游泳運動對糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響

張 坦，崔 迪，張 喆，孫 易，丁樹哲

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游泳運動對糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響

張 坦1,2，崔 迪1,2，張 喆1,2，孫 易1,2，丁樹哲1,2

目的：探討耐力運動對糖尿病小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路及相關(guān)炎癥因子的影響，以其從骨骼肌慢性炎癥的角度為肥胖、糖尿病等代謝類疾病的防治提供新的研究靶向。方法：采用4周高脂膳食喂養(yǎng)加注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)的方法構(gòu)建糖尿病小鼠模型，建模成功后隨機分為安靜對照組(C)、運動對照組(E)、糖尿病安靜組(D)、糖尿病運動組(DE)。E組和DE組進行6周游泳耐力運動，1 h/天，5天/周。末次運動結(jié)束，空腹12 h后處死小鼠并采樣。RT-PCR及Western Blotting技術(shù)檢測相關(guān)基因的mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果：1)與C組相比，D組小鼠體重極顯著降低(P<0.01)，空腹血糖顯著升高(P<0.01)；與C組相比，E組小鼠體重顯著降低(P<0.05)；與D組相比，DE組小鼠空腹血糖顯著降低(P<0.05)；與E組相比，DE組小鼠體重極顯著性降低(P<0.01)，空腹血糖極顯著性升高(P<0.01)。2)與C組相比，D組小鼠IL-10mRNA表達極顯著性降低(P<0.01)，E組IL-6 mRNA表達顯著性升高(P<0.05)，IL-10 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)；與D組相比，DE組TNF-α mRNA表達顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)；與E組相比，DE組IL-6 mRNA表達顯著性下降(P<0.05)。3)與C組相比，D組 AMPK蛋白表達和AMPK活性顯著性下降(P<0.05)，NF-κBp65 mRNA表達顯著性升高(P<0.05)；與D組相比，DE組AMPKα2及SIRT1 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)，AMPK及p-AMPK蛋白表達和AMPK活性顯著性升高(P<0.05)，NF-κBp65蛋白表達極顯著性下降(P<0.01)；與E組相比，DE組SIRT1 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)。結(jié)論：長期耐力運動可抑制糖尿病小鼠骨骼肌中促炎因子的基因表達，促進抗炎因子的基因表達，同時，AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的被抑制效應(yīng)得到緩解。

耐力運動；糖尿?。还趋兰。谎装Y；AMPK/SIRT1/NF-кB

現(xiàn)代社會的不斷進步已成功抵御了多種疾病，極大地延長了人類壽命，改善了人類生活質(zhì)量。然而，與此同時，長期高熱量膳食與缺乏運動導(dǎo)致以胰島素抵抗為主要病理特征的肥胖、糖尿病等代謝類疾病的發(fā)病率在全世界范圍內(nèi)逐年攀升。針對肥胖導(dǎo)致胰島素抵抗的分子機制，人們提出了包括氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、缺氧等在內(nèi)的多種假說[30]。自1999年，慢性炎癥學(xué)說逐漸得到認可[40]。哈佛醫(yī)學(xué)院的Bruce M.Spiegelman首次提出“胰島素抵抗的核心是炎癥”這一概念。肥胖時機體常處于慢性炎癥狀態(tài)，主要特征是促炎癥因子，如(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor,TGF-β)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)等水平升高，同時炎癥信號通路，如氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase,JNK)、核因子κB (nuclear factor-κB,NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等被激活。越來越多的證據(jù)表明，肥胖相關(guān)的慢性炎癥是肥胖誘發(fā)的胰島素抵抗的主要機制[20,27]。目前，炎癥在運動、健康和疾病中的作用備受關(guān)注，被列為2014年ACSM年會主題(http://www.acsm.org/attend-a-meeting/2014-annual-meeting)。近年來國內(nèi)運動人體科學(xué)領(lǐng)域?qū)β匝装Y的關(guān)注也逐漸增多，但研究基本停留在檢測炎癥因子表達等水平，對相關(guān)的分子機制研究尚不夠深入。

