頭穴透刺對(duì)腦梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA、Ca2+影響研究

桑鵬 王順 趙佳輝

頭穴透刺對(duì)腦梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA、Ca2+影響研究

桑鵬 王順 趙佳輝

目的 觀察頭穴透刺對(duì)腦梗死大鼠NO、PKA、PDGFR-β、Ca2+的影響。方法 運(yùn)用線栓方法制作腦梗死的大鼠模型，對(duì)模型大鼠行頭穴透刺及一般針刺，藥物治療；14 d后檢測大鼠PDGFR-β、PKA及NO、Ca2+的變化。結(jié)果 頭穴透刺明顯提升大鼠PDGFR-β、PKA的表達(dá)；降低NO含量、升高Ca2+離子含量。頭穴透刺組的治療效果優(yōu)于其他兩組。結(jié)論 與其他兩組比較，頭穴透刺明顯提升大鼠PDGFR-β、PKA的表達(dá)；降低NO含量、升高Ca2+離子含量，對(duì)腦保護(hù)作用效果顯著。

腦梗死；頭穴透刺；NO；PKA；PDGFR-β；Ca2+

腦梗死的發(fā)病率、患病率和死亡率隨年齡增加而增加，給患者的家庭、社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。針刺治療腦梗死在臨床上療效顯著，但很少有作用機(jī)制研究。為提高患者臨床療效，進(jìn)一步闡明針灸治療腦梗死機(jī)制，本研究采用不同治療針灸方法腦梗死病例。同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究觀察腦梗死大鼠PDGFR-β、NO、PKA及Ca2+的變化，為針灸治療腦梗死患者提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 模型

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

150只大鼠參照隨機(jī)對(duì)照表分為頭穴透刺組，一般針刺組，藥物注射組。

1.2 模型復(fù)制

線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈梗死的模型[1]。大鼠腹腔麻醉，分離出大鼠的頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉CCA和ICA，魚線經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉的膨大處切口插入頸內(nèi)動(dòng)脈，魚線插入完成后和頸內(nèi)動(dòng)脈一起結(jié)扎，取下動(dòng)脈夾。縫合完成2小時(shí)后將魚線拔出，魚線球端退至頸總動(dòng)脈，實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.3 模型成功標(biāo)志

造模成功后大鼠同側(cè)的Horner征和大鼠對(duì)側(cè)前肢為重的偏癱。

1.4 模型評(píng)估

大鼠清醒后對(duì)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分，0分：未能發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)損傷的癥狀；1分：大鼠對(duì)側(cè)前爪完全伸直受限；2分：大鼠只能向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：大鼠會(huì)向?qū)?cè)傾倒；4分：大鼠意識(shí)喪失及無法自主活動(dòng)。

2 方法

頭穴透刺組：選穴：百會(huì)透雙側(cè)曲鬢，前神聰透向雙側(cè)懸厘；患側(cè)上肢的曲池、手三里、外關(guān)、合谷及患側(cè)下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交。得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當(dāng)刺激。每日刺激1次，7 d為1療程，共治療2個(gè)療程。

一般針刺組：選穴：患側(cè)上肢的曲池、手三里、外關(guān)、合谷及患側(cè)下肢陽陵泉、豐隆、足三里、三陰交；得氣后上述穴位選用G-6805型電針儀給予適當(dāng)刺激。每日刺激1次，7 d為1療程，共治療2個(gè)療程。上述電針儀均為青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司準(zhǔn)字2000第2270088號(hào)電針儀。

藥物注射組：腦蛋白水解物注射液（曲奧）30 ml（三聯(lián)藥業(yè)有限公司，國藥H20051202），每日注射1次，7 d為1療程，共治療2個(gè)療程。

