MT-3通過激活NF-κB信號通路抑制食管癌病理進展

王海軍，陸欣，張彥芬，劉聚良，韓永強

（河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院1.胸外科，2.血液科，河北 邢臺 054001）

論著

MT-3通過激活NF-κB信號通路抑制食管癌病理進展

王海軍1，陸欣2，張彥芬1，劉聚良1，韓永強1

（河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院1.胸外科，2.血液科，河北 邢臺 054001）

目的食管癌的發(fā)生與多種基因突變相關，基因的表達異常產(chǎn)生腫瘤，本文集中探討食管癌的發(fā)生發(fā)展機制。方法選取河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院2009年7月-2011年2月腫瘤科食管癌患者92例。選取其腫瘤組織及其癌旁組織樣本，檢測金屬硫蛋白3（MT-3）在食管癌組織和其癌旁組織中的表達，在食管癌細胞系中構建過表達MT-3和低表達MT-3的細胞系，檢測這些MT-3表達不同時，NF-κB信號通路在其中是否處于激活狀態(tài)。采用Western blot檢測P65、pP65蛋白的表達，免疫熒光檢測pP65是否在MT-3過表達時有入核表達。結果定量聚合酶鏈反應（qPCR）結果顯示食管癌腫瘤組織中MT-3的表達高于癌旁組織（P=0.001）。通過qPCR檢測構建的高表達和低表達MT-3的食管癌細胞系均成功構建，進而檢測P65、pP65，顯示在過表達MT-3時，pP65蛋白表達增多，低表達MT-3時pP65蛋白表達減少，P65則顯現(xiàn)出相反的結果，且表達均有統(tǒng)計學意義，所以認為MT-3高表達時NF-κB信號激活。免疫熒光檢測高表達MT-3的食管癌細胞時，細胞核入核明顯增多，進一步說明MT-3激活了NF-κB信號通路。結論MT-3在食管癌中通過激活NF-κB信號通路進而抑制食管癌的病理進程。

MT-3；NF-κB；信號通路；食管癌

食管癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，涉及一系列的生理變化，包括細胞凋亡、增殖、轉移及侵襲的異常。正常生理條件下，細胞內乙酰化與去乙?；教幱趧討B(tài)平衡，而在多種腫瘤中金屬硫蛋白3（metallothionein 3，MT-3）活性異常，被募集結合在特定的啟動子區(qū)，導致一系列基因的轉錄抑制，涉及細胞增殖、分化、遷移、侵襲轉移等相關基因[1-3]。MT-3是一類調節(jié)基因轉錄因子的酶。MT-3是與腫瘤關系最為密切的一種基因，可作用于相應的組蛋白而調節(jié)基因轉錄[4]。文獻[5-6]證實腫瘤細胞中MT-3的缺失能使腫瘤細胞周期阻滯在G1期或G2/M期，導致有絲分裂細胞的丟失，細胞生長抑制，及凋亡細胞比例的增加。充分說明了MT-3的表達與腫瘤細胞周期、細胞增殖及凋亡密切相關。

其中MT-3基因定位于人6號染色體，可抑制細胞Cyclin-CDK復合物或細胞增殖抗原的活性，當MT-3蛋白表達的升高，阻止了CyclinD1與CDK4結合，使細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞的增殖[7-8]。研究已證實MT-3作為細胞周期負性調控因子，與食管癌細胞增生、轉移有關，并且具有良好的預后價值。NF-κB是一個與炎癥相關的信號通路，有人報道腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由炎癥慢慢演化而成的，炎癥的發(fā)生導致機體很多基因表達異常，進而進一步激活相關信號通路[9-10]。很多腫瘤疾病的發(fā)生都與NF-κB信號通路密切相關。主要通過外源性的因素導致P65入核增多，進而發(fā)生細胞核的磷酸化，激活該信號通路，促進炎癥的發(fā)生，進一步影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

但是MT-3在食管癌中的表達及其發(fā)生機制還需更進一步的研究，本研究擬探討MT-3在食管癌中的發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集河北醫(yī)科大學附屬邢臺人民醫(yī)院2009年7月-2011年2月腫瘤科食管癌患者92例作為研究對象。取患者腫瘤組織和癌旁組織。所有患者臨床資料完整，包括一般情況、病理診斷、腫瘤分期、治療方式和生存狀況等，有較為完整的隨訪資料完整，患者各類臨床資料均保存良好。