骨骼肌是機體最大的代謝器官，在維持整個機體代謝平衡中扮演著極為重要的角色，同時胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取80%由骨骼肌完成。近年的研究結(jié)果證實，除脂肪組織和肝臟組織[2]外，骨骼肌是機體慢性炎癥發(fā)生、發(fā)展的又一重要組織，骨骼肌慢性炎癥是肥胖和T2DM發(fā)病的早期分子事件[9]，可導(dǎo)致骨骼肌穩(wěn)態(tài)失調(diào)，蛋白水解活性和骨骼肌再生能力減弱[8]。但肥胖導(dǎo)致骨骼肌慢性炎癥的機制并不完全明了，其中炎癥信號通路腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)/沉默信息因子2相關(guān)酶1(silent mating type information regulation 2 homolog1,SIRT1)/NF-кB[16,32]信號通路可能參與其中，但目前關(guān)于運動對骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-кB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)影響的研究甚少。鑒于此，本研究擬通過構(gòu)建糖尿病小鼠模型并施以運動干預(yù)，探究AMPK/SIRT1/NF-кB信號通路與骨骼肌炎癥反應(yīng)的內(nèi)在聯(lián)系及其與代謝性疾病的相關(guān)機制，以期為肥胖、糖尿病等代謝類疾病的運動防治提供理論依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級4周齡C57BL/6雄性小鼠共39只，體重為16.49±1.50 g，均由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2007-0005實驗動物的使用許可證號：SYXK(滬)2004-0001。所有小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機分為正常對照組(n=16)和糖尿病建模組(n=23)，其中正常對照組飼喂普通飼料，糖尿病建模組為高脂飼料(基礎(chǔ)飼料54.6%，豬油16.9%，蔗糖14%，酪蛋白10.2%，預(yù)飼料2.1%，麥芽糊精2.2%)。實驗小鼠自由飲食、飲水，1～2天更換一次墊料。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20℃～24℃，相對濕度維持在50%～70%，自然光照，通風流暢。

1.2 糖尿病小鼠模型的建立

將糖尿病建模組小鼠持續(xù)高脂膳食喂養(yǎng)4周后注射STZ構(gòu)建糖尿病小鼠模型，其中STZ的注射劑量為50 mg/天/kg體重，注射持續(xù)5天，根據(jù)空腹血糖水平確定是否造模成功，以空腹血糖大于11.1 mmol/L為造模成功判定標準[12]。如表1所示，4周高脂膳食聯(lián)合STZ給藥干預(yù)后，糖尿病組小鼠空腹血糖顯著高于正常對照組(P<0.01)，提示糖尿病小鼠模型建立成功。最終共有16只小鼠符合糖尿病建模標準。

表1 小鼠的空腹血糖

建模成功后將兩組小鼠再進一步分組，其中正常對照組隨機分為安靜對照組(C，n=8)和運動對照組(E，n=8)，糖尿病建模組隨機分為糖尿病安靜組(D，n=8)和糖尿病運動組(DE，n=8)。

1.3 實驗動物的運動方案

鑒于與其它運動類型相比，游泳運動是一種對動物創(chuàng)傷及痛苦極小的運動。此外，6周游泳運動足以增強老年糖尿病大鼠骨骼肌抗氧化能力[31]，且糖尿病小鼠無負重游泳的強度相當于未經(jīng)訓(xùn)練個體最大攝氧量的40%～60%[37]。因此本實驗中E組和DE組的運動方案為：6周無負重的游泳耐力運動，每天1 h(4：30 pm-5：30 pm)，每周5天(周1～周5)。末次運動結(jié)束，實驗小鼠空腹12 h后處死。取右側(cè)股四頭肌，迅速裝入已經(jīng)標記好的凍存管中，立即置于液氮中速凍，之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存，待測。

1.4 Real-Time PCR

主要包括4個過程：1)骨骼肌中RNA提取。冰上稱取一側(cè)股四頭肌約60 mg，根據(jù)Invitrogen TRIZOL方法提取骨骼肌RNA；2)RNA濃度和純度的檢測。超微紫外/可見光分光光度計來測所提RNA的濃度和純度；3)RNA反轉(zhuǎn)錄。將提取的RNA用TOYOBO FSQ101試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；4)RT-PCR擴增，ABI StepOne 型實時熒光定量PCR儀檢測相關(guān)炎癥因子基因以及AMPK/SIRT1/NF-κB信號通路基因相對含量，擴增所用的熒光染料為TOYOBO QPK201 SYBR GREEN，實驗所用引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.5 Western-Blotting

