斷；②漢族；③年齡＜65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他精神疾病或嚴(yán)重軀體疾病。共入組456例患者，男185例，女271例，年齡14～60歲，平均（34.2±11.1）歲。

對(duì)照組來(lái)自昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的健康體檢者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)前或既往無(wú)患精神障礙；②漢族；③年齡＜65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重軀體疾病。共入組495名對(duì)照，男206名，女289名，年齡20～60歲，平均（35.2±10.1）歲?；颊呓M和對(duì)照組年齡（t=-1.41，P=0.16）和性別（χ2=0.11，P= 0.74）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.1.2基因表達(dá)研究對(duì)象 患者組來(lái)自2015年1～4月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科門(mén)診和住院治療的急性期精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合DSM-Ⅳ精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，由2名精神科副主任醫(yī)師或以上職稱醫(yī)師診斷，PANSS評(píng)分＞60分；②漢族；③年齡＜65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他精神疾病或嚴(yán)重軀體疾病。共入組30例患者，其中5例mRNA擴(kuò)增失敗。25例患者納入分析，男10例，女15例，年齡15～44歲，平均（24.6±6.5）歲，病程0.5～15年，平均（3.8±3.9）年，PANSS評(píng)分62～101分，平均（78.3±9.5）分。

對(duì)照組來(lái)自同期昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的健康體檢者及實(shí)習(xí)生。入組標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)前或既往無(wú)精神障礙史；②漢族；③年齡＜65歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有嚴(yán)重軀體疾病。共入組26名對(duì)照，其中1名mRNA擴(kuò)增失敗。25名對(duì)照納入分析，男9名，女16名，年齡21～30歲，平均（25.7±2.2）歲。25例患者與25名對(duì)照者年齡（t=-0.79，P=0.44）和性別（χ2=0.09，P=0.77）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

研究對(duì)象中精神分裂癥患者及家屬均對(duì)本研究知情同意并簽署書(shū)面知情同意書(shū)，所有對(duì)照本人簽署知情同意書(shū)。本研究得到昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2基因多態(tài)性研究方法

1.2.1提取DNA 456例患者及495名對(duì)照各采集靜脈血2～5 mL置于乙二胺四乙酸管抗凝，采用AxyPrep血基因組DNA小量試劑盒（AxyPrepTMBlood Genomic DNA Miniprep Kit）提取基因組DNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因分型 采用TaqMan探針基因分型技術(shù)對(duì)rs10994336、rs10994359位點(diǎn)進(jìn)行分型，引物和探針由美國(guó)ABI公司定制（探針序列號(hào)分別為：C_ 31344821_10，C_31344870_10），PCR反應(yīng)試劑Taq?Man? Genotyping Master Mix由美國(guó)ABI公司提供。PCR反應(yīng)體系為7.5 μL，包括模板2 μL，2× TaqMan?Genotyping Master Mix 5.0 μL，20×SNP Assay Mix 0.5 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，（95℃變性15 s，60℃退火1 min）×40個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)和熒光信號(hào)收集均在ABI7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（96孔板）上進(jìn)行，以SDS 2.0圖像分析軟件Allelic Discrimination程序分析不同等位基因所標(biāo)識(shí)的FAM和VIC終點(diǎn)熒光信號(hào)強(qiáng)度，判定待測(cè)樣本的基因型。

1.3基因表達(dá)研究方法

1.3.1總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 30例患者和26名對(duì)照者各抽取靜脈血3 mL，2%的乙二胺四乙酸抗凝。采用Super超純?nèi)俁NA快速提取試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）提取外周血總RNA。使用HiFi逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）合成cDNA，cDNA合成的總體積40 μL，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照試劑盒操作手冊(cè)。

