超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雙黃連口服液中3種有效成分

劉雪紅，侯 穎，喬 穎，李 娜，宋 平，陳 玲，曲悠揚，張藝多

（遼寧省大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 大連 116037）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雙黃連口服液中3種有效成分

劉雪紅，侯 穎，喬 穎，李 娜，宋 平，陳 玲，曲悠揚，張藝多

（遼寧省大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧 大連 116037）

應(yīng)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時測定雙黃連口服液中3種有效成分（黃芩苷、綠原酸、連翹苷）的檢測方法。采用BEH C18色譜柱，以0.2%甲酸-乙腈作為流動相進行梯度洗脫。在ESI負離子模式下，通過多反應(yīng)監(jiān)測模式進行測定。黃芩苷、綠原酸、連翹苷的線性范圍分別為0.02～10 μg/mL（r=0.9991）、0.02～10 μg/mL（r=0.9998）、0.025～10 μg/mL（r=0.9996）。定量限分別為0.02 mg/kg、0.02 mg/kg、0.025 mg/kg。3種成分的回收率為98%～101.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.5%。該法快捷、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于雙黃連口服液中的3種有效成分含量的同時測定。

雙黃連口服液；黃芩苷；綠原酸；連翹苷；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

雙黃連口服液是由金銀花、黃芩、連翹3種清熱中藥制備而成的合劑，具有辛涼解表、清熱解毒功效[1]。其中黃芩苷、綠原酸、連翹苷是其主要活性成分。中華人民共和國獸藥典（2010年版）中規(guī)定，質(zhì)控成分分別采取3種不同的H PLC色譜條件檢測，供試品溶液制備方法繁瑣。目前，已有文獻報道以

高效液相色譜法同時測定黃芩苷、綠原酸、連翹苷的含量[2-3]。另有文獻報道在雙黃連的其他制劑（膠囊、粉針劑等）中利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同時測定此3種成分[4-6]。本文采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了同時測定雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷3種有效成分含量的方法。該方法簡便、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好。

1 試驗材料

1.1 儀器與設(shè)備電子天平RD-200，德國Sartorius公司；超聲波清洗機KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；XEVO TQ-S ACQUITY UPLC 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配置電噴霧離子源，美國Waters公司；色譜柱BEH C18 2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters公司。

1.2 試劑 乙腈、甲酸、甲醇、均為色譜純；水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。

1.3 對照品 黃芩苷（批號110715-201318，含量93.3%）、綠原酸（批號 110753-201314，含量96.6%）、連翹苷（批號 110821-201213，含量95.3%），均購置于中國食品藥品檢定研究院。

1.4 供試品 雙黃連口服液，A公司，批號20131109、20140121；B公司，批號1409091；C公司，批號201312103、201409015。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備液的配制 準(zhǔn)確稱取黃芩苷、綠原酸、連翹苷對照品各25 m g，50%甲醇定容至25 mL，混勻，即為1 000 μg/mL的對照品貯備液；有效期為3個月。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取供試品1 mL，置100 mL容量瓶中，加入30 mL 50%甲醇，超聲5 min，定容至100 mL；精密量取1 mL，加 0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液，定容至100 mL，過0.22 μm濾膜后，上機待測。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制 分別精密量取對照品貯備液適量，以0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.02、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的黃芩苷系列溶液；質(zhì)量濃度為0.02、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的綠原酸系列溶液；質(zhì)量濃度為0.025、0.10、0.50、2.50、10.00 μg/mL的連翹苷系列溶液。

2.2 液相色譜條件 柱溫：30℃，進樣量：5 μL，流動相：乙腈、0.2%甲酸，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Program of gradient elution

2.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式：負離子，檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測，霧化器壓力：0.7 M Pa，干燥氣流量：850 L/h，干燥氣溫度：550℃，毛細管電壓：3 000 V。定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2，二級質(zhì)譜見圖1。

表2 3種對照品的質(zhì)譜分析參數(shù)Table2 MS/MS parameters of the three standards

圖1 3種成分對照品的二級質(zhì)譜Fig.1 Two stage mass spactraof three standards

2.4 線性關(guān)系與檢測限 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程和相關(guān)系數(shù)，見表3。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測限，信躁比S/ N＞10為定量限，得到3種對照品的檢測限和定量限，見表3。

表3 3種對照品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測限及定量限Table3 Regression equations、 linear ranges、correlation coefficients、detection limits、quantification limits of the three standards

對照品和供試品溶液的特征離子質(zhì)量色譜圖見圖2。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（A公司，批號20131109），分別存放0、4、8、12、16、24 h后測定，記錄峰面積，測得綠原酸、連翹苷和黃芩苷含量的RSD均小于2.3%，結(jié)果表明，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗 精密量取同一批號供試品（A公司，批號20131109）6份，按2.1.2準(zhǔn)備測試液，分別進樣5 μL，記錄峰面積，測得綠原酸、連翹苷和黃芩苷含量的RSD分別為2.5%、2.1%和2.0%，表明該方法的重復(fù)性較好。

圖2 對照品和雙黃連口服液樣品的特征離子質(zhì)量色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of standardh and sample

