馬索羅酚對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠IL-6、IL-17、TGF-b表達(dá)的影響

李彬　張彥博　孔鵬　張靜　陳麗萍　郭力

·論 著·

馬索羅酚對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠IL-6、IL-17、TGF-b表達(dá)的影響

李彬*張彥博*孔鵬*張靜*陳麗萍*郭力*

目的觀察馬索羅酚（nordihydroguaiaretic acid,NDGA）對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）小鼠IL-6、IL-17、TGF-β表達(dá)的影響。方法采用MOG35-55多肽為抗原免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型。小鼠隨機分成對照組、模型組和治療組，各組18只。治療組給予馬索羅酚10 mg/(kg·d)干預(yù)，對照組及模型組給予等量溶劑干預(yù)。分別在發(fā)病后10 d、20 d進(jìn)行神經(jīng)功能評分后取材，采用實時定量PCR方法檢測小鼠腰髓和脾組織IL-6、IL-17、TGF-bmRNA表達(dá)水平，采用ELISA方法檢測腦組織IL-6、IL-17、TGF-b蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 模型組與治療組發(fā)病10 d、20 d時神經(jīng)功能評分為（7.22±1.10）、（4.22±0.97），（2.89±1.05）、（1.33±0.71），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療組與模型組比較結(jié)果如下。脊髓組織：①IL-6水平發(fā)病10 d時（8.54±2.49）、（14.07±3.19），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；發(fā)病20 d時（4.26±1.44）、（4.90±1.24），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。②IL-17水平發(fā)病10 d時（25.50±11.77）、（47.59±8.01）；發(fā)病20 d時（10.02±2.99）、（20.14±4.57），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③TGF-b水平發(fā)病10 d時（0.74±0.11）、（0.04± 0.01）；發(fā)病20 d時（1.49±0.30）、（0.59±0.23），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。腦組織（pg/mL）：①IL-6水平發(fā)病10 d時（44.58±6.94）、（57.46±7.32）；發(fā)病20 d時（35.85±9.58）、（51.29±2.09），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。②IL-17水平發(fā)病10 d時（515.90±63.10）、（899.89±242.39）；發(fā)病20 d時（437.71±137.35）、（730.32±139.94），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③TGF-b水平發(fā)病10 d時（170.88±24.69）、（132.85±20.27）；發(fā)病20 d時（229.59± 32.10）、（172.58±16.94），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。脾組織：①IL-6水平發(fā)病10 d時（6.51±1.29）、（19.76± 5.85），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；發(fā)病20 d時（3.13±0.78）、（4.14±0.58），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。②IL-17水平發(fā)病10 d時（2.08±1.19）、（7.50±1.31）；發(fā)病20 d時（0.67±0.41）、（2.75±0.44），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③TGF-b水平發(fā)病10 d時（0.61±0.16）、（0.08±0.02）；發(fā)病20 d時（1.77±0.39）、（0.50±0.33），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論馬索羅酚可以改善EAE小鼠病情，其作用機制可能與下調(diào)IL-6、IL-17表達(dá)，上調(diào)TGF-b表達(dá)有關(guān)。

馬索羅酚 實驗性自身免疫性腦脊髓炎 白細(xì)胞介素6白細(xì)胞介素17轉(zhuǎn)化生長因子b

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種以炎性脫髓鞘和軸索損傷為特征、由免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]，其主要病理生理過程包括異常的免疫應(yīng)答及氧化應(yīng)激[2]。研究顯示，Nrf2/ARE通路激活劑可通過調(diào)節(jié)免疫及抗氧化雙重作用對MS的動物模型產(chǎn)生保護(hù)作用[3]。馬索羅酚（nordi?hydroguaiaretic acid,NDGA）為一種新的Nrf2/Ke?ap1/ARE通路激活劑[4]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。但NDGA是否對MS具有潛在的治療作用尚未見報道。本實驗通過NDGA干預(yù)的動物實驗，探索其作用機制及對MS的治療作用。前言一段即可，請盡量不要出現(xiàn)科普類語言，簡要介紹研究背景和目的即可。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雌性C57BL/6小鼠54只，體重18～20 g，周齡8～10周，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2實驗動物分組將54只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組和治療組，每組18只。各組再隨機分為10 d組、20 d組，每亞組9只。各亞組中，5只小鼠用于ELISA檢測，4只用于實時定量PCR檢測。自發(fā)病（weaver評分≥1分）當(dāng)天（記為第0天）起至處死，治療組給予腹腔注射NDGA（百靈威科技有限公司）溶液10 mg/（kg.d），對照組及模型組給予等量5%DMSO（Sigma）10 mL/（kg.d）腹腔注射。