1.3.2ANK3基因表達(dá)水平檢測(cè) 使用TaqMan MGB探針?lè)ㄔ贏BI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)ANK3基因的mRNA表達(dá)水平。使用管家基因GUSB作為內(nèi)對(duì)照基因以標(biāo)化目的基因的表達(dá)水平。ANK3基因和GUSB基因表達(dá)的檢測(cè)探針（探針序列號(hào)分別為ANK3：Hs00241738_mL，GUSB：HS99999908_mL）均于美國(guó)ABI公司定制。每個(gè)樣本的ANK3基因和內(nèi)對(duì)照GUSB基因均重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)立6個(gè)陰性對(duì)照孔。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系共20 μL：cDNA模板6 μL，TaqMan Universal PCR MasterMix 10 μL，TaqMan MGB Probe+Primer 1 μL，RNase-free H2O 3 μL。反應(yīng)條件：50℃孵育2 min，95℃預(yù)變性10 min，（95℃變性15 s，60℃退火1 min）×40個(gè)循環(huán)?；颊呓MPCR擴(kuò)增失敗5例，對(duì)照組PCR擴(kuò)增失敗1例。采用比較循環(huán)數(shù)（cyclethreshold，CT）的方法進(jìn)行相對(duì)定量，使用SDS ver?sion 2.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果以CT值顯示，CT值為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個(gè)樣本的ΔCT值=單個(gè)樣本平均CT（ANK3基因）-單個(gè)樣本平均CT（GUSB基因）。以對(duì)照組的平均ΔCT值為參照標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算每例患者的ΔΔCt值（每例患者的ΔΔCT值=每例患者ΔCT值-對(duì)照組平均ΔCT值），以2-ΔΔCt反映基因表達(dá)差異的倍數(shù)，即目的基因的表達(dá)水平[10]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 基因多態(tài)性分析均在SHEsis遺傳分析在線軟件（http：//analysis.bio-x.cn/）中進(jìn)行。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗(yàn)，以及兩組間等位基因和基因型頻率比較。統(tǒng)計(jì)效能采用Quanto 1.2.4軟件計(jì)算。計(jì)算兩位點(diǎn)間連鎖不平衡（linkage disequilibrium，LD）程度，用D'值度量，D'值范圍0～1，通常2個(gè)位點(diǎn)之間的D'值較高說(shuō)明LD程度較高。對(duì)rs10994336、rs10994359位點(diǎn)進(jìn)行單體型分析，舍棄在每組中頻率＜3%的單體型，組間單體型頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，單體型與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)用OR值及其95%CI分析。ANK3基因表達(dá)量使用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1精神分裂癥ANK3基因多態(tài)性

2.1.1Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) ANK3基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)rs10994336和rs10994359的基因型分布在患者組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡定律（均P＞0.05），具有群體代表性。

2.1.2樣本統(tǒng)計(jì)效能 rs10994336最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）為0.218，統(tǒng)計(jì)效能（1-β）為0.958；rs10994359的MAF為0.306，統(tǒng)計(jì)效能（1-β）為0.979。

2.1.3基因型和等位基因分布 患者組與對(duì)照組間rs10994336、rs10994359位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.1.4連鎖不平衡及單體型關(guān)聯(lián)分析 對(duì)2個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs10994336、rs10994359）進(jìn)行相鄰位點(diǎn)間LD分析，結(jié)果顯示D'=0.961，提示2個(gè)SNPs位點(diǎn)之間存在LD現(xiàn)象。對(duì)2個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成的單體型進(jìn)行分析，由rs10994336-rs10994359組成的單體型C-C（P=0.80）、C-T（P=0.41）、T-C（P=0.45）頻率分布在兩組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，T-T型因?yàn)轭l率＜0.03而未納入分析。見(jiàn)表2。

2.2急性期精神分裂癥患者外周血中ANK3基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 急性期精神分裂癥患者組ANK3基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平為（1.12±0.22），略高于對(duì)照組（1.02±0.24），但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.39，P=0.16）。

3　討論

表1　患者組和對(duì)照組ANK3基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型和等位基因分布[n（%）]