3 指標(biāo)檢測

3.1 PDGFR-β的檢測

本實(shí)驗(yàn)使用的染色試劑是辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素?；静襟E：組織進(jìn)行石蠟切片，將切好并用福爾馬林固定的組織切片在常溫中靜置1 h，進(jìn)行脫蠟致水化，再用蒸餾水沖洗；3%甲醇—過氧化氫室溫孵育8 min左右，用來減少過氧化物酶的活性，pH 7.2左右的PBS緩沖劑清洗6 min；使用微波抗原修復(fù)，鏈霉菌抗生物素蛋白過氧化物酶復(fù)合物在37℃孵育10 min，PBS洗4 min；DAB顯色液顯色，用自來水沖洗來終止反應(yīng)；蘇木精再復(fù)染，脫水，透明，封片。用PBS來代替一抗作為陰性對(duì)照組。

3.2 PKA蛋白活性表達(dá)（westernblot法）

組織中蛋白的提取步驟：第一步SDS-PAGE電泳。第二步電轉(zhuǎn)印，從電傳印正極通過濾紙、NC膜到達(dá)電傳印負(fù)極。第三步去離子水多次清洗NC膜后浸入麗春紅S染色液，鉛筆標(biāo)出蛋白質(zhì)Marker位置，多次浸泡至NC膜顏色褪去。第四步加入封閉液室溫下2 h。每間隔10 min清洗1次NC膜，反復(fù)3次清洗；繼續(xù)室溫下靜置2 h。再每間隔10 min清洗1次NC膜，反復(fù)3次清洗，

加入無磷酸鹽封閉液，用去離子水洗滌終止反應(yīng)。

3.3 NO、Ca2+的檢測

依照次序?qū)尤?00 μl的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔；標(biāo)準(zhǔn)品孔中和樣品孔中加入50μl的酶標(biāo)記溶液，液體充分混勻，保險(xiǎn)膜密封酶標(biāo)板，37℃的水浴鍋中水浴60 min；加入底物A 50μl，移液器反復(fù)吸打混勻。微孔中加入50 μl的終止液，移液器混勻，在TECAMGENIOS酶標(biāo)儀上，450 nm處測定OD，根據(jù)制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，組間、組內(nèi)比較均用q檢驗(yàn)。

5 結(jié)果

5.1 三組治療前后PKA含量變化分析

治療后，頭穴透刺組、藥物治療組、一般針刺組PKA含量均增加，與治療前比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療2個(gè)療程后，頭穴透刺組PKA含量高于一般針刺組與藥物注射治療組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

5.2 三組PDGFR-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分析

治療2個(gè)療程后，頭穴透刺組PDGFR-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)均高于藥物治療組、一般針刺組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。加表2。

5.3 三組NO含量變化分析

頭穴透刺組NO含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藥物治療組、一般針刺組NO含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療14 d后，頭穴透刺組與一般針刺組，藥物注射治療組對(duì)比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。加表3。

5.4 三組血漿Ca2+含量變化分析

頭穴透刺組Ca2+含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藥物治療組、一般針刺組Ca2+含量變化治療前后比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療14 d后，頭穴透刺組與一般針刺組，藥物注射治療組對(duì)比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。加表4。

表1 三組PKA含量變化（±s）

表1 三組PKA含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療2個(gè)療程后，與藥物治療組、一般針刺組對(duì)比，#P＜0.01

組別 治療前（mmol/L） 1療程后（mmol/L） 2療程后（mmol/L）頭穴透刺組 51.66±0.21 82.77±0.19△# 103.48±1.36△#藥物治療組 51.97±0.30 62.28±0.18▲ 73.34±0.34▲一般針刺組 51.85±0.19 72.25±0.21▲ 90.30±2.27▲

表2 三組PDGFR-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）

表2 三組PDGFR-β陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)（±s）

注：治療2個(gè)療程后，與藥物治療組、一般針刺組對(duì)比，#P＜0.01

組別PDGF-β陽性細(xì)胞頭穴透刺組 7.54±2.51#藥物治療組 5.32±1.34一般針刺組 6.34±1.87

表3 三組NO含量變化（±s）

表3 三組NO含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療14 d后，與藥物治療組、一般針刺組對(duì)比，#P＜0.01

組別 治療前（μmol/L） 治療后7 d（μmol/L） 治療后14 d（μmol/L）頭穴透刺組 82.99±14.61 48.13±10.32△# 32.47±10.05△#藥物治療組 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲一般針刺組 80.62±18.53 62.67±15.73▲ 48.86±15.52▲