取股四頭肌約50 mg冰上剪碎置于研磨管中，加入0.35 ml裂解液(裂解液構(gòu)成為10 ml WB&IP lysis 裂解液+100 μl PMSF+1片磷酸酶抑制劑)，OMINI Bead Ruptor 24 型磁珠勻漿儀勻漿，12 000 g離心20 min，轉(zhuǎn)上清液于離心管中，BCA法測定蛋白濃度后變性。蛋白變性并調(diào)平濃度后即可進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗。本實驗采用12%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PDVF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，棄掉封閉液加入對應(yīng)一抗4℃孵育過夜，1ⅹTBST洗膜3次，10 min/次，根據(jù)一抗加入相應(yīng)稀釋的二抗，室溫避光孵育2 h，再次洗膜，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，Alpha FC2 型凝膠成像系統(tǒng)掃膜并進行灰度值分析。其中AMPK、SIRT1、NF-κBp65抗體購于Santa Cruz公司，Phospho-AMPKα(Thr172)抗體購于CST公司，NF-κBp65(acetyl K310)購于abcam公司。

1.6 統(tǒng)計分析

2 實驗結(jié)果

2.1 耐力運動對小鼠體重及空腹血糖的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，糖尿病組小鼠體重極顯著性降低，空腹血糖極顯著性升高，而運動可以顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖。

如圖1所示，與C組相比，D組小鼠體重極顯著性降低(P<0.01)，空腹血糖極顯著性升高(P<0.01)；與C組相比，E組小鼠體重顯著性降低(P<0.05)；與D組相比，DE組小鼠空腹血糖顯著性降低(P<0.05)；與E組相比，DE組小鼠體重極顯著性降低(P<0.01)，空腹血糖極顯著性升高(P<0.01)。

圖1 運動對小鼠體重及空腹血糖的影響示意圖

2.2 耐力運動對小鼠骨骼肌內(nèi)炎癥因子mRNA表達的影響

本研究共檢測了小鼠骨骼肌中TNF-α、CCL2、IL-6、白介素10(IL-10)4種炎癥相關(guān)因子的基因表達，結(jié)果顯示，與C組相比，D組小鼠IL-10 mRNA表達極顯著性降低(P<0.01)，E組IL-6 mRNA表達顯著性升高(P<0.05)，IL-10 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)；與D組相比，DE組TNF-α mRNA表達顯著降低(P<0.05)，IL-10 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)；與E組相比，DE組IL-6 mRNA表達顯著性下降(P<0.05)。

2.3 耐力對小鼠骨骼肌內(nèi)AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響

與C組相比，D組 AMPK蛋白表達和AMPK活性顯著性下降(P<0.05)，NF-κBp65 mRNA表達顯著性升高(P<0.05)；與D組相比，DE組AMPKα2及SIRT1 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)，AMPK及p-AMPK蛋白表達和AMPK活性顯著性升高(P<0.05)，NF-κBp65蛋白表達極顯著性下降(P<0.01)；與E組相比，DE組SIRT1 mRNA表達極顯著性升高(P<0.01)。

圖2 運動對小鼠骨骼肌炎癥因子mRNA表達影響的示意圖

圖3 運動對小鼠骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路的影響示意圖

3 分析與討論

3.1 耐力運動對小鼠體重與空腹血糖的影響

體重在生物體的生長、發(fā)育、成熟、衰老等過程中呈現(xiàn)規(guī)律性變化，而糖尿病伴隨有“三多一少”的典型癥狀，因此，及時檢測糖尿病小鼠體重的變化可反映其生長發(fā)育情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，糖尿病小鼠體重顯著降低，主要表現(xiàn)為，與C組相比，D組小鼠體重顯著降低(P<0.01)；同樣地，與E組相比，DE組小鼠體重顯著降低(P<0.01)。然而遺憾的是，6周耐力運動對糖尿病小鼠體重的影響不大，其中與C組相比，E組小鼠體重顯著降低(P<0.05)，但與D組相比，DE組小鼠體重無變化。推測可能有多方面原因，首先，大量的研究發(fā)現(xiàn)，耐力運動可通過降低蛋白質(zhì)的合成以及增加蛋白質(zhì)的降解，進而抑制肌肉肥大[15]。因此，本實驗中的游泳耐力運動未能增加糖尿病小鼠的體重，其次，游泳的運動強度具有不可操縱性，而且運動首先引起分子機制層面的變化，即炎癥的發(fā)生是運動激活的早期信號，隨后才有體重等的整體變化。