近年來(lái)，精神分裂癥“神經(jīng)發(fā)育假說(shuō)”得到越來(lái)越多證據(jù)支持[1]，ANK3基因編碼的Ankyrin-G在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中必不可少[3]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有影響離子通道集聚與動(dòng)作電位產(chǎn)生、維護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的極性、神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)保護(hù)等功能[11-13]。ANK3基因遺傳變異和表達(dá)異常介導(dǎo)神經(jīng)發(fā)育異常，這些均與精神分裂癥相關(guān)[5,8]。本研究對(duì)456例中國(guó)漢族精神分裂癥患者和495名健康對(duì)照者的 ANK3基 因多 態(tài) 性位 點(diǎn) rs10994336和rs10994359進(jìn)行分析，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)2個(gè)位點(diǎn)與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)。隨后比較30例急性期精神分裂癥患者和26名健康對(duì)照者外周血ANK3基因mRNA的表達(dá)水平，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)急性期精神分裂癥患者外周血ANK3基因表達(dá)水平異常。

表2　患者組和對(duì)照組rs10994336-rs10994359單體型頻率[n（%）]

迄今為止，對(duì)于位點(diǎn)rs10994336與精神分裂癥關(guān)系的研究結(jié)論存有爭(zhēng)議。YUAN等[5]在中國(guó)上海進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與精神分裂癥有關(guān)聯(lián)；然而TESLI等[6]和GELLA等[7]在北歐和德國(guó)人群中發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與精神分裂癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。本研究結(jié)論與TESLI等[6]和GELLA等[7]研究結(jié)論一致。比較本研究樣本和YUAN等[5]研究樣本的等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)研究的對(duì)照樣本中該位點(diǎn)等位基因頻率分布具有一定差異（本研究的MAF為0.218，YUAN等[5]研究的MAF為0.26），這提示該位點(diǎn)可能因?yàn)闃颖緛?lái)源地域不同而存在人群差異。另外，精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，具有很高的遺傳異質(zhì)性，這可能也是導(dǎo)致研究結(jié)論不一致的原因。2011年精神疾病基因組學(xué)協(xié)會(huì)精神分裂癥工作小組[4]進(jìn)行大樣本GWAS，發(fā)現(xiàn)ANK3基因的一個(gè)新關(guān)聯(lián)位點(diǎn)rs10994359。遺憾的是，本研究未能重復(fù)該位點(diǎn)的陽(yáng)性結(jié)果，分析原因可能是因?yàn)闃颖玖俊⑦z傳背景、生活環(huán)境等差異所致。由于本研究?jī)H考察rs10994336和rs10994359 2個(gè)位點(diǎn)與精神分裂癥的關(guān)系，因此不能排除ANK3基因區(qū)域內(nèi)其他位點(diǎn)對(duì)精神分裂癥易患風(fēng)險(xiǎn)的貢獻(xiàn)。在本研究基因表達(dá)水平分析中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)急性期精神分裂癥患者外周血ANK3基因mRNA表達(dá)水平異常。由于基因表達(dá)在中樞和外周血中的復(fù)雜性[8-9]，ANK3基因在腦中的表達(dá)水平及其與精神分裂癥的關(guān)系尚有待進(jìn)一步研究。

本研究從基因多態(tài)性、基因表達(dá)2個(gè)層面對(duì)ANK3基因與精神分裂癥的關(guān)系展開(kāi)研究，2個(gè)層次的研究結(jié)果一致，即在本研究人群中未發(fā)現(xiàn)ANK3基因?qū)穹至寻Y的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。在基因多態(tài)性研究中，本研究的統(tǒng)計(jì)功效較大，假陰性的可能性較小，結(jié)果對(duì)未來(lái)中國(guó)漢族精神分裂癥ANK3基因的研究有一定參考價(jià)值。

不同人種以及相同人種在不同區(qū)域產(chǎn)生的遺傳背景差異是群體遺傳學(xué)研究結(jié)果難以得到重復(fù)性驗(yàn)證的主要原因之一。本研究只涉及ANK3基因的2個(gè)位點(diǎn)，忽視了該基因區(qū)域內(nèi)其他位點(diǎn)，在今后的研究中可以進(jìn)行高密度的SNPs檢測(cè)。而本研究中基因表達(dá)分析的樣本量偏小，限制了該部分分析的統(tǒng)計(jì)功效，未來(lái)研究將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，以期獲得更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕Y(jié)果。

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（責(zé)任編輯：肖雅妮）

R749.3

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.09.007

☆國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81160171）

*昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科（昆明 650032）△云南省精神衛(wèi)生中心

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2016-03-14）