雞傳染性喉氣管炎病毒PCR檢測方式的建立和應(yīng)用

李海利，易秀玲，郎利敏，徐引弟，焦文強(qiáng)，張立憲，張青嫻，游 一，王克領(lǐng)?，李 奎

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

雞傳染性喉氣管炎病毒PCR檢測方式的建立和應(yīng)用

李海利1，易秀玲2，郎利敏1，徐引弟1，焦文強(qiáng)1，張立憲1，張青嫻1，游 一1，王克領(lǐng)1?，李 奎2

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

根據(jù)GenBank傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）基因序列，設(shè)計(jì)合成了1對特異性引物。以ILTV DNA為模板，建立了檢測ILTV的PCR檢測方法。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，成功擴(kuò)增出一條約690 bp的目的基因片段。而雞傳染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽流感病毒基因組均未擴(kuò)增為出相應(yīng)的片段。敏感性試驗(yàn)檢測出其DNA最小檢出量為10-2μg。重復(fù)性試驗(yàn)中對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)檢測的結(jié)果完全一致。臨床應(yīng)用中運(yùn)用上述優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測臨床送檢的16份疑似雞傳染性喉氣管炎病毒感染病料，結(jié)果顯示檢出陽性樣品6份，將陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后序列分析顯示均為雞傳染性喉氣管炎病毒。結(jié)果表明，建立的PCR方法具有良好的特異性，敏感性和穩(wěn)定性，可應(yīng)用于傳染性喉氣管炎病毒鑒定和臨床診斷。

雞傳染性喉氣管炎病毒；PCR；檢測

雞傳染性喉氣管炎（AILT）是由傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus， ILTV）引起的一種急性、接觸性上呼吸道傳染病[1-6]，該病傳播快速，自1925年在美國洛島發(fā)現(xiàn)該病以來，現(xiàn)已遍及世界各地養(yǎng)雞區(qū)域[7-13]。該病的主要病變在喉部和氣管組織，臨床特征為呼吸困難、咳嗽、咳出帶血樣的滲出物[14]。易感雞群一旦感染此病，傳播迅速，感染率達(dá)90%以上，病死率平均在10%～20%[15]，蛋雞感染后產(chǎn)蛋量下降，給養(yǎng)雞業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。

該病的臨診癥狀和病理變化易與其他病毒引起的疾病如傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitisvirus， IBV）、新城疫病毒（newcastledisease virus，NDV）等相混淆，容易發(fā)生誤診，給臨床診斷帶來一定的困難，因此需要借助實(shí)驗(yàn)室方法加以確診。常規(guī)檢測ILT的方法有瓊脂凝膠免疫沉淀法、病原分離鑒定、血清中和試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，這些方法雖然經(jīng)典，但缺點(diǎn)是費(fèi)時且敏感性差，不能檢測亞臨床感染。而PCR技術(shù)具有快速、便捷、敏感性和特異性高等特點(diǎn)，目前在病毒檢測方面得到廣泛的應(yīng)用[16]。因此，本研究利用PCR技術(shù)，經(jīng)過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立更為快速、特異、敏感的PCR診斷方法，適用于臨床ILTV的檢測和早期診斷，是有效控制該病的發(fā)生及傳播的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 病毒 傳染性喉氣管炎病毒（infectious laryngotracheitisvirus，ILTV）、雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus， IBDV）、新城疫病毒（newcastle disease viru，NDV）、傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitisvirus，IBV）、禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV）均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.2 主要試劑Ex Taq、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶及其他限制性內(nèi)切酶、病毒基因組DNA 提取試劑盒、E.Z.N.Z.plasmid miniprep Kit I 質(zhì)粒提取試劑盒與膠回收試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中注冊的ILTV的基因序列，設(shè)計(jì)一對引物，并由上海生物工程有限公司合成。上游引物 5’-CTTCAGACTCCAGCTCATCTG-3’,下 游 引 物 5’-CATCGGGACATTCTCCAGGTAGCA-3’。