糖尿病是一種由于胰島素分泌功能完全/部分喪失或胰島素受體數(shù)目減少和(或)敏感性下降所導(dǎo)致的代謝類疾病。由于胰島素調(diào)節(jié)血糖水平，所以，糖尿病患者的血糖水平升高，當血糖水平超過腎糖閾，則使葡萄糖從尿液中排出，因此，糖尿病的特征為高血糖和糖尿。本研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠的空腹血糖有所升高，表現(xiàn)為D組小鼠的空腹血糖顯著高于C組(P<0.01)，同時DE組小鼠的空腹血糖也顯著高于E組(P<0.01)。這是因為糖尿病小鼠由于缺乏胰島素分泌或者胰島素敏感性下降，無法指引葡萄糖載體4(glucose transport 4,GLUT4)蛋白轉(zhuǎn)移至肌細胞膜表面，或者肌細胞中的GLUT4不聽從胰島素的指導(dǎo)。而6周耐力運動可顯著降低小鼠空腹血糖，表現(xiàn)為DE組小鼠血糖顯著低于D組(P<0.05)，這是因為運動時胰島β細胞分泌胰島素減少，血漿胰島素濃度減低，但由于血液重新分配，流到骨骼肌的血量相對增加很多，因此即使血漿胰島素濃度降低，運輸?shù)焦趋兰≈械囊葝u素仍然較多。由于血量增多，一些在休息狀態(tài)下未開放的骨骼肌毛細血管開放，血液中的胰島素可能與一些在休息狀態(tài)下不能接觸的胰島素受體結(jié)合，提高了結(jié)合受體的數(shù)目，因此胰島素的敏感性也得以上調(diào)[5]。胰島素敏感性上升能夠指引更多的GLUT4轉(zhuǎn)移至肌細胞膜表面，使得機體對葡萄糖的攝取量增加，從而降低血糖。

3.2 耐力運動對小鼠骨骼肌內(nèi)炎癥因子mRNA表達的影響

TNF-α、CCL2、IL-6、IL-10等是衡量骨骼肌炎癥反應(yīng)水平的關(guān)鍵指標，其中TNF-α是首個被報道與肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗有關(guān)的炎癥因子。1993年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Spiegelman等人首次報道TNF-α缺失可顯著增加胰島素刺激的葡萄糖攝取，提示TNF-α是肥胖引起胰島素抵抗的重要介質(zhì)[22]。該團隊隨后進一步揭示了TNF-α的促炎機制，即TNF-α通過誘導(dǎo)IRS-1絲氨酸位點磷酸化，抑制IR酪氨酸激酶活性，從而阻礙胰島素信號，形成負反饋調(diào)節(jié)[21]。趨化因子能夠誘導(dǎo)細胞到達炎癥區(qū)域，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)。其中研究較廣泛且與胰島素抵抗關(guān)系最為密切的是CCL2。CCL2又稱MCP-1，是趨化因子原型，主要由脂肪細胞合成分泌，特異性結(jié)合受體CC類趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2,CCR2)發(fā)揮生理功能。研究者發(fā)現(xiàn)，MCP-1及其受體CCR2在肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗中起關(guān)鍵作用。MCP-1/ CCR2基因過表達可引起ATMs浸潤增多，巨噬細胞數(shù)量顯著增加，并出現(xiàn)胰島素抵抗癥狀。相反，MCP-1/ CCR2基因缺失可降低肥胖引起的巨噬細胞數(shù)量增加和炎癥水平升高，從而有效預(yù)防肥胖引起的胰島素抵抗。遺憾的是，本研究實驗結(jié)果未能檢測到糖尿病小鼠骨骼肌中CCL2 mRNA表達的明顯變化，同樣，6周規(guī)律性耐力運動對小鼠骨骼肌中CCL2 mRNA表達也無明顯影響，推測原因可能是因為CCL2作為趨化因子在骨骼肌慢性炎癥中的研究還不成熟，其在慢性炎癥中所扮演的角色有待進一步的深入研究。骨骼肌除參與物質(zhì)與能量代謝外，還可合成與分泌一系列的“肌肉因子”，其中IL-6是迄今為止研究最為廣泛的成員之一[29]。骨骼肌中合成分泌的IL-6可通過抑制促炎因子TNF-α、IL-1β等的釋放而發(fā)揮抗炎作用[28]。此外，IL-6還是機體重要的能量感受器，通過激活A(yù)MPK增加葡萄糖攝取、促進脂肪分解[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠骨骼肌中IL-6 mRNA表達降低，而6周規(guī)律性耐力運動能夠適度上調(diào)小鼠骨骼肌中IL-6 mRNA表達。IL-6作為骨骼肌的重要抗炎因子，其表達水平的變化趨勢與TNF-α、CCL2相反，由此反向證明，糖尿病能夠降低小鼠骨骼肌中抗炎因子的表達來進一步加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)，而長期有規(guī)律運動可通過增加骨骼肌中抗炎因子的表達來適度緩解炎癥狀況。IL-10是目前公認的炎癥與免疫抑制因子，體內(nèi)IL-10主要來源于巨噬細胞和T細胞，內(nèi)外性刺激(高脂等)首先激活NF-кB信號通路，進而引起巨噬細胞生成下游靶基因IL-10。本研究表明，糖尿病小鼠骨骼肌中IL- 10 mRNA表達下降，這再次證明了IL-10在骨骼肌中的抗炎效應(yīng)。令人驚喜的是，6周耐力運動可顯著上調(diào)小鼠骨骼肌中IL-10 mRNA表達。