1.3動物模型制備及神經(jīng)功能評分 取抗原MOG35-55（西安霖肽生物科技有限公司）溶于生理鹽水，稀釋為5 mg/mL溶液后加入等體積完全弗氏佐劑（Sigma），充分乳化后按每只0.1 mL于小鼠脊柱兩側(cè)分四點皮下注射，并分別于免疫后第0 h及第48 h腹腔注射500 ng PTX（ENZO corpora?tion），制作模型組及治療組EAE模型[3]。對照組以相同方法給予等量生理鹽水。

神經(jīng)功能評分采用weaver（15分）法，標(biāo)準(zhǔn)如下。尾巴：無癥狀0分，張力減低或遠(yuǎn)端癱瘓1分，全癱2分；四肢：無癥狀0分，步態(tài)不穩(wěn)1分，肢體輕癱、行走時肢體拖曳2分，肢體全癱、行走時肢體外翻3分。逐一評價，分值累加。小鼠死亡時15分[5]。計算各組小鼠神經(jīng)功能評分均值。

1.4實時熒光定量 PCR 檢測 IL-6、IL-17、TGF-βmRNA水平取小鼠腰髓及脾組織，提取總RNA，應(yīng)用All-in-One?First-Strand cDNA Syn?thesis Kit試劑盒（復(fù)能基因公司）反轉(zhuǎn)錄合成cD?NA，根據(jù)All-in-One? qPCR Mix試劑盒（復(fù)能基因公司）說明書進(jìn)行實時定量PCR檢測。GAPDH作為內(nèi)參。擴增條件：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，重復(fù)45個循環(huán)。70℃至95℃繪制熔解曲線。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值，計算IL-6、IL-17、TGF-b mRNA相對水平。

1.5ELISA方法檢測IL-6、IL-17、TGF-β蛋白表達(dá)水平取腦組織，以4℃混有蛋白酶抑制劑的0.1%PBS溶液配成10%腦組織勻漿液，置于4℃5000 r/min離心10 min。取上清液，采用小鼠定量分析酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（中國上海巧伊生物科技有限公司），按照說明書操作，檢測組織中IL-6、IL-17、TGF-b蛋白含量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準(zhǔn)α為0.05。

2　結(jié)果

2.1基線資料 實驗用藥前，對照組小鼠體重（19.1±0.8）g，模型組（19.2±0.9）g，治療組（19.0± 0.3）g，3組體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。神經(jīng)功能評分3組均為0分。

2.2神經(jīng)功能評分對照組小鼠無發(fā)病，體重漸增，反應(yīng)靈敏，尾部有張力。模型組及治療組小鼠免疫后全部發(fā)病，大部分以尾部張力下降為首發(fā)癥狀，發(fā)病后癥狀逐漸加重，繼之出現(xiàn)后肢無力、癱瘓、嚴(yán)重者累及雙前肢，治療組癥狀相對較輕，進(jìn)入緩解期后，癥狀較前好轉(zhuǎn)，肢體無力較前減輕。治療組平均神經(jīng)功能評分較模型組顯著降低（P＜0.05）（見表1）。

2.3脊髓及脾組織IL-6、IL-17、TGF-b mRNA水平 發(fā)病10 d時，與對照組相比，模型組及治療組小鼠脊髓及脾組織IL-6、IL-17 mRNA水平增高（P＜0.05），TGF-β mRNA水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，治療組小鼠脊髓及脾組織IL-6、IL-17 mRNA水平降低（P＜0.05），TGF-β mRNA水平增高（P＜0.05）（表2、3）。

表1　各組小鼠神經(jīng)功能評分（n=9）

表2　各組小鼠脊髓組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平（n=4）

發(fā)病20 d時，與對照組相比，模型組及治療組小鼠脊髓及脾組織IL-6、IL-17 mRNA水平增高（P＜0.05）。與對照組比較，模型組TGF-b mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），治療組TGF-b mRNA水平增高（P＜0.05）；與模型組相比，治療組小鼠脊髓及脾組織IL-17 mRNA水平降低，TGF-b mRNA水平增高（P＜0.05），IL-6 mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（表2、3）。