1.4 病毒基因組DN ADN A的提取 按照DN A提取試劑盒進(jìn)行操作，提取的DN A保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCRPCR反應(yīng)

1.5.1 PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1.1 最適模板用量的確立 分別取1、2、3、4、5、6 μL DN A為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最佳的模板用量。

1.5.1.2 最適引物用量的確立 在50 μL的 PCR反應(yīng)體系中分別加入不同用量的引物，上、下游引物（20 μm ol/μL）分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、1.0和1.2 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最佳的引物用量。

1.5.1.3 最適退火溫度的確立 PCR反應(yīng)的退火溫度分別取51、53、55、57和59℃，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最佳的退火溫度。

1.5.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR反應(yīng)按50 μL體系進(jìn)行，根據(jù)上面試驗(yàn)確定的最適模板用量為5 μL，最佳的引物用量為1 μL，最佳的退火溫度為55℃，確定PCR的反應(yīng)體系為Ex Taq（5 U/μL）1 μL，10× Ex Taq Buffer 5 μL，dN TP（2.5 mm ol/L）5 μL， ILTf和 ILTr（20 μm ol/μL）各1 μL，DN A 5 μL，加 DEPC水至50 μL。PCR反應(yīng)條件是：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察結(jié)果。

1.6 PCRPCR特異性試驗(yàn) 分別取同體積的ILTV、IB-DV、N DV、IBV、AIV樣品提取基因組DN A（或RN A），用已經(jīng)建立的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.7 PCRPCR敏感性試驗(yàn) 將提取的雞傳染性喉氣管炎病毒DN A定量，依次10倍稀釋，使其為10 μg，1 μg，10-1μg，10-2μg，10-3μg，10-4μg，10-5μg，1 pg，10-1pg，10-2pg，10-3pg，10-4pg，10-5pg，10-6pg，10-7pg，10-8pg，10-9pg的DN A含量，在優(yōu)化后的體系作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定其敏感性。

1.8 PCRPCR重復(fù)性試驗(yàn) 用建立的PCR檢測方法，用建立的PCR檢測方法對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料和3份陰性病料，重復(fù)檢測3次，對本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。

1.9 臨床應(yīng)用 利用建立的PCR檢測方法檢測臨床送檢的疑似病料16份，抽提DN A，按照上述優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測，同時設(shè)雞傳染性喉氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)品DN A作為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測及鑒定 電泳結(jié)果顯示，本PCR體系可擴(kuò)增出一條約690 bp的ILTV基因片段，擴(kuò)增的基因片段大小與預(yù)期一致（圖1）。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR pruducts

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果 利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物,該體系以ILTV、IBDV、N DV、IBV、AIV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有ILTV能擴(kuò)增出690 bp左右的特異性條帶，而其他均未擴(kuò)增出目的條帶，證明了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性（圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 將模板DN A作l 0倍系列稀釋，取不同稀釋度的模板DN A分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果10-2μg稀釋濃度的模板仍能擴(kuò)增出690 bp目的片段，而10-3μg稀釋的模板不能擴(kuò)增出條帶。說明引物的PCR檢測靈敏度可達(dá)10-2μg DN A（圖3）。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 用建立的PCR檢測方法對3份檢測為傳染性喉氣管炎病毒陽性病料進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3次重復(fù)檢測的結(jié)果完全一致，說明本次PCR檢測方法的良好的穩(wěn)定性。

2.5 臨床應(yīng)用 運(yùn)用上述優(yōu)化的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測臨床送檢的16份疑似雞傳染性喉氣管炎病毒感染病料，結(jié)果顯示檢出陽性樣品6份，將陽性樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆后序列分析顯示均為雞傳染性喉氣管炎病毒（圖4）。

3 討論

圖2 PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The specific test results of PCR