3.3 耐力運動對骨骼肌AMPK/SIRT1/NF-κB通路的影響

目前研究較多的炎癥信號通路有NF-кB介導(dǎo)的炎癥信號通路、JNKs介導(dǎo)的炎癥信號通路、Janus激酶(Janus kinase,JAK)-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)介導(dǎo)的炎癥信號通路。

1986年Sen等人首次報道了轉(zhuǎn)錄因子NF-кB[33]，認為它是一種能夠與活化B細胞的免疫球蛋白к輕鏈上的增強子特異性結(jié)合的核因子，因此被命名為NF-кB。該轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于真核細胞內(nèi)，參與細胞的增殖、分化、凋亡、炎癥以及免疫應(yīng)答等重要的病理生理過程[4]。目前發(fā)現(xiàn)，NF-кB/Rel家族共有5個成員，即p65(RelA)、RelB、c-Rel、p50的前身p105(NF-кB1)和p52的前身p100(NF-кB2)[19]，功能型NF-кB由上述5個成員以同源或異源二聚體形式組成，其中異源二聚體p50/p65是NF-кB最常見的形式。NF-кB可經(jīng)經(jīng)典激活途徑和非經(jīng)典激活途徑被活化。在正常生理狀態(tài)下，NF-кB存在于細胞質(zhì)中，與核因子кB抑制蛋白α亞基(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cell inhibitor,IкBα)結(jié)合處于無活性狀態(tài)。當機體受到外界刺激時，IкB激酶(IкB kinase,IKK)被激活，隨后IKKβ磷酸化IкBα的32位和36位絲氨酸，磷酸化的IкBα再次被泛素化后在26S蛋白酶體的作用下降解，導(dǎo)致NF-кB復(fù)合體的核定位區(qū)域暴露，引發(fā)NF-кB由細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核，在細胞核中NF-кB誘導(dǎo)下游靶促炎因子基因，如TNF-α、IL-6和單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等的表達[3,24,26]。該途徑反應(yīng)迅速，5分鐘內(nèi)NF-кB可被激活且達到最大量。多種因素，如炎癥因子、病毒、細菌等均可啟動該通路。與上述經(jīng)典途徑相對應(yīng)，NF-кB活化的非經(jīng)典途徑只存在于少數(shù)類型的細胞中。AMPK/SIRT1可降低NF-кB的轉(zhuǎn)錄激活能力。在運動、熱量限制、白藜蘆醇等刺激作用下，細胞中AMP/ATP比值升高，AMPK被激活，導(dǎo)致NAD+濃度升高，煙酰胺(nicotinamide,NAM)濃度降低，進而激活SIRT1。SIRT1是一種進化高度保守的NAD+依賴性蛋白去乙?；?，其活性受能量變化調(diào)控。2004年Yeung等人[38]首次證實，SIRT1可直接與NF-кB復(fù)合體的RelA/p65亞基相互作用，去乙?；疨65亞基Lys310位點，而Lys310位點的去乙?；山档蚇F-кB的轉(zhuǎn)錄激活能力，最終抑制NF-кB介導(dǎo)的炎癥信號通路。AMPK/SIRT1抑制NF-кB的轉(zhuǎn)錄激活能力如圖4所示。