2.4腦組織IL-6、IL-17、TGF-β蛋白表達(dá)水平發(fā)病10 d時，與對照組相比，模型組及治療小鼠腦組織IL-6、IL-17含量增高（P＜0.05），模型組TGF-β含量降低（P＜0.05）；治療組TGF-β表達(dá)無明顯差異（P＞0.05）。與模型組相比，治療組小鼠IL-6、IL-17含量降低（P＜0.05），TGF-β含量增高（P＜0.05）（表4）。

發(fā)病20 d時，與對照組相比，模型組小鼠腦組織IL-6、IL-17含量增高（P＜0.05），TGF-β含量無明顯差異（P＞0.05）；與對照組相比，治療組IL-6、IL-17含量無明顯差異（P＞0.05），TGF-β含量增高（P＜0.05）；與模型組相比，治療組小鼠腦組織IL-6、IL-17含量降低（P＜0.05），治療組TGF-b較模型組增高（P＜0.05）（表4）。

3　討論

MS病因目前尚不完全明確，但髓鞘蛋白激活的CD4+T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子在MS的急性炎癥病變和疾病進(jìn)展中的重要作用已被試驗所證實[6]，后者包括IL-6、IL-17、TGF-b等。這些細(xì)胞因子在破壞血腦屏障、殺傷神經(jīng)元、影響神經(jīng)干細(xì)胞增殖和促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡等方面起著重要作用[7]。馬索羅酚以抗炎、抗氧化為特征，通過調(diào)節(jié)Nrf2/ ARE通路、減少促炎介質(zhì)釋放、抑制神經(jīng)元凋亡，在許多炎癥疾病如肝、腎損傷和神經(jīng)變性疾病中均有細(xì)胞保護(hù)作用[4]。但目前并沒有NDGA用于MS治療的研究，本文重點研究NDGA對EAE模型中細(xì)胞因子的變化的影響。本研究主要針對EAE模型中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變進(jìn)行研究，故研究組織選擇大腦和脊髓；此外，脾臟含有豐富的淋巴組織，其同樣是單核-巨噬系統(tǒng)的重要實體器官，在免疫應(yīng)答中起重要作用[8-10]，故本研究中同樣納入脾組織進(jìn)行分析。

表3　各組小鼠脾組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平（n=4）

表4　ELISA法檢測各組小鼠腦組織炎癥因子蛋白表達(dá)水平（n=5）

本實驗應(yīng)用NDGA治療EAE小鼠，治療組小鼠的癥狀評分比模型組明顯降低，表明NDGA可以顯著改善EAE小鼠臨床表現(xiàn)，提示其可以在MS中起到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能。目前已知IL-6、IL-17在EAE病程中發(fā)揮促炎作用，而TGF-b在缺乏IL-6條件下促使T細(xì)胞向Treg細(xì)胞分化起抗炎作用。本研究中，急性期模型組小鼠IL-6、IL-17的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平均增高，TGF-b的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平降低；緩解期IL-6、IL-17水平較急性期下降，而TGF-b水平較急性期回升。提示NDGA的神經(jīng)保護(hù)功能可能與改變這些細(xì)胞因子的表達(dá)相關(guān)。一些研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：在Nrf 2小鼠顱腦損傷的研究中NDGA可以減少炎性介質(zhì)包括IL-6等分泌[11]。在硫唑嘌呤誘發(fā)的腎病模型中，NDGA恢復(fù)了其TGF-β的表達(dá)，在避免腎功能損傷的同時，減少了蛋白尿[12]。除此之外，本研究中還涉及了NDGA與IL-17的關(guān)系。IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的炎癥介質(zhì)，目前相關(guān)研究較少，更沒有與NDGA相關(guān)的報道。與傳統(tǒng)的IL-6、TGF-β不同，IL-17是通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集；促進(jìn)CCL2、IL-6和IL8產(chǎn)生，引起血腦屏障中血管內(nèi)皮細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生；破壞緊密連接蛋白表達(dá)和內(nèi)皮細(xì)胞彈性，導(dǎo)致血腦屏障破壞等發(fā)揮其促炎作用[13]。本研究證實NDGA可抑制IL-17表達(dá)，而IL17水平的降低與減少EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性浸潤和髓鞘脫失有重要關(guān)聯(lián)。