1.2 定量聚合酶鏈反應（qPCR）

逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，等量組織，加入同等比例的Trizol，12 000 r/min，4℃離心10 min；吸取上清液至一新的EP管中，靜置5 min，裂解充分；加入200μl氯仿，振蕩器上震蕩15 s，放置3 min；12 000 r/min，4℃離心15 min，離心完成后分為3層，取最上層（中間一層為蛋白）至一新的EP管中，在吸取的最上層EP管中加入等體積異丙醇，4℃進行，來回顛倒數(shù)次，室溫沉淀10 min；12 000 r/min，4℃離心10 min，棄去上清液；加入75%乙醇（DEPC水溶解），混勻液體；7 500 r/min，4℃5 min，棄上清液，小心吸盡液體（此時可以看到白色沉淀即為RNA）；RNA略干后加入20μl DEPC水。用核酸染料法進行實時熒光定量PCR檢測MT-3在食管癌中的表達研究。引物序列為：MT-3，正向：GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT，反向：UACU UUGGACAUGACCGGCTT；GAPDH，正向：GCCCTGA GGGCCCGAACTGTTACT，反向：CAGACGCACGGCT TTGACCTTCTT。反應程序為：預變性95℃，10 min；循環(huán)中變性95℃，30 s；退火55℃，30 s延伸72℃，30秒，反應40個循環(huán)，融解曲線分析。

1.3 穩(wěn)定轉染過表達和低表達的MT-3的食管癌細胞株

將處于對數(shù)期的TE-1細胞（購自于ATCC）種于6孔板中，保證每孔細胞量約為3×105，lipo 2000加入5μl用100μl無血清培養(yǎng)基混勻，靜置5 min，同時高表達和低表達的MT-3的質粒（購買自廣州銳博生物有限公司）12μl于100μl無血清的培養(yǎng)基中混勻，5 min后兩者混勻20 min，然后加入1 800μl的無血清培養(yǎng)基，48 h后提取RNA進行檢測。過表達和低表達的MT-3的質粒MT-3序列合成于廣州銳博生物公司，相應的對照組為該段序列的無意替換。MT-3和U6的引物序列前面已經(jīng)提及。

1.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）

提取血清蛋白，運用碧云天蛋白試劑盒提取組織蛋白。用BCA進行定量。按照A液∶B液以50∶

1的比例進行配置BCA溶液。取收集的細胞上清2μl，加入18μl PBS，200μl AB混合液。將所有蛋白樣品用補足液調至等濃度，同時加入5X的溴酚藍，占比總體積的1/5。上樣前將膠板下的氣泡趕走，所有蛋白樣品調至等濃度后上樣，蛋白上樣量保證在一定濃度上進行，同時加入6μl蛋白marker。以初始電壓為80V跑濃縮膠，然后升至120 V跑分離膠。在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結束。浸泡PVDF膜：將PVDF膜泡在甲醇中5 min。恒流250 mA，90 min，然后將膜從電轉槽中取出，TBST稍加漂洗，5%脫脂牛奶封閉液中緩慢搖蕩1 h。TBST稍加漂洗，一抗孵育過夜，第2天將其放在常溫復溫40 min，然后TBST漂洗膜3次，每次5 min。根據(jù)一抗來源選擇二抗，室溫輕搖1 h。二抗孵育結束后，用TBST漂洗膜3次，每次5 min。對洗后的PVDF膜發(fā)光顯影，用ECL發(fā)光液進行發(fā)光顯影，配置方法為A液∶B液1∶1進行配置，進行發(fā)光顯影。

1.5 免疫熒光檢測

組織經(jīng)過固定后，蔗糖梯度脫水，冷凍切片，切片厚度為6μm，高溫修復5 min，待其冷卻后，PBS洗滌（3次，每次5 min），10%BSA封閉50 min，加入pP65抗兔一抗（美國CST公司），二抗兔抗鼠（美國CST公司），然后進行DAPI染色，1∶100（美國Santa公司）。

1.6 統(tǒng)計學方法

用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計學方法采用t檢驗，Pearson相關分析，χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MT-3在食管癌中的表達

PCR檢測食管癌患者組織標本92例及癌旁食管癌組織標本92例，檢測結果發(fā)現(xiàn)MT-3在癌組織中高表達，且與癌旁組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.001）。如圖1所示，檢測結果提示MT-3在食管癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演者重要的角色。

2.2 MT-3激活NF-KB信號通路

本研究成功構建了MT-3過表達和MT-3低表達的2種食管癌TE-1細胞株，圖2A所示為成功構建的MT-3高表達的TE-1細胞系，圖2B所示為成功構建的低表達MT-3的TE-1，在2種細胞株中分別檢測NF-κB中P65和pP65的蛋白表達。如圖2C所示為高表達MT-3的TE-1，相比于對照組，在P65減少的情況下，pP65表達量增多，細胞入核增多，與低表達MT-3的TE-1比較，當轉入低表達的MT-3時，pP65表達減少，細胞入核減少，所以從過表達和低表達兩方面正反驗證了NF-κB信號處于激活狀態(tài)。