圖4 SIRT1通過去乙?；疪elA/p65亞基來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活能力[13]

研究表明，肥胖可激活NF-кB信號通路，且當NF-кB/IKK依賴的炎癥通路被抑制后，肥胖導(dǎo)致的胰島素抵抗癥狀得到明顯改善[39]。Austin等人[7]實驗結(jié)果證實，沉默人體骨骼肌細胞的IKKβ基因可提高糖攝取能力，進而緩解TNF-α所導(dǎo)致的機體骨骼肌胰島素抵抗癥狀。Green 和Andreasen等人[6,17]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者肌細胞中NF-кB活性增強，而AMPK能夠削弱該升高趨勢。Coll等人[14]進一步研究表明，C2C12骨骼肌細胞中NF-кB的促炎作用與PPARδ密切相關(guān)，即PPARδ激動劑可扭轉(zhuǎn)由脂肪酸引發(fā)的NF-кB活性升高，同時伴隨有胰島素抵抗癥狀的改善。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠骨骼肌中NF-κBp65 mRNA表達顯著性升高(P<0.05)，同時AMPK蛋白表達和AMPK活性顯著性下降(P<0.05)，提示AMPK/SIRT1/NF-кB通路參與小鼠骨骼肌慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。

活性氧可通過激活NF-κB誘導(dǎo)促炎因子的基因表達，促炎因子如TNF-α和IL-1通過活性氧激活NF-κB，誘導(dǎo)包括TNF-α和IL-1在內(nèi)的促炎因子基因表達，因此，活性氧和促炎因子之間通過NF-κB形成惡性循環(huán)，加重炎癥反應(yīng)[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，AMPK可通過抑制ROS-NF-κB通路來緩解慢性炎癥[18]。運動中機體所生成的活性氧可激活NF-κB信號通路，而NF-κB活性及通路相關(guān)基因的表達與運動強度、運動時間和運動頻率有關(guān)。其中Vella等人[36]研究發(fā)現(xiàn)，急性運動大鼠其骨骼肌中NF-κB DNA結(jié)合能力與p50蛋白含量均增加，而細胞質(zhì)中IκB與IKK的磷酸化水平均降低，這說明急性運動能夠激活NF-κB信號通路，而且可能是通過氧化還原的方式來完成的。與Vella等人的研究相似，Ji等人[23]實驗結(jié)果也表明，急性高強度抗阻運動能夠激活大鼠骨骼肌中NF-κB信號通路。然而，與急性運動不同，大量研究證實，長期規(guī)律性運動可降低由衰老和慢性炎癥反應(yīng)所導(dǎo)致的NF-κB活性上調(diào)。其中，Sriwijitkamol等人[35]發(fā)現(xiàn)，糖尿病個體其骨骼肌中IκB蛋白含量降低，同時IκB/NF-κB通路被激活，而8周有氧運動可明顯上調(diào)IκB蛋白含量，減少TNF-α合成分泌，增加胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取。Brooks 等人[10]報道，8周跑臺運動降低小鼠骨骼肌中ROS濃度和NF-κB活性，說明運動能夠減少骨骼肌中ROS的生成，進而保護機體免受ROS攻擊。本研究發(fā)現(xiàn)，耐力運動可顯著上調(diào)AMPK的mRNA、蛋白表達及活性，同時NF-κBp65蛋白表達顯著降低，提示，耐力運動可通過抑制AMPK/SIRT1/NF-κB通路來緩解骨骼肌慢性炎癥。此外，Zhao 等人[41]進一步實驗結(jié)果證實，長期游泳運動可顯著降低NF-κB蛋白表達，而且這種效應(yīng)在早期的、終生的運動中更加明顯。提示應(yīng)該從小堅持運動，而且樹立終生的運動理念是必須的。以上研究提示，NF-κB的適度表達在維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中不可或缺，長期規(guī)律性運動可通過下調(diào)NF-κB活性進而緩解炎癥反應(yīng)。此外，大量的研究表明，長期劇烈運動能夠提高NF-κB活性[25,34]，意味著運動強度對NF-κB活性的影響至關(guān)重要，因此，應(yīng)強調(diào)運動強度的重要性，在對肥胖、糖尿病等代謝類疾病的病人設(shè)計運動處方時，應(yīng)慎重考慮運動強度。