圖3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of PCR

圖4 臨床樣品的PCR檢測結(jié)果Fig.4 The result of clinical samples detected by PCR

PCR是一個比較復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)，會受到多種因素的影響[17-25]。首先，引物的選擇是影響PCR成功與否的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)根據(jù)Gen-Bank公布ILTV基因序列，設(shè)計(jì)并合成了一對引物，以ILTV DN A為模板通過PCR擴(kuò)增出一段長690 bp的ILTV目的基因片段，經(jīng)過測序發(fā)現(xiàn)與預(yù)期的基因片段一致。該體系又以IBDV、N DV、IBV、AIV為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增而均未擴(kuò)增出目的條帶，證明了擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，對其敏感性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，以該對引物建立的PCR檢測方法的最低檢出量達(dá)到10-2μg。與傳統(tǒng)檢測方法相比，更加證明了PCR在檢測ILTV上的敏感性，同樣可以用于潛伏感染的ILTV檢測。PCR法除可用于臨床樣品的ILTV檢測和ILTV疾病的診斷外，還可用于檢測疫苗是否有ILTV的污染[26-28]。同時，在臨床應(yīng)用中，本研究所建立的PCR快速診斷方法，更有利于對雞傳染性喉氣管炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查、臨床檢測和疾病早期診斷。

目前，診斷ILTV主要用瓊脂凝膠免疫沉淀法（AGID）、免疫熒光（FA）、病毒分離（VI）、血清中和試驗(yàn)（SN）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。但這些方法都比較繁瑣，敏感性或特異性較差[29]。該P(yáng)CR檢測體系以感染組織的DN A為模板，不須提純病毒。而且PCR分析對樣品的要求不嚴(yán)格，對于采樣不及時或樣品保存時間較長，對檢測結(jié)果影響均較小[30]，可在數(shù)小時內(nèi)完成檢測工作。綜上所述，PCR檢測方法因其簡單迅速，敏感性和特異性高的特點(diǎn)，將在當(dāng)前檢測技術(shù)中發(fā)揮更加重要的作用。

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2016年《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》雜志征訂啟事

《現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)》雜志創(chuàng)刊于1972年，月刊。郵發(fā)代號8-75，國內(nèi)刊號CN 21-1515/S，國際刊號ISSN 1672-9692。雜志內(nèi)容豐富、品質(zhì)卓越、裝幀精美、品位時尚，深受行業(yè)人喜愛。歡迎廣大讀者訂閱，如錯過郵局訂閱時間，可直接與本刊聯(lián)系。

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Establishment and Application of Polymerase Chain Reaction for Infectious Laryngotracheitis Virus

Li Hai li1,Yi Xiuling2,Lang Li min1,Xu Yindi1,Jiao Wenqiang1,Zhang Lixian1, Zhang Qingxian1,You Yi1,Wang Keling1*,Li Kui2
(1. Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, HenanZhengzhou 450002;2. College of animal husbandry and medical engineering, Henan Agricultural University, Henan Zhengzhou450002)

According to the gene sequence of Infectious Laryngotracheitis Virus (ILTV) that publishedin GenBank, the experiment designed and synthesized a pair of specific primers. Using thegenomic DNA of ILTV as a template, a PCR method was established for the detection of ILTV gene.By optimizing PCR reaction conditions, a 690 bp fragment was amplified from the genome of ILTV,but not from IBDV, NDV , IBV and AIV. The sensitivity test showed that the minimum detectableamount of its DNA was 10- 2 μg. The Repeatability test detected3 copies of testing positive forInfectious Laryngotracheitis Virus and showed the same results. Using the optimized PCR reactionconditions in the clinical application for detecting 16 samples which were Suspected that infect-IBedwith Infectious Laryngotracheitis Virus, the testing results showed 6 positive samples. Afteringcloning and analyzing sequence of the positive samples’PCR amplification product, it showedthat all infected with Infectious Laryngotracheitis Virus. The results indicated that the PCRmethod has good specificity, sensitivity and stability, and can be used for the detection of ILTV.

Infectious Laryngotracheitis Virus; PCR; Detection

2.65

B

1672-9692(2016)03-0001-07

2016-01-20

李海利（1982-），男，河南省開封人，助理研究員，博士，主要從事動物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

王克領(lǐng)（1964-），男，河南柘城人，本科，副研究員，主要從事獸醫(yī)傳染病防控研究工作。

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金。