通過NDGA治療組和模型組的比較，我們發(fā)現(xiàn)NDGA可減少IL-6、IL-17基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而降低Th17細(xì)胞分化；提高TGF-β轉(zhuǎn)錄和翻譯，促進(jìn)Treg細(xì)胞分化，抑制EAE小鼠的異常炎癥反應(yīng)。這一結(jié)果提示NDGA可能是通過糾正Th17/ Treg細(xì)胞因子失衡，并影響初始T細(xì)胞的分化和繁殖對疾病進(jìn)程干預(yù)。雖然MS的免疫機制錯綜復(fù)雜，需要進(jìn)一步的研究和探索，但NDGA可以改善EAE小鼠的癥狀評分和平衡炎癥相關(guān)因子。

綜上，本實驗結(jié)果表明NDGA可以緩解EAE小鼠神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，下調(diào)促炎因子IL-6、IL-17的轉(zhuǎn)錄和翻譯、上調(diào)炎癥抑制因子TGF-β的轉(zhuǎn)錄和翻譯，顯示出神經(jīng)保護(hù)作用和免疫抗炎特性，為多發(fā)性硬化治療提供了新的可能途徑。

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（責(zé)任編輯：李立）

NDGA ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis via the regulation of IL-6,IL-17 and TGF-b.

LI Bin,ZHANG Yanbo,KONG Peng,ZHANG Jing,CHEN Liping,GUO Li.Department of Neurology,the Second Hospital of Hebei Medical University；Key Laboratory of Hebei Neurology，Shijiazhuang050000,China.Tel：0311-6603921.

Objective To investigate the effects of nordihydroguaiaretic acid(NDGA)on the expression of IL-6, IL-17 and TGF-β in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods C57BL/6 mice were immu?nized with MOG35-55 to induce EAE.The 54 mice were randomly and equally divided into control group,model group and treatment group.Mice in treatment group were daily administered with NDGA(10 mg/kg)by intraperitoneal injection following onset of EAE.Mice in control and model groups were daily treated with equivalent vehicle.Real-time PCR was used to detect IL-6,IL-17 and TGF-b mRNA levels in the spinal cord and spleen on day 10 and 20 post treatment.ELI?SA was used to examine IL-6,IL-17 and TGF-b expression levels in the brain.Results The neurological deficit scores were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(7.22±1.10 vs.4.22±0.97 on 10 day,P＜0.05；2.89±1.05 vs.1.33±0.71 on 20 days,P＜0.05).The level of of IL-6 in spinal cord was significantly different between EAE group and treatment group on 10 day but not on 20 days(8.54±2.49 vs.14.07±3.19 on 10 days,P＜0.05；2.89±1.05 vs.1.33±0.71,P＞0.05).The level of IL-17 in spinal cord were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(25.50±11.77 vs.47.59±8.01 on 10 day,P＜0.05；10.02±2.99 vs.20.14±4.57 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-β in spinal cord were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(0.74±0.11 vs.0.04±0.01 on 10 day,P＜0.05；1.49±0.30 vs.0.59±0.23 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-6 in brain were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(44.58±6.94 vs. 57.46±7.32 on 10 day,P＜0.05；35.85±9.58 vs.51.29±2.09 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-17 in brain were signifi?cantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(515.90±63.10 vs.899.89±242.39 on 10 day, P＜0.05；437.71±137.35 vs.730.32±139.94 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-βin brain were significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(170.88±24.69 vs.132.85±20.27 on 10 day,P＜0.05；229.59± 32.10 vs.172.58±16.94 on 20 day,P＜0.05).The level of IL-6 in spleen was significantly different between EAE group and treatment group on 10 day but not on 20 day(6.51±1.29 vs.19.76±5.85 on 10 day,P＜0.05；3.13±0.78 vs.4.14±0.58 on 20 day,P＞0.05).The level of IL-17 in spleen on 10 day was significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(2.08±1.19 vs.7.50±1.31 on 10 day,P＜0.05；0.67±0.41 vs.2.75±0.44 on 20 day,P＜0.05).The level of TGF-β in spleen was significantly different between EAE group and treatment group on 10 and 20 days(0.61± 0.16 vs.0.08±0.02 on 10 day,P＜0.05；1.77±0.39 vs.0.50±0.33 on 20 day,P＜0.05).Conclusions NDGA can ameliorate the development of EAE by reducing IL-6,IL-17 production and increasing TGF-β production.

Nordihydroguaiaretic acid Experimental autoimmune encephalomyelitis IL-6 IL-17 TGF-β

R744

A

10.3969/j.issn.1002-0152.2016.09.005

☆國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81100884）

*河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北省神經(jīng)病學(xué)重點實驗室(石家莊050000)

?（E-mail：guoli6@163.com）

2016-06-13）