表4 回收率試驗結(jié)果（n=3）Table4 Results of recovery

2.7 回收率試驗 采用加標(biāo)法進行回收率的考察。精密量取供試品（A公司，批號20131109）1 mL共9份，3份為一組，以3個不同質(zhì)量濃度分別加入對照品溶液，按2.1.2準(zhǔn)備測試液，分別進行測定，計算回收率，3種成分的平均回收率見表4。從表中試驗結(jié)果可以看出3種藥物的添加回收率在98%～101.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2.5%。

2.8 樣品測定 取不同批號供試品，按所建立的方法進行處理和測定，外標(biāo)法計算。同時與采用中國獸藥典2010年版二部收載的高效液相色譜法測定的結(jié)果進行比較，2種方法測定結(jié)果基本一致，見表5。

表5 2種方法含量測定結(jié)果比較Table5 Determination results of comparision of the two methods

3 討論

3.1 進樣溶液的選擇 比較0.2%甲酸-乙腈（90:10）溶液、50%甲醇為進樣溶液。采用0.2%甲酸-乙腈（90:10）為進樣溶液時，3種化合物峰形對稱而尖銳。以50%甲醇為進樣溶液，綠原酸的峰展寬，且與樣品中雜質(zhì)分離不好。最終確定0.2%甲酸-乙腈（90:10）作為進樣溶液。

3.2 色譜條件的選擇 對比以甲醇-水及乙腈-水為流動相的分離效果，甲醇-水作流動相時綠原酸的峰展較寬。流動相的酸度能影響黃芩苷色譜峰的拖尾因子，在乙腈-水流動相中加入0.2%甲酸，3種化合物的峰形均較理想。故試驗選擇乙腈-0.2%甲酸作為流動相。同時優(yōu)化了梯度洗脫程序，得到了分離度以及對稱因子均較好的峰形。

3.3 離子模式的選擇 試驗發(fā)現(xiàn)，黃芩苷在正離子模式下響應(yīng)很高，而連翹苷在此條件下響應(yīng)很低；連翹苷在負離子模式下響應(yīng)值高于正離子模式。二者保留時間接近，若在短時間內(nèi)切換離子監(jiān)測模式，可能引起響應(yīng)信號不穩(wěn)定，影響測定。黃芩苷在雙黃連口服液中的含量較高，采用負離子模式雖然降低其檢測的靈敏度，但不影響其測定的準(zhǔn)確度和重復(fù)性，因此采用負離子模式。

本試驗建立的 UPLC-M S-M S法，簡單、準(zhǔn)確、分析周期短，適用于雙黃連口服液中3種活性成分的含量測定。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典（二部）[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010年版.

[2]杜英峰，張?zhí)m桐，靳怡然.多波長RP-H PLC法測定雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷[J].中成藥，2009，31（9）：1368-1371．

[3]賀國彬，李津明，趙金鳳，等.H PLC法同時測定雙黃連口服液中的質(zhì)控成分含量[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，26（1）：972-974.

[4]羅奇志，羅佳波.雙黃連粉針中化學(xué)成分的高效液相色譜-電噴霧串級質(zhì)譜分析[J].中成藥，2009，31（9）：1402-1404.

[5]張紅偉，盛靜，陳偉光，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時測定雙黃連膠囊中的3種有效成分[J].海峽藥學(xué)，2012，24（6）：36-39.

[6]許海棠，黃麗涵，徐遠金.高效液相色譜.質(zhì)譜法同時測定清熱解毒口服液中的5種有效成分[J].色譜，2008，26（5）：599-602.

Detection of three effective components in Shuanghuanglian Oral Liquid by UPLC-MS-MS

Liu Xuehong,Hou Ying,Qiao Ying,Li Na,Song Ping, Chen Ling,Qu Youyang,Zhang Yi duo
(Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control, Liaoning Dalian 116037)

A method of UPLC- MS/MS was developed to determine three effective components (Baicalin;Chlorogenic acid;Forsythin) in Shuanghuanglian Oral Liquid. BEH C18 column was used as separationcolumn. The mobile phase was 0.2% formic acid solution and acetonitrile for gradient elution. Then the processed sample was analyzed by tandem mass spectrometer with negative electrosprayionization (ESI) source,monitored under a multiple reaction monitoring (MRM) mode.The linearranges were 0.02～10 μg/mL (r=0.9991)、0.02～10 μg/mL (r=0.9998)、0.025～10 μg/mL (r=0.9996)for chlorogenic acid, baicalin and forsythin and the limit of quantification were 0.02 mg/kg、0.02 mg/kg、0.025 mg/kg, respectively. The average recorvery was 98% ～101.7% and RSD were bothless than 2.5%. The method was accurate, sensitive, rapid and suitable for the quality control ofthe three effective components in shuanghuanglian oral liquid.

Shuanghuanglian Oral Liquid; Baicalin; Chlorogenic acid; Forsythin; Ultra-HPLC-MS-MS

TQ460.72

B

1672-9692(2016)03-0013-05

2016-02-01

劉雪紅（1975-），本科，副主任藥師，從事獸藥及獸藥殘留的檢驗工作。