表4 三組血漿Ca2+含量變化（±s）

表4 三組血漿Ca2+含量變化（±s）

注：與治療前比較，△P＜0.01；藥物治療組、一般針刺組治療后與治療前比較，▲P＜0.05；治療14 d后，與藥物治療組、一般針刺組對(duì)比，#P＜0.01

組別 治療前（mmol/L） 治療后7 d（mmol/L） 治療后14 d（mmol/L）頭穴透刺組 1.86±0.11 2.77±0.19△# 2.98±0.27△#藥物治療組 1.87±0.20 2.28±0.18▲ 2.38±0.23▲一般針刺組 1.88±0.12 2.25±0.21▲ 2.51±0.18▲

6 討論

PDGF促進(jìn)鄰近的細(xì)胞生長，結(jié)合受體后作用于細(xì)胞介質(zhì)，對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞具有促有絲分裂和趨化的作用[1]，PDGF最初從血小板中發(fā)現(xiàn)，參與血管內(nèi)膜的重建，加速組織創(chuàng)傷修復(fù)。提高GABA能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的有效利用率。論證了頭穴透刺對(duì)腦梗死后神經(jīng)恢復(fù)的功能，PDGFR-β表達(dá)和PDGF的功能密切相關(guān)[2]。

NO維持血管張力從而舒張血管，對(duì)血壓的高低、血流分布、抑制血小板聚集、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化及改善代謝有重要的意義，是活躍的血液調(diào)節(jié)因子[3]。頭部透穴組NO含量明顯降低，說明頭部透穴可減少NO含量，增加腦部血管灌注，有利于腦神經(jīng)的修復(fù)。

PKA的作用底物有離子通道、結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白等轉(zhuǎn)錄因子[4]，

含有不同種亞型。興奮時(shí)突觸前神經(jīng)末梢釋放遞質(zhì)，突觸后膜上的相應(yīng)受體得到激活，釋放cAMP激活PKA，從而膜對(duì)離子的通透性得到改變[5]，PKA進(jìn)入核內(nèi)更便利。頭穴透刺治療后，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，cAMP濃度上升，激活PKA-CREB提高神經(jīng)再生的功效[6]。

2個(gè)療程后，頭針透穴組的模型大鼠Ca2+濃度升高，論證了降低NO為代表的氧自由基水平可以保護(hù)腦神經(jīng)[7]。PKA受體損傷和鈣離子含量的升高受阻，降低了神經(jīng)損害，增加神經(jīng)相關(guān)功能的恢復(fù)[8]。該試驗(yàn)采用分三組進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)：三組治療對(duì)腦梗死均有療效，頭針透穴組治療效果優(yōu)于其他兩組，提供頭穴透刺對(duì)腦梗死患者的治療療效實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

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The Effect of Scalp Acupuncture on PDGFR-β, NO, PKA, Ca2+in Rats With Cerebral Infarction

SANG Peng WANG Shun ZHAO Jiahui Department of Acupuncture, Heilongjiang Academy of Traditional Chinese Medicine, Harbin Heilongjiang 150001, China

Objective The Effect of scalp penetration acupuncture on NO, PKA, PDGFR-β, Ca2+in rats with cerebral infarction. Methods Using suture-occluded method in the rats medels With cerebral infarction. Scalp penetration acupuncture, general acupuncture and medication in rats. Detecting the change of PDGFR-β, PKA, NO, Ca2+in rats after two of treatment courses. Results Scalp penetration acupuncture significantly improve PDGFR-β, PKA expression and increase Ca2+ion content. At the same time reduce NO content. The therapeutic effect of scalp penetration acupuncture group is better than the other two groups. Conclusion Scalp penetration acupuncture group Compared with the other two groups has the best effect on brain protection

Cerebral infarction, Scalp acupuncture, NO, PKA, PDGF-β, Ca2+

R246.6

A

1674-9308（2016）32-0221-03

10.3969/j.issn.1674-9308.2016.32.125

黑龍江省中青年攻關(guān)項(xiàng)目 ZQG009

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院針灸科，黑龍江 哈爾濱 150001