4 結(jié)論

本研究證實，糖尿病小鼠骨骼肌中促炎因子表達增加，抗炎因子表達減少，同時AMPK/SIRT1/NF-κ B炎癥信號通路被抑制，而長期耐力運動可抑制糖尿病小鼠骨骼肌中促炎因子的基因表達，促進抗炎因子的基因表達，且可能是通過AMPK/SIRT1/NF-κB炎癥信號通路來實現(xiàn)的。

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The Effect of Swimming Exercise on Inflammation via AMPK/SIRT1/NF-κB Signaling Pathway in the Skeletal Muscles of Diabetic Mice

ZHANG Tan1,2,CUI Di1,2,ZHANG Zhe1,2,SUN Yi1,2,DING Shu-zhe1,2

Objective: The purpose of the present study was to investigate the effect of endurance exercise on inflammatory factors and corresponding signaling pathways AMPK/SIRT1/NF-κB in the skeletal muscles of diabetic mice,hoping to provide new evidence for the prevention and treatment of obesity and diabetes from the perspective of inflammation of the skeletal muscle.Methods: The diabetic mice were established by feeding with high-fat diet for 4 weeks,and then injected with Streptozotocin.All the mice were randomly chosen and assigned to either control group (C,n=8) or exercise group (E,n=8),diabetic group (D,n=8) or diabetic exercise group (DE,n=8),Groups E and DE were then interfered with 6-week swimming exercise of moderate intensity,one hour per day,five days per week.RT-PCR was used to measure the mRNA expression of TNF-α,CCL2,IL-6,IL-10,AMPKα1,AMPKα2,SIRT1 and NF-κBp65.Western Blotting was used to measure the protein level of AMPK,p-AMPK,SIRT1,NF-кBp65 and AC-NF-кBp65.Results: 1) Compared with group C,the weight of mice in group D decreased significantly (P<0.01),meanwhile the fasting blood glucose increased significantly(P<0.01);Compared with group C,the weight of mice in group E decreased significantly(P<0.05);Compared with group D,the fasting blood glucose in group DE decreased significantly(P<0.05);Compared with group E,the weight of mice in group DE decreased significantly,while the fasting blood glucose increased significantly(P<0.01).2) Compared with group C,the IL-10 mRNA expression in group D was decreased significantly(P<0.01);while,the IL-6 mRNA expression in group E was increased significantly (P<0.05);Compared with group D,the TNF-α mRNA in group DE was decreased significantly(P<0.05),the IL-10 mRNA in group DE was increased significantly(P<0.01);Compared with group E,the IL-6 mRNA of group DE was decreased significantly(P<0.05).3) Compared with group C,the protein expression and activity of AMPK were decreased significantly(P<0.05) in group D,while the mRNA of NF-κBp65 was increased significantly(P<0.01) in group D;Compared with group D,the mRNA of AMPKα2 and SIRT1 were increased significantly(P<0.01) in group DE,the protein expression of AMPK、p-AMPK and the activity of AMPK were increased significantly(P<0.05),while the protein expression of NF-κBp65 was decreased significantly (P<0.01);Compared with group E,the mRNA of SIRT1 increased significantly (P<0.01).Conclusions: 6 weeks regular swimming exercise can promote the mRNA expression of anti-inflammatory factors,while the pro-inflammatory factors were repressed in skeletal muscles of diabetic mice.What’s more,exercise can reverse relieve the suppression of AMPK/SIRT1/NF-кB by diabetes.

enduranceexercise;diabetes;skeletalmuscle;inflammation;AMPK/SIRT1/NF-кB

1000-677X(2016)09-0040-08

10.16469/j.css.201609006

2015-12-10；

2016-08-22

國家自然科學(xué)基金資助項目(31671241)。

張?zhí)?1987-)，女，河南泌陽人，在讀博士研究生，主要研究方向為運動適應(yīng)與線粒體調(diào)控，E-mail：zhangtan9999@126.com；丁樹哲(1963-)，男，黑龍江望奎人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為運動適應(yīng)與線粒體調(diào)控，E-mail：szding@ied.ecnu.edu.cn。

1.華東師范大學(xué) 青少年健康評價與運動干預(yù)教育部重點實驗室，上海 200241；2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241 1.Key Laboratory of Adolescent Health Assessment and Exercise Intervention，Ministry of Education，East China Normal University，Shanghai 200241，China；2.East China Normal University，Shanghai 200241，China.

G804.7

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