2.3 在MT-3高表達時pP65入核

檢測在TE-1細胞系中加入MT-3重組蛋白后NF-κB信號變化。分別在TE-1細胞系中加入DMSO和MT-3重組蛋白，檢測結果顯示在加入MT-3后pP65入核明顯增多，即NF-κB信號被激活，相反在加入DMSO后，TE-1細胞系中pP65基本沒有入核，NF-κB信號未被激活。見圖3。

圖1 MT-3的表達檢測

圖2 MT-3激活NF-κB信號通路

圖3 MT-3激活NF-κB信號

3 討論

大量的研究證實了MT-3功能異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[9]。有學者通過免疫組織化學檢測MT-3在170例外科手術切除的原發(fā)性肝癌組織及癌旁正常組織表達，發(fā)現(xiàn)較肝癌組織中MT-3的表達顯著高于癌旁正常組織，并與腫瘤級別密切相關。并且有研究[10-12]證實運用MT-3抑制劑可抑制肝癌、肺癌、宮頸癌、前列腺癌及乳腺癌等一系列惡性腫瘤細胞的生長，誘導其分化或凋亡。這些發(fā)現(xiàn)充分說明了MT-3的異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，但是其在食管癌中的作用還未被研究[13]，因此本實驗進一步通過qPCR檢測MT-3在食管癌中的表達，本次研究結果顯示在腫瘤患者中腫瘤組織部位MT-3的表達明顯高于其癌旁組織。

NF-κB是一條經(jīng)典的炎癥信號通路相關因子，參與細胞分裂、增殖及凋亡的調控，對炎癥或者免疫應答等相關的反應進行調節(jié)，NF-κB是一種關鍵性的轉錄因子，也參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)眾多生理活動或病理過程，如神經(jīng)元可塑性、炎癥、突觸傳遞和疼痛。炎癥因子的上調又可以活化其他炎癥細胞因子形成正反饋調節(jié)，最終導致炎癥的泛化[14-15]。NF-κB這個信號通路已被較廣泛的研究，NF-κB pP65蛋白由胞漿向胞核轉移的核定位信號是NF-κB信號通路激活的關鍵點，該信號通路可調控上百個靶基因的轉錄，產(chǎn)生廣泛的生物學效應[16-18]。為了研究NF-κB是否參與了MT-3調控的食管癌發(fā)病機制，本研究成功構建MT-3高表達和低表達的TE-1細胞系，檢測pP65在其中的變化，發(fā)現(xiàn)MT-3高表達時，pP65明顯增多，初步猜測NF-κB這個信號通路被激活，在TE-1中加入重組蛋白MT-3后發(fā)現(xiàn)pP65細胞入核明顯，即肯定NF-κB這一信號通路是由于MT-3高表達而被激活。有研究顯示，在腫瘤發(fā)生后，如果可以有效地控制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應，將有可能阻止脊髓組織的進一步損傷，從而改善預后。筆者猜測MT-3的低表達可能會減輕食管癌患者的病情，當然這種猜測還需更進一步的研究證實。

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（張蕾 編輯）

MT-3 aggravates pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signaling passway

Hai-jun Wang1,Xin Lu2,Yan-fen Zhang1,Ju-liang Liu1,Yong-qiang Han1
(1.Department of Thoracic Surgery;2.Department of Hematology,Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University,Xingtai,Hebei 054001,China)

Objective To research the development mechanism of esophageal cancer.Methods Ninety-two cases of esophageal cancer patients treated in Xingtai Pepole's Hospital of Hebei Medical University from July 2009 to February 2011 were selected for the study.MT-3 expression was detected in esophageal cancer tissues and the peri-cancerous tissues.MT-3 overexpression and low-expression cell lines were constructed.The activation state of NF-κB signaling pathway was checked at different levels of MT-3 expression.Then the expressions of P65 and pP65 were tested by Western blot.Immunofluorescence was used to further test whether pP65 was expressed in the nuclei when MT-3 was over-expressed.Results The expression of MT-3 in the tumor tissues was higher than that in the adjacent tissues(P=0.001).A high MT-3 expression esophageal cancer cell line and a low MT-3 expression cell line were successfully constructed.pP65 protein expression was enhanced when MT-3 was over-expressed,but decreased at low MT-3 expression;in contrast,P65 showed the opposite results with significant differences,which

MT-3;NF-κB;esophageal cancer

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.22.005

1005-8982（2016）22-0023-05

2016-04-06

suggested NF-κB signal was activated when MT-3 was over expressed.Immunofluorescence revealed that in MT-3 overexpression cells,more pP65 was expressed in the nuclei,which further supported that MT-3 activated NF-κB signaling pathway.Conclusions MT-3 suppresses the pathological process of esophageal cancer through activation of NF-κB signals.